全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1191 - 1196
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 25; 修回日期 : 2009 - 07 - 09
基金项目 : 上海市科技兴农重点攻关项目 [沪农科攻字 (2008) 第 1024号 ] ; 国家自然科学基金项目 ( 30570988) ; 国家基础科
学人才培养基金项目 (J0630643) ; 国家教学基地建设中心项目 (J0630643)3 共同第一作者3 3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fm ing@fudan1edu1cn)
月季 Rchsp1718基因转化烟草的非生物胁迫耐性研究
李　敏 1 , 蒋昌华 1, 23 , 胡永红 2 , 张　浩 1 , 王尧峰 1 , 明　凤 13 3
(1 复旦大学生命科学学院 , 遗传工程国家重点实验室 , 植物研究所 , 上海 200433; 2上海植物园 , 上海 200231)
摘 　要 : 为了研究从月季中分离的小分子热激蛋白 Rchsp1718的生理功能 , 把 Rchsp1718的编码框插入
到表达载体 PHB的 35S组成型启动子后面 , 通过农杆菌 GV3101转化烟草 , 获得转基因植株。在高温、干
旱、渗透、高盐胁迫条件下分别检测转基因烟草形态、失水率、电导率、脯氨酸含量及其内外源基因表达
模式。结果显示 : 与对照相比 , 转基因烟草抗性表型明显 , 电导率较低 , 脯氨酸含量大幅度提高 , 失水率
降低 ; P5CS基因的表达量上调 , 说明转 R chsp1718基因烟草苗在高温以及高渗透胁迫下表现出明显的耐受
性。
关键词 : 月季 ; 小分子热激蛋白 ; 非生物胁迫 ; 抗性 ; 生理功能
中图分类号 : S 685112 　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0821191206
Tran sforma tion of Tobacco w ith R chsp1718 from Ch inese Rose Enhances
Tolerance to D ifferen t Ab iotic Stresses
L IM in1 , J IANG Chang2hua1, 23 , HU Yong2hong2 , ZHANG Hao1 , WANG Yao2feng, and M ING Feng13 3
(1 S tate Key L aboratory of Genetic Eng ineering, School of L ife Science, Fudan U niversity, Shanghai 200433, Ch ina; 2 Shanghai
B otan ica l Garden, Shangha i 200231, China)
Abstract: R chsp1718 cloned from Chinese rose belongs to a cytosolic class I sHSP, and it is induced
under different stress. In order to study the physiological function of R chsp1718 , we subcloned the ORF of
R chsp1718 recombined after 35S: p romoter into DH5α, then transformed into p lant gene exp ression vector
Ag roba terium rum efaciens, leaf disc of tobacco was infected by A groba terium and three transformants were
attained. W e assessed the phenotype, relative electrical leakage, p roline content, water lose rate under high
temperature, osmotic stress, and salt stress respectively, and the transcrip t levels of P5CS gene was also
investigated by sem i2quantitative RT2PCR. Results showed that transgenic line showed lower relative electrical
leakage, more p roline content, lower water lose rate, and the exp ressed of P5CS was elevated. Compared
with the non2transgenic lines, transformed ones showed obvious resistance to high temperature and osmotic
stress. The possible mechanism to different abiotic stress was also discussed.
Key words: R osa ch inensis; small heat shock p rotein; abiotic stress; resistance; physiological function
热激蛋白 ( heat shock p roteins, 简称 HSP) 是生物体在高温、盐渍、干旱、渗透胁迫等环境条件
下诱导合成的一类应激蛋白 , 其中小分子热激蛋白 ( sHSP) 在植物体内极其丰富 (W aters et al. ,
1996)。热激蛋白在细胞内起分子伴侣功能 , 参与新生肽链折叠、蛋白质的组装和转运 (Mogk et al. ,
2003; Sangster & Queitsch, 2005; 翁锦周和洪月云 , 2006)。
本实验室采取 22D电泳与肽质谱分析的方法在耐热月季品种 ‘曼海姆宫殿 ’ ( SchlossMannheim )
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中检测到热激后特异表达的小分子热激蛋白 Rchsp1718 (姜蕊 等 , 2006)。基因克隆获得 R chsp1718
的 cDNA序列 , 共 465 bp ( EF053229) , 包含 154个氨基酸 , 属细胞质 Ⅰ类 sHSP。在此基础上 , 用农
杆菌侵染法转化烟草 , 以 CaMV35S启动子驱动 , R chsp1718在转基因烟草中成功表达。转基因植株较
对照组更耐高温胁迫 , 初步断定其提供了一种暂时的保护机制。在月季中首次分离到小分子热激蛋
白 , 为月季生态适应性机制的研究和开拓花卉基因改造奠定了基础。
1　材料与方法
111　材料
盆栽月季 (R osa hybrida L. ) ‘曼海姆宫殿 ’ ( Schloss Mannheim ) 在 25 ℃培养 ; 野生型烟草
(N icotiana tabacum L. ) 品种为百日红 ; 大肠菌 DH5α菌株和 PHB载体均为本实验室保存 ; Taq p lus
购自上海生工生物技术服务有限公司 ; 逆转录试剂盒 PrimeScrip tTM RT Reagent Kit、限制性内切酶、
T4 DNA连接酶等购自 TaKaRa公司 ; 胶回收试剂盒购自申能博采公司 ; Marker DL2000购自天为生物
公司 ; 磺基水杨酸等其他试剂为国产或进口分析纯。
112　植物表达载体构建
采用植物 RNAout试剂盒 (天泽基因工程有限公司 ) 提取 ‘曼海姆宫殿 ’经 38 ℃ /3 h热激处理
后的嫩叶 RNA并采用 PrimeScrip tTM RT Reagent Kit ( TaKaRa) 合成 cDNA第 1链 (蒋昌华 等 , 2008) ;
分别以 R chsp1718 的 ORF设计引物 : 5′2CGGAGCTCATGTCGCTTATCCCAAATTT23′(带 SacⅠ酶切位
点 ) , 5′2CGTCTAGATTACCCAGAAATTTCAATGG23′(带 X baⅠ酶切位点 ) , PCR扩增 , 产物连接到载
体 PHB构建 PHB2R chsp1718植物表达载体。
113　月季 R chsp1718转化烟草并筛选阳性株系
将空载 PHB、重组质粒 PHB 2R chsp1718转化农杆菌 GV3101, 以农杆菌浸染法 (叶盘法 ) 转化烟
草叶片 ; 以潮霉素 (15 mg·L - 1 ) 筛选阳性植株 , 获得 T0代转基因及转空载烟草植株。
参照 《分子克隆实验指南 》 ( Sambrook & Russell, 2001) , 采用 CTAB 法提取阳性株系 PHB2
HSP9、PHB 2HSP14、PHB 2HSP17及转空载株系 ( PHB2EV) 叶片基因组 DNA, PCR检测 PHB载体上
的潮霉素基因 (HPT) , PCR程序为 : 94 ℃ 4 m in; 94 ℃ 40 s; 55 ℃ 40 s; 72 ℃ 1 m in, 30个循环 ;
72 ℃ 10 m in。PCR检测月季 R chsp1718基因 (引物序列见表 1) , 程序同潮霉素基因。PCR产物均以
018%琼脂糖凝胶电泳检测。
114　胁迫处理后转基因株系形态与生理指标检测
选取生长 45 d的 PHB2HSP9及 PHB2EV株系土培盆栽苗 , 分别进行如下处理。① 46 ℃ /2 d高温
处理 ; ② 46 ℃ /2 h 热激 ; ③ 250 mmol·L - 1甘露醇 (Mannitol) 溶液倒灌 7 d渗透胁迫 ; ④ 250
mmol·L - 1 NaCl溶液倒灌 7 d盐胁迫 ; ⑤ 14 d不浇水干旱胁迫。对 ①、③、④处理的材料进行形态观
察并拍照 , 其它处理的材料用于后续试验。
11411　电导率以及叶片失水率测定 　选取 ②、⑤处理后植株相同位置叶片测定相对电导率 (张志
良 , 1990) 和失水率 (高国庆 等 , 1995)。
11412　脯氨酸含量测定 　参照 (Buhl & Stewart, 1983) 作适当改进 , 选取 ③和 ④处理后植株相同位
置叶片剪碎混匀 , 称取 012 g, 加入 215 mL 0103 g·L - 1的磺基水杨酸 , 沸水水浴 10 m in, 冷却后吸
取 1 mL上清液 , 加 1 mL酸性茚三酮 , 1 mL冰乙酸 , 混匀后沸水浴 30 m in, 冷却后加入 4 mL甲苯 ,
充分振荡以萃取红色物质 , 测 OD520。
115　转基因烟草内外源基因表达模式检测
取 ②和 ③处理后的嫩叶片 , 采用 Trizol提取其 RNA (按说明书进行 ) , 合成 cDNA第 1链 (蒋昌
华 等 , 2008) 作 PCR模板 , 分别以表 1中所列引物进行 RT2PCR检测转基因株系 PHB2HSP9内外源
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基因的表达模式 , PCR程序参照 113所述程序。以株系 PHB2EV作对照。
表 1　RT2PCR所用的引物、退火温度与扩增片段长度
Table 1　Pr im ers and its annea ling tem pera ture for RT2PCR and the length of RT2PCR product
基因
Gene
温度 /℃
Temperature
长度 / bp
Length 引物序列 Primer sequence
Rchsp1718 55 465 5′2ATGTCGCTTATCCCAAAT23′( F) ; 5′2CCATTGAAATTTCTGGGTAA23′(R)
P5CS 57 480 5′2CTGTAATGCGATGGAAACCC23′( F) ; 5′2GCACCAAGTCCGAACCTAA23′(R)
Actin 55 600 5′2TACCGTAAGTGTCCTTGTA23′( F) ; 5′2TTCTTAGGATCTTCTCAGT23′(R)
2　结果与分析
211　植物表达载体构建
R chsp1718的 ORF框插入到 SacⅠ和 X baⅠ之间 (图 1)。
212　转基因烟草阳性植株分子鉴定
将月季 R chsp1718 转入烟草 , 经潮霉素筛选后共获得 3个转基因阳性株系 PHB 2HSP9、 PHB2
HSP14、PHB2HSP17及转空载株系 PHB 2EV。对它们的基因组进行 PCR检测 , 图 2显示上述 4个株系
均可检测到 HPT基因 , 表明 PHB载体序列已整合到烟草基因组中 ; 外源基因 Rchsp1718只在 PHB2
HSP9、PHB 2HSP14、PHB 2HSP17基因组中被检测到 , 而 PHB 2EV的基因组未能检测到该基因 , 表明
月季 R chsp1718已整合到烟草阳性植株的基因组中。
213　转基因烟草对高温和渗透胁迫抗性分析
21311　形态变化 　将转基因株系 PHB 2HSP9和转空载体株系 PHB 2EV分别在 46 ℃处理 2 d (图 3) ,
PHB2HSP9株系生长良好 , PHB2EV株系萎蔫致死。甘露醇渗透胁迫处理后 , PHB 2HSP9正常生长 ,
表型无明显变化 , 而 PHB2EV则发生萎蔫 ; 进行 NaCl处理后 , PHB 2HSP9近土壤叶片萎蔫 , 但其他
叶子生长良好 , 而 PHB 2EV全株叶片发黄 (图 4)。以上结果表明 , 转目的基因株系比对照表现了更
强的胁迫耐性。
21312　电导率变化 　图 5显示 , 经过 46 ℃ /2 h高温处理后 , PHB 2HSP9的电导率较 PHB 2EV电导率
低 31%。表明转基因株系降低了细胞膜在胁迫下的渗透性 , 植物电解质的渗漏减少 , 从而保护细胞
的完整性。
21313　脯氨酸含量变化 　图 6结果说明 , 经甘露醇处理后 PHB 2EV的脯氨酸含量与正常情况相比基
本无变化 , 而 PHB2HSP9上升了 3倍 ; 经 NaCl处理后 PHB 2HSP9的脯氨酸含量较正常生长上升几百
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倍。说明转入 R chsp1718后 , 转基因烟草苗在高温及渗透胁迫下脯氨酸含量提高。
21314　转基因烟草高温处理后叶片保水力的变化　对转基因株系和未转化目标基因的株系进行高温
处理 , 分析失水率的改变。转基因株系 PHB 2HSP9较 PHB 2EV的失水率低 1123% ～1147% (图 7)。说
明转基因株系失水的趋势较缓 , 叶片的保水能力较 PHB 2EV强。
214　转基因烟草内外源基因表达模式
P5CS基因受高盐、干旱、ABA、低温等处理的诱导 , 积累的脯氨酸可降低渗透胁迫。图 8显示 ,
转基因烟草在正常、高温及渗透胁迫条件下能检测到 P5CS基因的高表达 , 而 PHB2EV只能检测到该基
因弱表达 , 脯氨酸合成酶表达量提高与脯氨酸含量提高是相对应的 (Verbruggen & Hermans, 2008)。
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3　讨论
对 sHSP17的研究表明 , 热胁迫下 RcHSP17可以降低膜的流动性 , 稳定膜的结构 , 结合变性蛋白
和在分子伴侣介导的再折叠中起作用 ( TÊrÊk et al. , 2001)。另外 sHSP还能和膜脂相互作用 , 被称为
膜脂的分子伴侣 ( Tsvetkova et al. , 2002)。细胞受热后一些大分子蛋白和 sHSP以膜外周蛋白的形式
连接在质膜和液胞膜上 , 阻止膜蛋白的变性 , 对膜微囊有热保护功能 (Balogi et al. , 2005)。转基因
烟草中可能积累大量的 Rchsp1718, 对细胞膜完整性可能起到了如上所述的保护作用。
本研究中转基因株系 PHB2HSP9脯氨酸含量显著提高 , 可能与脯氨酸维持体内蛋白的结构和胞质
pH值 , 使细胞免受损伤 (Verbruggen & Hermans, 2008) 有关。转基因烟草在胁迫条件下 R chsp1718
过表达的同时 , 内源 P5CS基因的表达量也上升 , 这与 Rchsp1718在细胞内广泛的保护、协同作用存
在直接或间接关系 , 但该小分子热激蛋白的作用机理尚有待进一步研究。
转 R chsp1718基因株系 PHB 2HSP17在抗冷胁迫方面表现很突出 , 这与已经报道的研究结果相一
致 (Lopez2Matas et al. , 2004; Kotak et al. , 2007) , 即许多热激蛋白的抗性功能存在交叉。本实验室
正在对该基因的启动子调控元件进行分析 , 为探讨月季小分子热激蛋白的热诱导特性 , 更完整地揭示
R chsp1718功能 , 乃至探讨蔷薇属植物的小分子热激蛋白功能提供理论依据。
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