全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 4 2010 37 5 801 80
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–12–02；修回日期：2010–04–29
基金项目：国家自然科学基金项目（30971977）；北京市自然科学基金项目（6082005）；北京市自然科学基金和北京市教委联合资助重
点项目（KZ200910020001）；北京市属市管高校人才强教计划项目（PXM2007014207）；北京市教委平台建设项目（PXM2009）
积葡萄果实始熟前后 ABA 累关键酶基因
VvNCED1 和VvBG1 转录水平的研究
王延书1, 2，李春丽2，贾海锋2，秦 岭2，高东升1，沈元月2,*
（1山东农业大学园艺科学科学与工程学院，山东泰安 271018；2北京农学院植物科学技术系，北京 102206）
摘 要：以始熟期花后 7 ~ 11 周的‘玫瑰香’葡萄果肉为试材，利用荧光定量 PCR 分析了 VvNCED1
和 VvBG1 基因在 5 个时期的表达量。结果表明，VvNCED1 基因在花后 7 ~ 8 周表达量很高，随后快速降
低至最低值；随着果实着色，表达量略有升高。VvBG1 基因在果实始熟前表达量较低，随着果实始熟启
动和果实着色，表达量基本呈持续升高的趋势。结合果实 ABA 含量在始熟期前后一直升高的结果分析，
认为果实始熟前 ABA 积累归因于 VvNCED1 基因的高水平表达，始熟后 ABA 积累主要归因于 VvBG１基
因的高水平表达。
关键词：葡萄；果实；始熟期；荧光实时定量 PCR；ABA；生物合成
中图分类号：S 663.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）05-0801-04

Studies on Transcriptional Level of VvNCED1 and VvBG1, Two Key Genes
Related to ABA Accumulation Around the Veraison of Grape Berry
Ripening
WANG Yan-shu1, 2, LI Chun-li2, JIA Hai-feng2, QIN Ling2, GAO Dong-sheng1, and SHEN Yuan-yue2,*
（1College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China；
2Plant Science and Technology Department，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）
Abstract: With Hamburg grape mesocarp from berries during 7–11 weeks after flowering, the
expression levels of VvNCED1 and VvBG1 gene were detected through real-time quantitative PCR. The
results showed that the expression level of VvNCED1 gene was very high during 7–8 weeks after
flowering, followed by a rapid decline to its lowest point, and then increased a little. Coupled with the
onset of berry ripening and coloring-up, the mRNA expression of VvBG1 gene, on the whole, increased
continually. Given that the ABA continual rising during the onset of grape berry ripening, it is considered
that, the ABA accumulation is attributed to high mRNA expression level of VvNCED1 before the onset of
berry ripening and high mRNA expression level of VvBG1 after the onset of berry ripening.
Key words：grape；berry；veraison；real-time quantitative PCR；ABA；biosynthesis

前人的研究结果表明，NCED（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase）是 ABA 生物合成的限速酶

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail: sfmn@tom.com）
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（Thompson et al.，2000；Luchi et al.，2001；Qin & Zeevaart，2002； Lefebvre et al.，2006）。控制
ABA 水平在一定程度上可以更直接地调控植物的生长发育（任慧波 等，2007）。因此，果实中 NCED
基因的研究受到了广泛的关注并取得了较大进展（Chernys & Zeevaart，2000；Kato et al.，2006；
Rodrigo et al.，2006；Zhang et al.，2009）。
近年来在拟南芥上首次鉴定了 β–葡萄糖酯酶 AtBG1（β-glucosidase），该酶相应环境和发育信
号能促进游离 ABA 的快速积累，即通过把无活性的结合态 ABA 葡萄糖酯（ABA-GE）直接转化为
有活性游离的 ABA（Lee et al.，2006）。因此，调控该途径 ABA 水平比调控 ABA 合成更直接，更
迅速。然而，关于β–葡萄糖酯酶是否参与果实发育 ABA 积累的调控，NCED 和 BG 哪个基因更重
要，目前还不清楚。本研究中以‘玫瑰香’葡萄始熟期前后果肉为试材，通过 RT-PCR 克隆 VvNCED1
基因和 VvBG1 基因片段，设计荧光引物，通过荧光实时定量 PCR 技术研究葡萄果实始熟前后 ABA
积累控酶基因的转录水平，为从分子水平控制葡萄果实中 ABA 含量奠定研究基础。
1 材料与方法
以玫瑰香葡萄（Vitis vinifera L.‘Muscat Hamburg’）果实为材料，采收自北京农学院葡萄种质
资源圃。2008 年围绕始熟期（花后 9 周）分别在开花后 7 ~ 11 周采收取样，液氮速冻于-80 ℃冰箱
保存备用。大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α感受态细胞为天根公司提供，LA Taq酶和PMD-19T
载体均为大连宝生公司提供。
ABA 含量的测定参照 Peng 等（2006）的方法。果实 RNA 提取采用改良 CTAB 法和 RNA 快速
提取试剂盒相结合的方法。用上海生工生物工程有限服务公司的 cDNA 反转录试剂盒进行反转录。
Real Time RT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒（TaKaRa DRR041S），PCR仪型号为BIO-RAD
iQ5 荧光定量PCR仪，反应总体积 20 µL，包括SYBR Green PCR混合试剂 10 µL，cDNA模板 2 µL，
正反向引物各 0.4 µL（10 µmol · L-1），用高压灭菌去离子水补足至总体积 20 µL。引物设计VvNCED1
（GenBank accession No. EF625685）：上游引物 5-CTGAGCCTCTGTTCCTTCC-3，下游引物 5-
TCGTGGCGTTCAC TATCTGC-3 ； VvBG1 （ GenBank accession No ： AY039034 ）：上游引物
5-GGCTTCCTACTCCATCTTTC-3，下游引物 5-GCAGTTTGGTGACAGGGTGA-3；Actin：上游引
物 5-AATGTGCCTGCCATGTATGT-3，下游引物 5-GTCCAGCAAGGTCAAGACG-3。PCR程序为
95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s,54 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，71 个循环，最后溶解从 60 ℃到 95 ℃，每个循
环 0.5 ℃ 30 s。试验重复 3 次。
2 结果与分析
2.1 葡萄果实始熟期前后ABA含量的变化
从图 1 中可以看出，在葡萄果实始熟期前
后 ABA 含量呈一直上升趋势，在花后 10 周含
量最高，随后略有下降。
始熟前两周，即花后 7 ~ 8 周果实为深绿
色；花后 9 周变为浅绿色，开始进入始熟；花
后 10 周上色已接近表面的 1/3 ~ 1/2；花后 11
周完全着色，已进入完熟期（图 2）。
图 1 葡萄果实始熟前后 ABA 含量的变化
Fig. 1 Changes in content of ABA during the veraison of
grape berry
5 期 王延书等：葡萄果实始熟前后 ABA 积累关键酶基因 VvNCED1 和 VvBG1 转录水平的研究 803
图 2 葡萄果实始熟期前后果实外观颜色变化
Fig. 2 The color changes of grape berries during the veraison of grape berry
2.2 VvNCED1 基因在始熟前后表达量的变化
VvNCED1 基因表达量在花后 7 ~ 8 周较高；在花后 9 周迅速降至最低值；在花后 10 ~ 11 周又
略有升高，但其值显著低于花后 7 ~ 8 周的表达量（图 3）。
2. 3 VvBG1 基因在始熟前后表达量的变化
VvBG1 基因表达量有两次快速升高的过程：随着果实成熟启动，第 1 次升高发生在花后第 7 ~ 8
周，第 2 次升高发生在花后第 9 ~ 10 周，此次上升强度更大。结合葡萄果实 ABA 含量在始熟期变
化规律，VvBG1 基因表达量的变化显示了同 ABA 类似的变化趋势，即前期低，后期高（图 4）。以
果表明 VvBG1 基因在果实成熟过程中发挥着重要的作用，尤其在果实发育的后期。 上结
图 3 葡萄果实始熟期 VvNCED1 基因表达水平的变化
Fig. 3 Changes of the mRNA expression of VvNCED1 gene
during the veraison of grape berry
图 4 葡萄果实始熟期 VvBG1 基因表达水平的变化
Fig. 4 Changes of the mRNA expression of VvBG1 gene during
the veraison of grape berry
3 讨论
本试验发现玫瑰香葡萄果实在花后 8 周开始进入始熟期，而此期葡萄果实 ABA 含量也同时开
始迅速增加，进一步验证了 ABA 在葡萄果实成熟调控上的关键作用。
利用生物化学和分子生物学在模式植物上的研究表明，NCED（ 9-cis-epoxycarotenoid
dioxygenase）是 ABA 生物合成的限速酶，且 ABA 累积在时间上稍晚于 NCED 基因的诱导，表明
NCED 是操纵干旱诱导 ABA 积累的关键酶（Tan et al.，1997；Thompson et al.，2000；Luchi et al.，
2001）。Zhang 等（2009）在桃和葡萄果实上研究也表明，NCED 基因的表达和 ABA 的积累在时间
上是不对应的：NCED 基因在果实进入始熟前已经开始大量表达，随后 ABA 才开始大量积累，但
果实成熟后期 NCED 基因表达则检测不到。本试验通过实时荧光定量 PCR 技术也发现，NCED 基因
在开花后第 7、8 周表达量很高，ABA 的快速积累从第 8 周后才开始快速增加。

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Lee 等（2006）在拟南芥上首次鉴定了 β-葡萄糖酯酶 AtBG1，该酶能促进活性 ABA 快速积累，
即通过把无活性的结合态 ABA 葡萄糖酯（ABA-GE）直接转化为有活性的游离态 ABA。本研究发
现，葡萄 VvBG1 基因在始熟前期表达量较低，而在果实始熟后期迅速升高，且与葡萄果实始熟后
ABA 变化趋势类似。由于 NCED 基因和 BG 基因从不同的代谢途径促进了 ABA 的积累，因此推测，
在葡萄果实始熟前期 NCED 基因高表达，对 ABA 的积累起着关键的作用；在始熟后期，由于 NCED
基因表达量显著降低，而 BG 基因转录反而快速增加，因此后期果实 ABA 的快速积累主要是由 BG
基因决定的。始熟后期 BG 活化，使大量的无活性的结合态 ABA 葡萄糖酯转化为有活性的游离态
ABA，从而使 ABA 的含量不断增加，促进葡萄果实的成熟。
从生化代谢的能量方面考虑，ABA 合成涉及了一系列复杂的生化代谢反应，玉米黄质开始经一
系列反应到 NCED 催化裂解产生黄质醛后，先被氧化为 ABA 酮，再转化为 ABA 醛，然后生成 ABA。
而 BG 途径合成 ABA 比 NCED 途径要简单的多，可以直接将大量的无活性的结合态 ABA 葡萄糖酯
转化为有活性的游离态 ABA。同合成途径积累 ABA 过程相比，解离途径不但节省了大量的能量，而
且更迅速。因此，葡萄果实进入始熟期后期通过 BG 基因来调控 ABA 的水平，具有重要的生物学意义。

References
Chernys J T，Zeevaart J A D. 2000. Characterrization of the 9-cis-epoxycaroteniod dioxygenase gene family and regulation of abscisic acid
biosynthesis in avocado. Plant Physiol，124：343–353.
Kato M，Matsumoto H，Ikoma Y. 2006. The role of carotenoid cleavage dioxygenases in the regulation of carotenoid profiles during maturation in
citrus fruit. Journal of Experimental Botany，57（10）：2153–2164.
Lee K H，Piao H L，Kim H Y，Choi S M，Jiang F，Hartung W，Hwang I，Kwak J M，Lee I J，Hwang I. 2006. Activation of glucosidase via
stress-induced polymerization rapidly increases active pools of abscisic acid. Cell，126：1109–1120.
Lefebvre V，North H，Frey A，Sotta B，Seo M，Okamoto M，Nambara E，Annie M P. 2006. Functional analysis of Arabodopsis NCED6 and NCED9
genes indicate that ABA synthesized in the endosperm is involved in the induction of seed dormancy. Plant Physiol Biochem，37：341–350.
Luchi S，Kobayashi M，Taji T，Naramoto M，Seki M，Kato T，Tabata S，Kazuko Y S，Shinozaki K. 2001. Regulation of drought tolerance by gene
manipulation of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，a key enzyme in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis. Plant J，27：325–333.
Peng Y B，Zou C，Wang D H，Gong H Q，Xu Z H，Bai S N. 2006. Preferential localization of abscisic acid in primordial and nursing cells of
reproductive organs of Arabidopsis and cucumber. New Phytol，170（3）：459–466.
Qin X Q，Zeevaart J A D. 2002. Overexpression of a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene in Nicotiana plumbaginifolia increases abscisic acid
and phaseic acid levels and enhances drought tolerance. Plant Physiol，128：544–551.
Ren Hui-bo，Fan Yi-juan，Wei Kai-fa，Gao Zhi-hui，Li Gui-fang，Liu Jing，Li Bing-bing，Hu Jian-fang，Jia Wen-suo. 2007. The influence of consistent
induction of NCED3 and the synthesis and metabolism of ABA on the ABA signal accumulation of Arabidopsis. Chinese Science Bulletin，52
（1）：59–66.（in Chinese）
任慧波，范意娟，魏开发，高志晖，李桂芳，刘 静，李冰冰，胡建芳，贾文锁. 2007. NCED3 基因的持续诱导及 ABA 合成与代谢的
协同调控在拟南芥 ABA 信号积累中的作用. 科学通报，52（1）：59–66.
Rodrigo M J，Alquezar B，Zacarias L. 2006. Clonging and characterization of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase genes，differently regulated during
fruit maturation and under stress conditions，from oranges. Journal of Experimental Botany，57（3）：633–643.
Tan B C，Schwartz S H，Zeevaart J A D，Mccarty D R. 1997. Genetic control of abscisic acid biosynthesis in maize. Proc Natl Acad Sci，94：
12235–12240.
Thompson A J，Jackson A C，Parker R A，Morpeth D R，Burbidge A，Taylor I B. 2000. Abscisic acid biosynthesis in tomato： Regulation of zeaxanthin
epoxidase and 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase mRNAs by light/dark cycles，water stress and abscisic acid. Plant Mol Biol，42：833–845.
Zhang M，Leng P，Zhang G L，Li X X. 2009. Clonging and functional analysis of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase（NCED）genes encoding a key
enzyme during abscisic acid biosynthesis from peach and grape fruits. Plant Physiol，166（12）：1241–1252.