全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (12) : 1791 - 1798
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 08 - 19; 修回日期 : 2009 - 11 - 27
基金项目 : 上海市农委科技兴农重点攻关项目 [沪农科攻字 (2008) 第 1024号 ] ; 国家 ‘863’项目 ( 2008AA10Z116) ; 上海市
青年科技启明星计划项目 ( 08QH14003 ) ; 上海市科委重点科技攻关项目 ( 08391910400 ) ; 国家基础科学人才培养基金项目
(J0630643)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: huyonghong68@ hotmail1com)
月季 RcHSP1718基因表达提高大肠杆菌对非生物
胁迫的耐性
蒋昌华 1, 2 , 胡永红 1 , 徐健遥 2 , 张　浩 2 , 石金磊 2 , 李　敏 2 , 王雅琼 2 ,
明　凤 23
(1上海植物园 , 上海 200231; 2复旦大学生命科学学院 , 遗传工程国家重点实验室 , 上海 200433)
摘　要 : 月季 RcHSP1718为编码小分子热激蛋白基因 , Southern检测其在月季基因组中为多拷贝存在。
38 ℃ /3 h热激处理后 , 该基因在耐热月季品种 ‘曼海姆宫殿 ’ ( SchlossMannieim)、‘彩虹 ’ (Radio)、‘赌
城 ’ (Las Vegas)、‘梅郎随想曲 ’ (Cap rice de Meiland)、‘小女孩 ’ ( Girl) 中强表达 , 而在不耐热品种
‘新十全 ’ ( KordespiPerfecta)、‘绯扇 ’ (H iogi)、‘莱茵黄金 ’ ( Pfalzer Gold) 中弱表达或不表达 , 表明该基
因与月季耐热性关系密切。为确定月季 RcHSP1718基因功能 , 将其转化 E1coli BL21, 结果表明重组菌株能
正常诱导表达包含 RcHSP1718的融合蛋白 , 并因此提高了重组菌株对高温、低温、高盐、高 pH、重金属、
氧化等非生物胁迫的耐性 , 表明 RcHSP1718参与了上述非生物胁迫的响应。
关键词 : 月季 ; RcHSP1718基因 ; 诱导表达 ; 非生物胁迫
中图分类号 : S 685112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1221791208
The Expression of R cH SP1718 Gene Im prov ing Tolerance to Ab iotic Stress in
Recom b inan t E1coli Cells
J IANG Chang2hua1, 2 , HU Yong2hong1 , XU J ian2yao2 , ZHANG Hao2 , SH I J in2lei2 , L IM in2 , WANG Ya2
qiong2 , and M ING Feng23
(1 Shangha i B otan ical Garden, Shanghai 200231, Ch ina; 2 S tate Key L abora tory of Genetic Engineering, School of L ife Science,
Fudan U niversity, Shanghai 200433, Ch ina)
Abstract: R cHSP1718 is a high temperature (HT) induced exp ressing gene, by RT2PCR and Southern
blot indicate that there are several cop ies of R cHSP1718 in genome DNA of Rosa hybrida L. R cHS P1718 is
more strongly exp ressed in varieties resistant to HT, such as‘SchlossMannieim’, ‘Radio’, ‘Las Vegas’,
‘Cap rice de Meiland’, ‘Girl’, meanwhile weakly or not exp ressed in varieties sensitive to HT, such as
‘KordespiPerfecta’, ‘H iogi’, ‘Pfalzer Gold’. The results indicate that this gene is possibly relative to the
tolerance in R osa hybrida L. to HT. In order to study its possible function, R cHSP1718 gene has been trans2
ferred into Escherich ia coli BL21. Recombinant RcHSP1718 was overexp ressed in the recombinant E1coli cells
which showed imp roved viability under different abiotic stress conditions, such as, high salt concentration,
heavy metal and oxidative stress, as compared with control cultures. Those results would p rovide molecular i2
dentification p rincip le to selecting varieties of R osa hybrida L. with strong tolerance to HT.
Key words: Rosa hybrida L. ; R cHSP1718; induced exp ression; abiotic stress
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
夏季高温常严重制约月季 (R osa hybrida L. ) 生长、发育 , 导致其花芽停止分化 , 病虫害加重。
热激蛋白 ( heat shock p roteins, 简称 HSP) 是生物体在高温、盐渍、干旱、饥饿、重金属离子等
环境胁迫下诱导合成的一类应激蛋白。高温是诱导 HSP合成的主要因素 ( Sun et al. , 2002)。Neta2
Sharir等 (2005) 研究发现热激处理后的番茄叶片可诱导叶绿体 HSP21的合成。水稻 O shsp26为热激
与氧化胁迫所诱导 (Lee & V ierling, 2000)。
分子伴侣 (Molecular chaperones) 是指那些与新生肽链折叠、蛋白质的组装和转运有关的特殊蛋
白质分子。已有许多体外及体内研究表明 , HSP在细胞中起分子伴侣的功能 (W aters et al. , 1996)。
表达水稻 HSP1619 ( Yeh et al. , 1997)、栗子 CsHSP1715 ( Soto et al. , 1999) 的大肠杆菌提高了耐热
性。
姜蕊等 (2006) 将月季耐热品种 ‘曼海姆宫殿 ’与不耐热品种 ‘新十全 ’ (胡永红 等 , 2007;
蒋昌华 等 , 2008a) 在常温及经 38 ℃ /3 h热激下 , 提取嫩叶可溶性总蛋白 , 采取 22D电泳 , 获得
‘曼海姆宫殿 ’热激后特异表达的蛋白质点 , 经肽质谱等分析 , 认定该蛋白质点为小分子热激蛋白。
通过基因克隆获得月季 R cHSP1718全长 cDNA序列 , 共 465 bp ( EF053229) , 包含 154个氨基酸 , 属
细胞质 Ⅰ类 sHSP。在此基础上 , 作者进行了该基因在月季品种中热诱导表达模式以及 RcHSP1718对
多种非生物胁迫响应的研究。
1　材料与方法
111　材料
于 2005年 5月上旬 , 在上海植物园月季园内选取耐热月季品种 ‘曼海姆宫殿 ’ ( Schloss Man2
nieim , SM )、‘彩虹 ’ (Radio, RA )、‘赌城 ’ (Las Vegas, LA )、‘梅郎随想曲 ’ (Cap rice de Mei2
land, ME)、‘小女孩 ’ ( Girl, GI) ; 不耐热品种 ‘新十全 ’ ( KordespiPerfecta, KP)、‘绯扇 ’ (H iogi,
H I)、‘莱茵黄金 ’ ( Pfalzer Gold, GO ) (依据上海植物园物候记录 , 数据未显示 )。供试材料均为 2
年生盆栽苗。
112　Southern杂交检测 R cHSP1718基因拷贝数
采用改进的 CTAB法 , 大量提取 ‘曼海姆宫殿 ’基因组 DNA, 各取 15μg基因组 DNA分别用限
制性内切酶 D raⅠ和 B glⅡ进行单酶切 , 以该基因中 251 bp的同源克隆片段 DNA作探针 , Southern杂
交参照 Amersham B iosciences试剂盒 (RPN3540) 说明书进行。
113　温度胁迫诱导 R cHSP1718基因表达模式
将耐热月季品种和不耐热品种均进行高温 38 ℃ /3 h处理 , 取其嫩叶为材料 , 采用植物 RNAout
试剂盒 (天泽基因工程有限公司 ) 提取 RNA, 应用 PrimeScrip tTM RT Reagent Kit ( TaKaRa) 合成
cDNA第 1 链。依据 R cHS P1718 的 ORF 5′与 3′端序列分别设计正向引物 : 5′2ATGTCGCTTATC2
CCAAATTT23′; 反向引物 : 5′2TTACCCAGAAATTTCAAT23′。PCR程序为 : 94 ℃预变性 4 m in; 94 ℃
变性 40 s, 55 ℃复性 40 s, 72 ℃延伸 1 m in, 30个循环 ; 最后 72 ℃延伸 10 m in。以常温下材料作对
照。
114　R cHSP1718基因原核表达
11411　原核表达载体构建 　
根据 R cHSP1718的 ORF两端序列分别设计带接头的引物 , 正向引物引入 SacⅠ酶切位点 , 反向
引物引入 S a lⅠ酶切位点。以 cDNA为模板 , 相同的程序进行 PCR扩增。PCR产物与 pET32a分别进
行 SacⅠ、Sa lⅠ双酶切。回收酶切产物 , T4连接酶连接构建重组载体 pET32a2RcHSP1718。连接产物
转化 E1coli DH5α, 测序证明插入的 R cHS P1718 cDNA序列正确 , 无移码发生。提取重组质粒 pET32a2
RcHSP1718及 pET32a (空载 ) 转化 E1coli BL21, 阳性重组菌株于 - 80 ℃保存备用。
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　12期 蒋昌华等 : 月季 RcHSP1718基因表达提高大肠杆菌对非生物胁迫的耐性 　
11412　大肠杆菌生长曲线制作 　
将两个阳性克隆 BL21菌株接种于 LB (含 Amp 100 mg·L - 1 ) 液体培养基 , 37 ℃、180 r·m in - 1
摇菌过夜 ; 以 1%的接种量放大培养 , 每隔 1 h检测菌液 OD600 , 3次重复。
11413　SDS2PAGE检测融合蛋白诱导表达 　
将 1%放大培养的菌液于 37 ℃、220 r·m in - 1继续培养至 OD600达 016, 加入 IPTG (终浓度为 1
mmol·L - 1 ) 继续诱导培养 , 分别于 0、015、1、2 h取样 , 用于提取蛋白。10 000 r·m in - 1离心 10
m in沉淀菌体 , 以菌体裂解液重悬菌体 , 激烈振荡数次 ; 12 000 r·m in - 1、4 ℃离心 10 m in, 上清液
即为蛋白提取液 ; 以 G250法检测蛋白 OD595 , 以牛血清蛋白标准曲线计算蛋白浓度 ; 加入上样缓冲
液 , 沸水变性 5 m in, 冰上冷却 , 各样品上样量均为 6μg; 1215% SDS2PAGE凝胶电泳检测。
11414　W estern印迹检测融合蛋白诱导表达 　
IPTG诱导培养 , 分别于 0、015、1、2、3、4、5、6和 7 h取样。
同时将诱导培养 2 h、OD600达 110的菌液转至 50 ℃继续诱导培养 , 并于 0、015、1、2、3、4和
5 h分别取样。
提取菌体蛋白 , 一抗为抗 H is特异抗体 , 二抗为带辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG。
115　重组菌株 BL21对多种非生物胁迫抗性分析
11511　重组菌株 BL21对温度抗性分析 　
取 1 mL经 IPTG诱导培养 2 h、OD600达 110的菌液 , 4 500 r·m in - 1离心 5 m in沉淀菌体 , 等体积
无菌水重悬菌体 (OD600达 110时 1 mL菌液含有 109个细胞 ) ; 取 100μL重悬菌液稀释至 1 mL, 混匀
后再从中取 100μL菌液稀释至 1 mL, 如此依次稀释到第 6级 (每毫升 103个细胞 ) ; 取 100μL菌液
涂布在 LB (含 Amp 100 mg·L - 1 ) 板上 ; 4 ℃分别暗培养 0、2、4、6、8和 12 d后转至 37 ℃过夜培
养 , 计算各板的菌落数。
同时将 IPTG诱导 2 h、OD600达 110的菌液转至 50 ℃高温胁迫下继续诱导培养 , 并于 1、2、3、
4、5 h各取 1 mL菌液 ; 沉淀菌体后依其 OD600的值按比例加入无菌水重悬菌体 , 至各样品的 OD600均
为 110; 依次稀释、涂板 , 37 ℃过夜培养 , 计算各板的菌落数。3次重复。
11512　重组菌株 BL21对其它胁迫的抗性分析 　
将含有 pET32a2RcHSP1718 (H1、H2, 平行样 )、pET32a ( EV ) 的 BL21重组菌株经 IPTG诱导
培养 2 h至 OD600达 110, 野生型 BL21 (W T) 菌株于 LB培养基中诱导培养作平行对照。4 500 r·
m in - 1离心 5 m in, 无菌水重悬菌体 , 调 0D600至 110。
用接种环取菌液在含有不同抗性的 LB板上由里向外划 “Z”线涂布 , 37 ℃过夜培养 , 观察菌落
生长势 ; 固体 LB中分别加入下列试剂以制作不同抗性的 LB板 : ① 100、200、300、500 mmol·L - 1
L iCl; ② 400、600、800、1 000 mmol·L - 1 NaCl; ③ 20、24 mmol·L - 1 Na2 CO3 ; ④ 200、600、800、
1 000 mmol·L - 1 CdCl2 ; ⑤ 180、200μmol·L - 1 H2 O2。
2　结果与分析
211　Southern杂交检测
以限制性内切酶 D raⅠ和 B glⅡ分别对 ‘曼海姆
宫殿’基因组 DNA 进行酶切 , 两个酶切产物的
Southern blot结果均显示 RcHSP1718在基因组中为
多拷贝存在 , 表明该基因为多家族基因 (图 1)。
图 1　Southern blot检测 RcHSP1718在月季基因中的拷贝数
Fig. 1　Southern blot analysis of RcHSP1718 in genome of Rosa
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212　月季 R cH SP1718基因温度诱导表达模式
RT2PCR研究结果显示 , 常温 (25 ℃) 下各品种 R cHSP1718基因均不表达 , 高温 (38 ℃) 热激
条件下耐热品种 SM、RA、LA、ME、GI为强表达 , 不耐热品种 KP、GO为弱表达 , H I不表达 (图
2)。表明该基因在月季品种中的热诱导表达模式存在普遍性。
图 2　RT2PCR检测月季品种 RcHSP1718热激诱导表达
NT. 常温 ; HT. 高温。H I. ‘绯扇’; ME. ‘梅郎随想曲’;
GO. ‘莱茵黄金’; RA. ‘彩虹’; LA. ‘赌城’; GI. ‘小女孩’;
KP. ‘新十全’; SM. ‘曼海姆宫殿’。
F ig. 2　RT2PCR test for expression of RcH SP1718 in var ieties
of Rosa hybrida L. under d ifferen t tem pera ture trea tm en t
NT. Normal temperature; HT. H igh temperature. H I. H iogi;
ME. Cap rice de Meiland; GO. Pfalzer Gold; RA. Radio;
LA. Las Vegas; GI. Girl; KP. KordespiPerfecta;
SM. SchlossMannieim.
213　R cHSP1718基因原核表达
21311　大肠杆菌生长曲线 　
图 3显示 , 含有 pET32a、pET32a2RcHSP1718的重组菌株 BL21在 37 ℃条件下培养 , 生长曲线均
呈现典型的 “S”形 , 两者基本重叠 , 表明 R cHSP1718转入并不影响重组大肠杆菌 BL21的正常生长 ,
在后续胁迫试验中重组菌株表现更强的耐受性正是由于它过表达了月季 RcHSP1718蛋白所致。
图 3　大肠杆菌转 pET32a2RcHSP1718菌株与转空载菌株
的生长曲线
F ig. 3　The growth curve of tran sgen ic and em pty vector E1coli
stra in under culture of norma l cond ition
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　12期 蒋昌华等 : 月季 RcHSP1718基因表达提高大肠杆菌对非生物胁迫的耐性 　
21312　R cHSP1718在 E1coli中的诱导表达 　
SDS2PAGE凝胶电泳检测结果 (图 4 ) 显示 , 重组菌株 BL21 ( pET32a2RcHSP1718 ) 经 IPTG
诱导 015 h就能检测到分子量约 3916 kD的特异条带 , 表明重组菌株能正常表达含 RcHSP1718的
融合蛋白 (含一段载体多肽序列和 6个组氨酸 ) , 而对照菌株 BL21 (pET32a, EV ) 未能表达此融
合蛋白。融合蛋白的表达量随诱导时间延长并无明显增加 , 为表达量稳定起见 , 以下试验的诱导
时间均定为 2 h。
图 4　SD S2PAGE检测大肠杆菌中 RcHSP1718融合蛋白的表达
F ig. 4　SD S2PAGE ana lysis of E1coli BL21 harbor in pla sm id pET32a2RcHSP1718
为进一步验证 pET32a2RcHSP1718重组菌株诱导表达的融合蛋白是否为目标蛋白 , 以及在常温
与高温下其融合蛋白的表达模式 , 使用抗组氨酸 ( H is) 特异抗体进行了 W estern blo t印迹分析
(图 5)。
37 ℃条件下 , IPTG诱导 015、1、2、3、4、5、6和 7 h重组菌株 (pET32a2RcHSP1718) 均能表
达目标蛋白 , 但 6 h后其表达量已开始下降。
50 ℃高温条件下 , IPTG诱导 015、1、2、3、4和 5 h也均有目标蛋白表达 , 且表达量略高于前
者。而对照转空载菌株未能表达该融合蛋白。
表明在不同温度条件下 IPTG均能诱导重组菌株表达目标蛋白 , 为提高重组菌株对多种胁迫的抗
性提供了依据。
214　重组菌株对高温与低温的抗性分析
50 ℃高温下 , 随时间延长 , 重组菌株的菌落数均急剧减少 , 但重组菌株 (pET32a2RcHSP1718)
减少相对缓慢 , 1 h后存活率为 7019% , 5 h尚有 415%存活。而对照转空载菌株热激 1 h后存活率下
降至 1119% , 4 h已无菌落长出 , 全部死亡。从菌落存活率上看 , RcHS P1718表达明显提高了重组菌
株 E1coli BL21对高温胁迫的耐性 (图 6, A)。
4 ℃低温胁迫 2、4、6、8和 12 d后计算菌落生长数量结果发现 , 随着胁迫时间延长 , 两个重组
菌株的菌落数均不断减少 , 但重组菌株 ( pET32a2RcHSP1718) 的菌落数减少明显慢于转空载对照 ,
至 12 d后者的菌落数降至 33% , 而前者尚能保持到 65% , 表明 R cHSP1718表达明显提高了重组菌株
E1coli BL21对低温胁迫的耐性 (图 6, B)。
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215　重组菌株对其它非生物胁迫的抗性
图 7显示 , 低浓度 L iCl对野生型 (W T)、转空载 ( EV ) 及转 R cHSP1718基因的 (H1; H2两个
重复 ) 4个菌株生长抑制不明显 , 当 L iCl浓度达到 300 mmol·L - 1时 , H1、H2生长约 40% , W T、
图 7　多种胁迫下大肠杆菌活力检测
F ig. 7　 V iab ility a ssay of E1coli under var ious stresses
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　12期 蒋昌华等 : 月季 RcHSP1718基因表达提高大肠杆菌对非生物胁迫的耐性 　
EV小于 10% ; 800 mmol·L - 1 CdCl2严重抑制了 W T、EV的生长 , 而 H1、H2生长被抑制程度较轻 ,
菌落能长到平皿边沿 , 但数量较少 ; 当 NaCl浓度上升到 800 mmol·L - 1时 , H1与 H2尚能长出较少
菌落 , 而 W T与 EV的生长被完全抑制 ; Na2 CO3浓度为 20 mmol·L - 1时 , H1与 H2能长到平皿的边
沿 , 约为正常的 50% , 而 W T与 EV的生长明显被抑制 , 低于 20% ; 200μmol·L - 1 H2 O2对 4个菌株
生长抑制存在明显差异 , W T、EV只在起始位置长出一些菌落 , 少于 20% , 而 H1、H2能长至平皿
边沿 , 约高达 80%。
上述试验结果表明 , 重组菌株 (pET32a2RcHSP1718) 由于诱导表达了 RcHSP1718的融合蛋白 ,
RcHSP1718的大量积累明显提高了宿主大肠杆菌 BL21对高盐、高 pH、重金属、氧化等非生物胁迫
的抗性 , 月季 RcHSP1718能响应多种非生物胁迫。
3　讨论
大多数小分子热激蛋白 ( sHSP) 为胁迫诱导表达 ( Sun et al. , 2002) , 较少为组成型表达 , 也不
存在组织特异性。月季 R cHSP1718为热激诱导表达基因 , 这与番茄叶绿体 HSP21 (Neta2Sharir et al. ,
2005) 及水稻 O shsp26 (Lee & V ierling, 2000) 的热激诱导表达模式相一致。但在高温胁迫条件下 ,
R cHSP1718只在耐热月季品种中强表达 , 而在不耐热品种中弱表达甚至不表达 , 该基因的表达与否与
月季品种的田间耐热性差异观察结果 (胡永红 等 , 2007; 蒋昌华 等 , 2008b) 相吻合。
过表达栗子 CsHSP1715的大肠杆菌重组菌株提高了对高温、低温的胁迫耐性 , 认为 CsHSP1715
行使分子伴侣功能 , 提高了大肠杆菌细胞膜的稳定性 , 从而提高了重组菌株在胁迫条件下的存活率
( Soto et al. , 1999)。为了研究月季 R cHSP1718的功能 , 作者将其转入 E1coli BL21, 结果显示重组菌
株较对照菌株提高了对高温、低温的胁迫耐性 , 同时也提高了对高盐、高 pH、重金属、氧化等非生
物胁迫的抗性。由于在热激条件下大肠杆菌并不合成细胞质 Ⅰ类 sHSP ( Yeh et al. , 1997)。因此 ,
认为大肠杆菌对多种胁迫抗性的提高与月季 R cHSP1718基因表达直接相关。
sHSP在生物体遭受胁迫刺激时起分子伴侣作用 (BÊsl et al. , 2006; Goloubinoff & de Los R ios,
2007) , 其作用方式是通过疏水相互作用结合变性蛋白 , 稳定并阻止变性蛋白的集聚 , 以便其后变性
蛋白通过 ATP依赖的分子伴侣 HSP70 ( Ehrnsperger et al. , 1997; Lee & V ierling, 2000; Sung et al. ,
2001)、HSP60 (Bukau & Horwich, 1998)、HSP100 ( Yang et al. , 2006) 等进行再折叠 , 从而使蛋白
恢复活性 , 行使正常功能 (Mogk et al. , 2003)。月季 RcHSP1718在遭受胁迫刺激的机体细胞内同样
行使分子伴侣功能 , 因此 , 它的积累赋予了 E1coli BL21重组菌株对温度及其它非生物胁迫的耐受性。
RcHSP1718重组酵母提高了多种非生物胁迫抗性 ; 将该基因导入拟南芥、烟草也提高了转基因株系
对上述多种非生物胁迫的耐受性 (J iang et al. , 2009; 李敏 等 , 2009) , 表明月季 RcHSP1718可参与
多种非生物胁迫响应 , 为后续该基因导入不耐热月季品种提高月季耐热品质及其机理的深入研究提供
了思路 , 也为月季等园林观赏植物的耐热品种筛选提供了理论支持。
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