全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（10）：2005–2009 http：// www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail：yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–07–25；修回日期：2011–10–08
基金项目：国家自然科学基金项目（30860163）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhongkai99@sina.com；Tel：0871-5183204）
侵染水鬼蕉和花朱顶红的番茄斑萎病毒属病毒
的电镜和 DAS-ELISA 诊断
方 琦 1,2，董家红 1,2，丁 铭 1,2，尹跃艳 2，张丽珍 1,2，李婷婷 1,2，苏晓霞 1,2，
李 展 1,2，张仲凯 1,2,*
（1 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆明 650223；2 云南省农业生物技术重点实验室，昆明 650223）
摘 要：从昆明市郊区采集到呈同心圆褪绿环斑、褐色枯斑症状的水鬼蕉［Hymenocallis littoraris
（Jacq.）Salisb.］和花朱顶红［Hippeastrum vittatum（L’Hér.）Herb.］植株，采用电子显微镜技术和 DAS-ELISA
进行检测，在水鬼蕉和花朱顶红病叶分离物 SGJ-KM 和 ZDH-KM 的粗汁液和超薄切片中均观察到有类似
番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒粒体存在，该病毒粒子为球形，直径 80 ~ 85 nm；病叶汁液与 Tospovirus
中的西瓜银色斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）/花生芽坏死病毒（Groundnut bud necrosis
virus，GBNV）的复合抗血清呈阳性反应。通过形态学及血清学方法检测表明，侵染水鬼蕉和花朱顶红的
病毒分离物 SGJ-KM 和 ZDH-KM 为 Tospovirus 的病毒分离物。
关键词：水鬼蕉；花朱顶红；粒子形态；番茄斑萎病毒属；DAS-ELISA
中图分类号：S 682 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）10-2005-05

DAS-ELISA and Electron Microscopic Diagnosis of Tospoviruses Infecting
Hymenocallis littoraris and Hippeastrum vittatum in Kunming
FANG Qi1,2，DONG Jia-hong1,2，DING Ming1,2，YIN Yue-yan2，ZHANG Li-zhen1,2，LI Ting-ting1,2，
SU Xiao-xia 1,2，LI Zhan 1,2，and ZHANG Zhong-kai1,2,*
（1Institute of Biotechnology and Germplasm Resources，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650223，
China；2Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Yunnan Province，Kunming 650223，China）
Abstract：The leaves of Hymenocallis littoraris（Jacq.）Salisb. and Hippeastrum vittatum（L’Hér.）
Herb.，showing concentric chlorotic ring spot and brown lethal spot symptoms，were collected in Kunming.
To confirm the presence of virus，the SGJ-KM and ZDH-KM infected leaves of H. littoraris and H.
vittatum were detected by electron microscope observation and DAS-ELISA. Virions with a diameter of
about 80–85 nm，similar in size to Tospovirus particles，were observed in the crude extracts and ultrathin
sections of diseased leaves of H. littoraris and H. vittatum. The sap of diseased leaves had a positive
reaction to the compound antibody of Watermelon silver mottle virus，WSMoV / Groundnut bud necrosis
virus，GBNV. These results confirmed that H. littoraris and H. vittatum were infected by Tospoviruses.
Key words：Hymenocallis littoraris；Hippeastrum vittatum；morphology；Tospovirus；DAS-ELISA

2006 园 艺 学 报 38 卷
水鬼蕉［Hymenocallis littoraris（Jacq.）Salisb. ］和花朱顶红［Hippeastrum vittatum（L’Hér.）
Herb.］分别属于石蒜科的水鬼蕉属和朱顶红属，属多年生草本植物，具有顶生伞形花序，主要作为
庭院绿化或盆栽观赏，具有一定的经济价值和药用价值（邢福武，2009）。水鬼蕉分布于美洲温暖地
区及中国海南，世界上约有 50 个种，中国有 1 种。朱顶红主要分布于美洲和亚洲的热带地区，约有
75 个种，中国引种栽培的有 2 种：朱顶红和花朱顶红（钱啸虎 等，1985）。
刘雅婷等（2009）通过 RT-PCR 扩增及序列对比分析，检测到了被番茄斑萎病毒属（Tospovirus）
病毒侵染的水鬼蕉植株。但未见 Tospovirus 病毒侵染花朱顶红植株的报道。自 2007 年以来先后在昆
明市郊区发现有感病的水鬼蕉和花朱顶红植株存在，通过观察发现感病后的水鬼蕉和花朱顶红植株
矮化，出现叶片皱缩和坏死的系统症状，花朵变小，甚至不开花，并且两种植株叶片上均出现了同
心圆褪绿环斑、褐色枯斑症状，这些症状与 Tospovirus 病毒侵染寄主所引起的症状（张仲凯 等，2004）
相似。本研究中应用电子显微镜负染色法、超薄切片技术和 DAS-ELISA 对侵染水鬼蕉和花朱顶红
的病株分离物进行了检测。
1 材料与方法
1.1 供试材料
样品采自海拔约 1 900 m 的云南省昆明市郊区。病毒侵染的花朱顶红发病初期叶片局部褪绿，
出现不规则蚀刻斑，中期病斑形成黄绿相间的同心圆环斑，后期变为褐色不规则坏死斑。病毒侵染
的水鬼蕉与花朱顶红的病株症状相似，略有不同的是同心圆环斑比花朱顶红的环斑较大，并且圈的
层数较多。两种病株共同的典型症状表现为叶片上都具有同心圆褪绿环斑、褐色枯斑（图 1）。病株
分离物分别命名为 SGJ-KM 和 ZDH-KM，病株采集后种植于防虫温室内保存。
图 1 水鬼蕉（A）和花朱顶红（B）感染叶片症状
Fig. 1 Symptoms of the diseased leaves from H. littoraris（A）and H. vittatum（B）

1.2 检测方法
1.2.1 负染色电镜观察
取具有典型症状的同心圆褪绿环斑、褐色枯斑的病叶，将少量感病组织加入等体积的 ddH2O 后，

10 期 方 琦等：侵染水鬼蕉和花朱顶红的番茄斑萎病毒属病毒的电镜和 DAS-ELISA 诊断 2007

充分研磨至匀浆，用覆盖 Formvar 膜的铜网蘸取粗汁液，直接用 2%钼酸铵负染色，置于 JEM-100CX
Ⅱ型透射电镜下观察病毒粒体形态特征（张仲凯和李毅，2001）。
1.2.2 超薄切片电镜观察
取少量感病植株叶片组织切成 1 mm2 大小，浸入 3%戊二醛固定液中 4 h，取出后用 0.2 mol · L-1
磷酸缓冲液（pH 7.2）漂洗，再用 1%四氧化锇（OsO4）固定 1.5 h，取出后用 0.2 mol · L-1 磷酸缓冲
液（pH 7.2）漂洗，乙醇系列脱水，环氧树脂 Epon812 包埋，超薄切片机切片。样品经 1%醋酸双氧
铀和 5%柠檬酸铅双染色，在 JEM-100CX Ⅱ型透射电镜下观察细胞内病毒粒体形态及分布，并与相
关植物病毒属病毒粒子的特征（方琦 等，2008）进行比较。
1.2.3 DAS-ELISA 检测
根据电镜检测病毒粒子形态特征的结果，两个病毒分离物 SGJ-KM 和 ZDH-KM 为番茄斑萎病
毒属（Tospovirus）的成员。因此，选择了由美国 Agdia 公司生产的番茄斑萎病毒属的 4 组病毒抗血
清：番茄斑萎病毒（TSWV，血清组Ⅰ）、花生环斑病毒（GRSV，血清组Ⅱ）和番茄褪绿斑病毒（TCSV，
血清组Ⅱ）、凤仙花坏死斑病毒（INSV，血清组Ⅲ）、花生芽坏死病毒（GBNV，血清组Ⅳ）和西瓜
银色斑驳病毒（WSMoV，血清组Ⅳ）。参照 ELISA 试剂盒说明书，采用 DAS-ELISA 方法进行病毒
检测。
2 结果与分析
2.1 电镜负染色观察
感病植株病叶分离物 SGJ-KM 和 ZDH-KM 经负染色制样后电镜观察发现，在两种不同样品中
均含有典型的球形病毒粒体，病毒粒子直径 80 ~ 85 nm，病样粗汁液中未检测到其它形态的病毒粒
体（图 2）。

图 2 水鬼蕉分离物 SGJ-KM（A）和花朱顶红分离物 ZDH-KM（B）中的病毒粒子
Fig. 2 Virions of isolates from SGJ-KM（A）and ZDH-KM（B）in sap of the diseased leaves of H. littoraris and H. vittatum

2.2 超薄切片电镜观察
两种样品超薄切片后电镜观察均发现含有典型球形病毒颗粒，病毒粒子具包膜，直径 80 ~ 85 nm，
其形态与报道的 Tospovirus 病毒粒子相似；病株细胞的叶绿体、线粒体等亚细胞结构大多消失，只
有细胞核还比较完整。其中，水鬼蕉样品中多个病毒粒子成簇状聚集于内质网囊泡内，花朱顶红样
品中病毒粒子呈线状排列于细胞质中（图 3）。

2008 园 艺 学 报 38 卷
图 3 水鬼蕉分离物 SGJ-KM（A）和花朱顶红分离物 ZDH-KM（B）细胞中的病毒粒子
Fig. 3 Virions of isolates existed in cells of SGJ-KM（A）and ZDH-KM（B）from H. littoraris and H. vittatum
2.3 DAS-ELISA 检测
应用 Tospovirus 4 个血清组病毒抗体检测发现，2 个分离物与 WSMoV/GBNV 的抗血清均呈阳
性反应，而与其他 3 个血清组病毒的抗血清呈阴性反应，因此从昆明郊区水鬼蕉和花朱顶红病株中
检测到的 Tospovirus 病毒，可初步判定属于血清组Ⅳ（表 1）。

表 1 水鬼蕉（SGJ-KM）和花朱顶红（ZDH-KM）病叶分离物与 Tospovirus 属中 4 组病毒抗血清的反应
Table 1 Reactions of crude isolates of SGJ-KM and ZDH-KM from H. littoraris and H. vittatum，respectively in
DAS-ELISA with Tospovirus serogroupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ
分解物
Isolate
血清组Ⅰ
Serogroup Ⅰ TSWV
血清组Ⅱ
SerogroupⅡ GRSV/TCSV
血清组Ⅲ
Serogroup Ⅲ INSV
血清组Ⅳ
SerogroupⅣ
WSMoV/GBNV
SGJ-KM – – – +
ZDH-KM – – – +
注：“+”为阳性反应，“–”为阴性反应。
Note：“+”and“–”represent positive reaction and negative reaction，respectively.
3 讨论
本试验中通过感病植株症状观察、病毒粒体形态及细胞病理电镜观察分析、DAS-ELISA 检测发
现 Tospovirus 病毒可侵染石蒜科水鬼蕉［H. littoraris（Jacq.）Salisb. ］和花朱顶红［H. vittatum（L’hér.）
Herb. ］植株。
从感病植株的叶片表现为同心圆褪绿环斑、褐色枯斑来看，具有 Tospovirus 病毒侵染引起的典
型症状特征。Tospovirus 病毒的病毒粒子具有包膜，粒子直径 80 ~ 120 nm，外包裹双层脂膜，形成
于寄主细胞内质网池，成簇状，能用电镜技术较快速准确地检测这类病毒（张仲凯 等，2000；Fauquet
et al.，2005）。病叶电镜负染色及超薄切片中仅观察到样品中有类似 Tospovirus 病毒粒子的球状病毒，
未检测到其他形状的病毒粒体存在，可排除其他病毒侵染的可能性。在病毒侵染的水鬼蕉和花朱顶
红叶片的超薄切片中，通过电镜观察到水鬼蕉中病毒粒体呈簇状排列在内质网池中，花朱顶红样品
中病毒粒子呈线状排列于细胞质中，具有 Tospovirus 病毒典型的粒子形态特征和细胞病理特征。
Tospovirus 病毒是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）中唯一可以侵染植物的病毒，根据国际病毒分
类委员会（ICTV）第 8 次报告分类标准，该属包括 8 个确定种和 6 个暂定种，近几年又有一些新种
被陆续报道，目前已报道了 22 种（Fauquet et al.，2005；Hassani-Mehraban et al.，2010；de Oliveira
10 期 方 琦等：侵染水鬼蕉和花朱顶红的番茄斑萎病毒属病毒的电镜和 DAS-ELISA 诊断 2009

et al.，2011）。根据 Tospovirus 病毒的 N 蛋白的血清学相关性，把已报道的该属病毒分为 4 个血清组，
与西瓜银色斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）具有血清学相关性的病毒分属于
WSMoV 血清组或血清组Ⅳ。本研究中从水鬼蕉和花朱顶红上分离到的 Tospovirus 病毒分离物与
WSMoV 血清组的 WSMoV/GBNV 复合抗体成阳性反应，证明了 SGJ-KM 和 ZDH-KM 两个病毒分
离物属于 WSMoV 血清组成员。
病毒分离物的具体种类仍需要进一步对病毒核壳体蛋白（nucleocapsid protein）基因进行测序分
析后才能确定。

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