全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（5）：930–938 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–09–14；修回日期：2011–05–06
基金项目：四川省育种攻关项目（2006YZGG-07-10）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yqw14@sicau.edu.cn）
三角紫叶酢浆草叶色变异株系的 RAPD 和 ISSR
标记初步鉴定
胡 甦 1，王永清 2,*，陶 炼 2, 付 燕 3, 杨 芩 4
（1 四川农业大学林学院，四川雅安 625014；2 四川农业大学园艺学院，四川雅安 625014；3 黔东南民族职业技术学
院植物组培中心，贵州凯里 556000；4凯里学院环境与生命科学学院，贵州凯里 556011）
摘 要：以三角紫叶酢浆草叶色变异株系和其野生型植株为材料，对其遗传物质进行分子水平上的
初步检测。采用 DNA 混合样本池法，构建变异型样本池和野生型样本池，并以这两个 DNA 池做模板分
别进行 RAPD-PCR 和 ISSR-PCR 扩增。从 70 个 RAPD 随机引物和 100 个 ISSR 随机引物中分别筛选出 2
个 RAPD 特异引物（S76，S118）和 2 个 ISSR 特异引物（UBC818，UBC868），均能在上述两个 DNA 池
之间扩增出稳定的差异性条带共 6 条。其中，变异株系的差异性缺失带 S118 700-800 测序成功，其序列
包含编码叶绿体光系统Ⅰ第Ⅶ亚基的基因。研究结果表明，与其野生型相比，该叶色变异株系的确发生
了遗传物质的变化，且在一定继代范围内能通过无性繁殖方式稳定存在。
关键词：三角紫叶酢浆草；叶色变异；体细胞无性系变异；RAPD；ISSR
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）05-0930-09

Preliminary Identification of Leaf Color Mutational Strain from Oxalis
triangularis Using RAPD and ISSR Markers
HU Su1，WANG Yong-qing2,*，TAO Lian2，FU Yan3，and YANG Qin4
（1 College of Forestry，Sichuan Agricultural University，Ya’an，Sichuan 625014，China；2 College of Horticulture，Sichuan
Agricultural University，Ya’an，Sichuan 625014，China；3 Center for Plant Tissue Culture，Qiandongnan Nationality
Professional Technology College，Kaili，Guizhou 556000，China；4 College of Environmental and Life Science，Kaili
University，Kaili，Guizhou 556011，China）
Abstract：A leaf color mutational strain and the wild type of Oxalis triangularis were identified
preliminarily at the molecular level. DNA-pooling method was used in this study to establish the
DNA-pools of the wild type and the mutational type，respectively. These DNA-pools were used as
templates for RAPD-PCR and ISSR-PCR，respectively. Two specific RAPD primers，i.e.，S76 and S118，
and two specific ISSR primers，i.e.，UBC818 and UBC868，were selected from 70 RAPD primers and 100
ISSR primers，respectively，producing 6 specific bands. And these specific bands could identify the two
DNA-pools mentioned above. The sequencing result of the absent specific band，S118 700-800，in the
mutational type showed that the sequence contained a gene coding for subunit Ⅶ，i.e.，PsaC protein，in
photosystemⅠ. The results indicated that compared with the wild type，the genetic material of the

5 期 胡 甦等：三角紫叶酢浆草叶色变异株系的 RAPD 和 ISSR 标记初步鉴定 931

mutational strain had changed indeed，and it could maintain stable in the given subcultures in this study.
Key words：Oxalis triangularis A. St.-Hil.；leaf color mutation；somaclonal variation；RAPD；ISSR

三角紫叶酢浆草（Oxalis triangularis A. St.-Hil.）是酢浆草科（Oxalidaceae）酢浆草属（Oxlais L.）
多年生草本植物。酢浆草属是一个世界性大属，主要分布于非洲和南美洲。这些地区关于该属植物
分子水平的研究报道相对较多，但仅限于某些具有食用价值的种（尤其是安第斯山脉的酢浆薯 O.
tuberosa Mol.），包括：亲缘关系分析（Emshwiller & Doyle，2002；Emshwiller et al.，2009）、系统
分类（Oberlander et al.，2004；Emshwiller，2006；Dreyer et al.，2009）和遗传多样性分析。Pissard
等（2006）用 ISSR 标记分析酢浆薯种内的遗传多样性，随后在其基础上又进行了更深入的研究
（Pissard et al.，2008a，2008b），其 ISSR-PCR 反应引物的选择参考了其他科属植物已开发的引物，
供试引物数量少（22 个）且 PCR 反应体系的优化筛选较粗放（仅涉及 3 个反应因素的 2 ~ 3 个水平）。
中国的酢浆草属植物资源也较丰富，但至今国内鲜见涉及酢浆草属植物分子水平的报道，将分子标
记应用在酢浆草属植物（尤其是三角紫叶酢浆草）变异检测鉴定方面的研究未见报道。
植物的体细胞经过组织培养发生变异是一种常见的现象，称为体细胞无性系变异（Larkin &
Scowcroft，1981），可为植物育种提供新的遗传资源。因此，植物体细胞无性系变异的检测鉴定工
作有重要意义。
四川农业大学园艺生物技术研究中心在成功离体培养三角紫叶酢浆草（王利 等，2005）之后
的继代培养过程中，发现一株试管苗基部的不定芽发生了类似果树芽变的变化——变异芽叶片颜色
由野生型的深紫红色变成了比之明显变浅的桃红色。分离培养该变异芽，能再形成完整植株，且在
连续继代过程中一直保持变异的叶色。
本研究中以上述叶色变异株系及其野生型为材料，用 RAPD 和 ISSR 两种分子标记对其进行
DNA 初步鉴定，为利用 RAPD 和 ISSR 分子标记技术深入研究该物种和酢浆草属植物提供技术参
考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2007 年 11 月—2009 年 9 月进行。
材料取自四川农业大学园艺生物技术研究中心。三角紫叶酢浆草材料分为野生型和变异型两大
类。野生型包括发生叶色变异组培苗的母株（W1，单株）及其快繁移栽成活的再生植株（W2，共
13 株，分别编号为 W2-1 ~ W2-13）。变异型材料为上述野生型组培苗（外植体从母株上采集）基部
发生叶色改变的不定芽，经过单独培养并在相同条件下继代而形成的体细胞无性系变异株系。按继
代次数将变异株系分为继代 1 次材料（V1）、继代 5 次材料（V2）和继代 10 次材料（V3），分别由
相应继代次数的试管小植株群体中随机抽取的 30 株叶形正常的小植株构成。相同培养条件下（温棚
植株的栽培条件相同，试管苗的培养基和培养条件均相同）每个分类群体中形态特征典型的材料见
图 1。
每个样本作生物学重复 4 次，即分别从各材料分类群体中随机取幼嫩叶片（保证每个单株的叶
片都参与取样）4 次构成该样本重复。常规方法研磨并保存（研磨前迅速用滤纸吸干叶表水分）。


932 园 艺 学 报 38 卷
图 1 三角紫叶酢浆草野生型和变异型材料的形态比较
1 ~ 3：野生型（1. 母株，2. 再生株，3. 试管苗）；4 ~ 6：变异型（4. 继代 1 次，5. 继代 5 次，6. 继代 10 次）。
Fig. 1 Morphological comparison between the wild type and the mutational type of Oxalis triangularis
1–3：The wild type（1. Mother plant，2. Regeneration plant，3. In vitro plantlet）；4–6：Mutational type（4. Plantlet subcultured for 1 time，
5. Plantlet subcultured for 5 times，6. Plantlet subcultured for 10 times）.

1.2 方法
1.2.1 DNA 混合样本池构建和反应体系优化
采用改良 CTAB 法（萨姆布鲁克和拉塞尔，2002；付燕 等，2009）分别提取各样本的总基因
组 DNA。改良之处为用苯酚︰氯仿︰异戊醇 = 25︰24︰1，抽提 3 次。DNA 溶液 OD260/OD280 比值在
1.8 ~ 2.0 范围内，满足 RAPD 和 ISSR 条件。
参考刘雪等（2005）、陈良华等（2007）和刘文博等（2010）的方法构建材料的 DNA 混合样本
池。从各样本的 4 个生物学重复中随机抽取 1 个重复并随机组合，分别取部分 W2-1 ~ W2-13 的 DNA
溶液，经 Eppendorf 核酸蛋白仪测定后等量混合构成 W2 的 DNA 混合样本。再以上述相同方法取
W1、W2 的 DNA 溶液等量混合构建野生型材料的 DNA 混合样本池（W），以相同方法取 V1、V2、
V3 的 DNA 溶液构建变异型材料的 DNA 混合样本池（V）。
经预备试验，建立并优化了适宜三角紫叶酢浆草的 RAPD 反应体系：反应液总体积为 25 μL，
含 10 × Buffer（Mg2+ Free）2.5 μL，Mg2+ 2.0 mmol · L-1，Taq 酶 1 U，引物浓度 0.3 μmol · L-1，dNTP
0.25 mmol · L-1，模板 80 ng。RAPD-PCR 反应程序为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 45 s，37 ℃
退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，40 次循环；72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存。ISSR 反应体系为：25 μL
反应液体系中含 10 × Buffer 2.5 μL，Mg2+ 1.25 mmol · L-1，Taq 酶 0.9 U，引物浓度 0.3 mmol · L-1，
dNTP 0.25 mmol · L-1，模板 80 ng。ISSR-PCR 反应程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 50 s，退
火时间 60 s（不同引物的退火温度不同），72 ℃延伸 1.5 min，40 次循环；72 ℃延伸 7 min；4 ℃
保存。
1.2.2 特异引物筛选
先以 W1 的 DNA 做模板进行预试验，从 70 个 RAPD 随机引物和 100 个 ISSR 随机引物中筛选
5 期 胡 甦等：三角紫叶酢浆草叶色变异株系的 RAPD 和 ISSR 标记初步鉴定 933

出扩增结果重复性好 （每个样本的 4 个生物学重复分别做 PCR 和电泳重复至少 3 次）、谱带多而清
晰的 RAPD 和 ISSR 引物。再分别以 DNA 混合样本池 W 和 V 为模板，互为对照，用上述选出的引
物分别进行 RAPD-PCR 和 ISSR-PCR 反应，筛选出能在两个池之间扩增出差异片段的特异引物（试
验重复方法同上）。Taq 酶、10 × Buffer（Mg2+ Free）、MgCl2（25 mmol · L-1）和 dNTP（10 mmol · L-1）
购自天根生化科技有限公司，引物购自上海生工生物工程有限公司，PCR 仪为 BIO-RAD 公司的 DNA
Engine PTC-200 和 iCycler。用常规方法对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（浓度 1.5%）和成像。具
多态性的特异引物增加技术重复 2 ~ 3 次。
1.2.3 差异片段的回收与测序
结果中若出现重复性好且稳定的差异片段，则用对应特异引物在相同条件下进行扩增，设 2 ~ 4
管重复，取少量产物经电泳及核酸蛋白仪检测后，切下相应凝胶回收纯化后测序（送至宝生物公司
进行）。测序结果用 DNAMAN 6.0 软件分析，在 NCBI 数据库中寻找相关信息后进行序列分析。
1.2.4 变异株系遗传稳定性检测
选用特异引物 S118、UBC818 和 UBC868 分别对材料 V1、V2 和 V3 进行扩增，检测变异株系
不同继代次数材料的遗传稳定性。各材料生物学重复 4 次，技术重复（PCR 和电泳）至少 3 次。
2 结果与分析
2.1 RAPD 反应体系和特异引物扩增结果
从 70 个 RAPD 随机引物中初选出 38 个效果好的引物。其中，8 个引物在野生型（W）和变异
型（V）的 DNA 混合样本池之间扩增出了差异片段。但经多次重复扩增和电泳验证，只有引物 S76
和 S118 能稳定地扩增出如图 2 所示的差异性条带，可以作为鉴定变异株系的特异性引物。在 S76
的扩增结果中，变异型在 1 200 ~ 1 400 bp 之间的一条主带比野生型对应条带更明亮；野生型在 200 ~
400 bp 之间有一条弱带，而变异型没有对应条带。在 S118 扩增结果中，野生型在 700 ~ 800 bp 之间
都存在一条明亮的主带，变异型在相同迁移率处明显缺少对应同样明亮的条带；野生型在 600 ~ 700
bp 处有一条弱带，而变异型没有对应的条带。上述每个特异引物的 4 个重复的扩增结果均一致。

图 2 引物 S76（A）和 S118（B）对野生型与变异型的 RAPD 扩增结果
W：野生型；V：变异型；M：分子量标准。箭头所指为差异片段。
Fig. 2 The RAPD-PCR results for the wild type and the mutational strain amplified by primer S76（A）and S118（B）
W：The wild type；V：The mutational；M：Marker. The arrows pointed to specific bands.
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2.2 ISSR 反应体系和特异引物扩增结果
从 100 个 ISSR 随机引物中选出引物共 52 个。其中，5 个引物在扩增结果中都出现了差异性条
带，但经多次重复扩增和电泳验证，只有引物 UBC818 和 UBC868 能稳定地反映出上述两个 DNA
样本池之间的差异，是特异引物。从 UBC818 的扩增结果（图 3，A）看，野生型在 500 ~ 600 bp 范
围内有一条主带清晰明亮，而变异型相同迁移率处的条带模糊弥散。从 UBC868 的扩增结果（图 3，
B）看，野生型存在一条 800 ~ 900 bp 的明亮的主带，而变异型在相同迁移率处弥散模糊，缺少与之
对应的条带。上述每个特异引物的 4 次重复的扩增结果均一致。

图 3 引物 UBC818（A）和 UBC868（B）对野生型与变异型的 ISSR 扩增结果
W：野生型，V：变异型；M：分子量标准。箭头所指为差异片段。
UBC818 最适退火温度 58.3 ℃，UBC868 最适退火温度 50.8 ℃。
Fig. 3 The ISSR-PCR results for the wild type and the mutational strain amplified by primer UBC818（A）and UBC868（B）
W：The wild type；V：The mutational type；M：Marker. The arrows pointed to specific bands.
The suitable Ta for UBC818 was 58.3 ℃，and the suitable Ta for UBC868 was 50.8 .℃

综上所述，两种分子标记的特异引物扩增结果中共包含了 6 个差异片段（表 1），可视为 6 种特
异标记，记为 S76 1200-1400，S76 200-400，S118 700-800，S118 600-700，UBC818 500-600 和 UB868
800-900。其中，S76 200-400，S118 600-700 和 UB868 800-900 属于质的差异，即片段的有无及片段
数的差异；其余特异性标记属于量的差异，即片段亮度强弱的差异。从表 1 可以看出，除 S76 扩增
产物中变异型 1 200 ~ 1 400 bp 一条片段的亮度远强于野生型对应条带外，其余各差异片段（包括质
和量的差异）都出现在野生型扩增产物中，即变异型相对于野生型出现了差异性缺失带或者差异性
弱带。可以推测，这种现象可能与变异株系叶色变浅的表型有关。
表 1 特异引物对变异型与野生型 DNA 样本池的扩增结果与差异片段
Table 1 The results and polymorphic fragments amplified by specific primers between the wild type and the mutational strain DNA-pools
注：“–”表示相同迁移率处没有对应条带或条带信号很弱。
Note：“–”meant that there was no fragment at the same mobility，or the signal was weak.
差异片段分子量所在的范围/ bp
Molecular weight range of
polymorphic fragments
标记类型
Marker type
引物编号
Primer No.
碱基序列
Primer sequence
（5′→3′）
单个重复
扩增片段总数
Total fragments
amplified
单个重复
差异性片段数
Polymorphic
fragments 变异型（V）
The mutational type
野生型（W）
The wild type
1 200 ~ 1 400 – S76 CACACTCCAG 14 2
– 200 ~ 400
– 700 ~ 800
RAPD
S118 GAATCGGCCA 5 2
– 600 ~ 700
ISSR UBC818 (CA)8G 7 1 – 500 ~ 600
UBC868 (GAA)6 9 1 – 800 ~ 900
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2.3 差异片段的序列分析
S76 200-400 和 S118 600-700 回收率太低而未测序；UBC818 500-600、UB868 800-900 和 S76
1200-1400 因回收纯化后杂带多而测序失败。只有 S118 700-800 测序成功，获得一条核苷酸序列，
如图 4 所示。将该序列在 NCBI 上 BLAST 搜索，发现其为叶绿体相关序列。分析结果表明，该序
列含有一个完整的开放阅读框，长 246 bp，编码 80 个氨基酸。在 BLAST 搜索该氨基酸序列，找到
叶绿体光系统Ⅰ第Ⅶ亚基蛋白（PsaC）的氨基酸序列。
从 NCBI 下载相关序列，用 DNAman 6.0 进行序列比较，其相似性达 96.92%（图 5）。从图 5 可

图 4 特异标记 S118 700-800 测序结果
前 10 个氨基酸为引物 S118 序列；方框内序列指目标基因所在的开放阅读框。
Fig. 4 Sequencing of specific marker S118 700-800
The 10 amino acids ahead were the sequence of primer S118；The sequence in the frame referred to
the open reading frame which contained the target gene.



图 5 PsaC 基因的氨基酸序列比对
Fig. 5 Alignment of the amino acid sequences of the PsaC gene
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见，所有序列在 69 和 70 位氨基酸变化最大，从测序结果中获得的氨基酸序列与拟南芥（NP_051110）、
菠菜（CAB88785）和绿檀（ADD30729）的相似程度达 100%。
2.4 变异株系的遗传稳定性
从图 6 可以看出，变异株系继代 1 次（V1）、5 次（V2）和 10 次（V3）的材料 DNA 的扩增产
物完全一致，表明在本研究开始计算的时间范围内，相同条件下连续继代培养 1 ~ 10 次，变异株系
的遗传物质没有明显的改变。



图 6 引物 S118（A）、UBC818（B）和 UBC868（C）对变异株系不同继代次数材料的扩增结果
V1 ~ V3：继代 1 次、5 次和 10 次的变异株系材料；M：分子量标准。
Fig. 6 The electrophoresis results of the mutational strains subcultured for different times
amplified by primer S118（A），UBC818（B）and UBC868（C）
V1–V3：The material of the mutational strain subcultured for 1 time，
5 times and 10 times；M：Marker.
3 讨论
本研究中初步判断变异株系的扩增产物中缺失差异片段 S118 700-800。该片段包含了编码光
合系统Ⅰ的第Ⅶ亚基（PsaC 蛋白）基因。PsaC 是藻类光化学反应和高等植物光系统Ⅰ必需的组成
成分，较多报道指出它是光系统Ⅰ的铁硫中心（Steppuhn et al.，1989；Herman et al.，1994；郁飞
等，2001；Le Corguillé et al.，2009）。作者在相关试验中发现，与野生型的情况恰好相反，变异
型在低浓度蔗糖的培养基中叶片颜色始终不变绿，并且其叶绿素、类胡萝卜素和花青素含量均远
低于野生型（另文详细报道）。可能是因为这段序列结构的改变，导致变异株系叶绿体光系统Ⅰ中
的 PsaC 蛋白表达受阻，从而影响光合作用电子传递途径，降低光合效率，使变异型小植株不能合
成充足的碳水化合物以满足其色素合成代谢底物和碳骨架的需要。这种推测尚待进一步试验验证。
植物的体细胞无性系变异材料与正常材料之间遗传差异很小，利用现有分子标记均较难检测，
在较大的引物数量范围内筛选出稳定的特异性引物和寻找到特异性片段的机率低。在变异体与对照
基因组之间差异很小的情况下，只有筛选到结合位点在表现小区段差异的引物时，RAPD 鉴定才能
奏效（房经贵 等，2001）。虽然 ISSR 标记多态性和重复性都优于 RAPD，但已开发的适合不同植
物的引物数量非常有限。高等植物的基因组普遍较大，利用已知引物对整个基因 DNA 扩增得到的
序列非常有限，不可能覆盖整个基因组。而遗传物质的变异则可能位于整个基因组中的一个很小位
5 期 胡 甦等：三角紫叶酢浆草叶色变异株系的 RAPD 和 ISSR 标记初步鉴定 937

点上（李莉 等，2004）。加上体细胞无性系变异类型也不同，故一些变异的检测鉴定仍难度较大。
本试验亦是如此，只找到了 1 个与叶色变异性状相关的基因。需要说明的是，图 2 中个别重复的差
异性片段 S76 1200-1400 和 S118 700-800 相同迁移率处存在较弱亮度的对应条带，这很可能与该重
复的样本 DNA 组成和质量有关。因此，变异株系是否真实缺失该基因，或者该基因并未缺失但其
表达调控和体外复制受阻（如长期继代培养可能提高核酸的甲基化程度等），还需进一步探索。另外，
可考虑应用其它分子标记技术，如反映小片段多态性的 AFLP 标记，Emshwiller（2006）、Emshwiller
等（2009）用其分析酢浆薯种内的遗传差异和亲缘关系；与叶绿体密切相关的 ncpGS（核编码叶绿
体表达谷氨酰胺合成酶基因）序列，Emshwiller 和 Doyle（2002）用其分析酢浆薯的驯化起源和多
倍化起源；核糖体 DNA ITS 序列，Dreyer 等（2009）用其确定了南非新种（O. saltusbelli）的详细
分类地位；适合反映种下关系的 SSCP（单链构象多态性）标记；检测甲基化程度的 MSAP（甲基
化敏感扩增多态性）（李毅丹 等，2009；王子成 等，2009）等。
本研究中首次建立并优化了三角紫叶酢浆草的 RAPD-PCR 和 ISSR-PCR 反应体系，且比前人
（Pissard et al.，2006）建立同属植物的 ISSR-PCR 反应技术体系更详细系统；通过该两种标记数据
分析，从分子水平初步判断该叶色变异确实与遗传物质变化密切相关。研究中获得的序列信息可为
酢浆草属植物的特异引物的开发奠定基础。

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