全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (4) : 539 - 544
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 27; 修回日期 : 2009 - 03 - 19
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30371189)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lyhshen@1261com)
羽衣甘蓝花粉 SCR132b基因的分离及其功能分析
蓝兴国 , 杨　佳 , 李玉花 3
(东北林业大学生命科学学院 , 哈尔滨 150040)
摘 　要 : 以羽衣甘蓝 (B rassica oleracea var. acephala) S132b S132b自交不亲和系为试验材料 , 分离了控制
花粉自交不亲和基因 ———S132b单倍型富含半胱氨酸基因 (SCR132b ) , GenBank收录号为 EF577028。SCR132b
cDNA序列含有 237 bp的开放读码框 (ORF) , 编码一个含 78个氨基酸的蛋白。SCR132b gDNA含有一个 758
bp的内含子 , 内含子 5′供体位点和 3′受体位点边界序列符合 GU2AG规则 ; DNA blot分析表明 SCR132b在基
因组中只有单一拷贝 ; 授粉生物活性分析试验显示原核表达 SCR132b融合蛋白能够启动 SI反应 , 抑制杂交亲
和花粉的萌发和生长。
关键词 : 羽衣甘蓝 ; 自交不亲和 ; 原核表达
中图分类号 : S 68119; Q 781　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0420539206
Isola tion and Functiona l Ana lysis of a S132b 2locus Cyste ine2r ich Gene of O rna2
m en ta l Ka le ( B rassica o le racea var. acepha la )
LAN Xing2guo, YANG J ia, and L I Yu2hua3
(College of L ife Sciences, N ortheast Forestry U niversity, Harbin 150040, China)
Abstract: The S132b 2locus cysteine2rich gene ( SCR132b ) was isolated from pollen of ornamental kale
(B rassica oleracea var. acepha la) S132b homozygotes, GenBank accession number is EF577028. The SCR132b
cDNA sequence had an ORF of 237 bp, encoding a 782aa p rotein. The genom ic SCR132b sequence contained a
758 bp intron with boundary sequences of GT at 5′site and AG at 3′site, which comp lied with the typ ical
‘GT2AG rule’in p lants. Genom ic DNA blot analysis showed that SCR132b was a single copy gene in S132b S132b
lines. Pollination bioassay showed that p rokaryotic exp ressed recombinant SCR132b can induce SI response and
inhibit cross pollen germ ination and growth.
Key words: B rassica oleracea var. acepha la; self2incompatibility; p rokaryotic exp ression
芸薹属植物自交不亲和性 ( self2incompatibility, SI) 由 S单倍型上的基因控制 (Bateman, 1955;
Nasrallah, 2000 ) , 其中位于 S 单倍型上的 SCR 基因控制花粉的 SI表型 ( Schopfer et al. , 1999;
Takayama et al. , 2000) , SR K基因特异性地在柱头乳突细胞内表达 , 控制柱头的 SI表型 ( Stein et al. ,
1991)。在自交授粉过程中 , 同一单倍型的 SCR蛋白与柱头上 SRK受体蛋白激酶胞外域特异性地结
合 , 导致 SRK胞内激酶域的磷酸化 , 通过柱头乳突细胞内的信号级联反应导致自交不亲和 (蓝兴国
等 , 2004; Murase et al. , 2004; Shimosato et al. , 2007; Kemp & Doughty, 2007)。
SCR为花粉覆盖物中一种小的、富含半胱氨酸的分泌蛋白。在目前鉴定的 SCR中 , 氨基酸序列
主要由一个信号肽区域和一个成熟肽区域组成 ( Schopfer et al. , 1999; Takayama et al. , 2000; Sato et
al. , 2003)。成熟肽区域一般由 50～59个氨基酸组成 , 不同 S单倍型中的 SCR蛋白质在成熟肽区域
具有高度的序列多态性 ( Schopfer et al. , 1999; M ishima et al. , 2003)。
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羽衣甘蓝 (B rassica oleracea var. acepha la ) 是我国北方城市重要的绿化和食用植物 (L i & Yu,
2006)。在前期研究中 , 作者从羽衣甘蓝 SI系中鉴定出 S132b S132b单倍型 SI系 , 具有较强的自交不亲和
性 (蓝兴国 等 , 2006)。目前 , 虽然已鉴定出 SR K132b , 但 SCR132b序列及其功能尚无报道。本研究利
用 RT2PCR的方法分离羽衣甘蓝 SCR132b全长编码区序列 , 并通过授粉生物活性分析证明 SCR132b能够启
动 SI反应 ; 此外 , SCR132b基因含有一个 758 bp的内含子 ; 在 DNA blot研究中表明 SCR132b在 S132b S132b
自交不亲和系基因组中只有单一拷贝 , 这些研究为进一步探讨 SI的分子机理奠定了基础。
1　材料与方法
111　羽衣甘蓝 SCR132b的分离
11111　SCR132b cDNA的分离 　
将羽衣甘蓝 S132b S132b自交不亲和系于 2006年 6月至 2007年 5月种植于东北林业大学花卉生物工
程研究所。收集羽衣甘蓝 S132b S132b自交不亲和系植株 2～8 mm 的花蕾 , 分离花蕾中的花药 , 利用
CTAB法分别提取花药 RNA (蓝兴国 等 , 2006)。RNA反转录采用的是 AMV反转录酶 ( TaKaRa) 和
锚定引物 O ligo ( dT) 18 , 反转录的程序是 : 42 ℃孵育 30 m in, 99 ℃变性 5 m in和 4 ℃孵育 5 m in。
利用 SCR132b特异性引物 1 ( 5′2TAAACAAGAATTTGCTGCGAG23′) 和 SCR132b特异性引物 2 ( 5′2
GAGAACAACTGATACTTTG23′) 进行 SCR全部编码区序列的扩增。SCR132b特异性引物根据甘蓝 SCR13
( Schopfer et al. , 1999) 的 5′和 3′末端编码区设计。PCR以反转录的第 1条链作为模板 , 利用 LA Taq
DNA聚合酶 ( TaKaRa) 进行反应。扩增条件为 94 ℃变性 30 s, 50 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 m in, 共
35个循环后 , 72 ℃延伸 7 m in。 PCR产物用 MagExtractor2PCR & Gel Clean up (东洋纺 ) 回收 , 与
pGEM 2T载体连接 , 转化到 Top10菌株中 , 挑选阳性克隆 , 进行 DNA序列测定。
11112　基因组 SCR132bDNA的分离 　
取羽衣甘蓝 S132b S132b自交不亲和系植株的新鲜嫩叶 , 用 CTAB法提取基因组 DNA (蓝兴国 等 ,
2006)。以 SCR132b特异性引物 1和 SCR132b特异性引物 2, LA Taq DNA聚合酶 ( TaKaRa) 进行 PCR反
应扩增 SCR132bDNA片段。PCR反应条件为 : 94 ℃变性 30 s, 50 ℃退火 1 m in, 72 ℃延伸 2 m in, 共
35个循环后 , 72 ℃延伸 7 m in。PCR产物回收后 , 插入到 pBS2T载体中 , 连接产物转化大肠杆菌
Top10中 , 选择阳性克隆进行测序。
112　SCR132b的 D NA blot分析
基因组 DNA (6～7μg) , 分别用 EcoRⅠ、Xba Ⅰ、B am H Ⅰ、H ind Ⅲ限制性内切酶进行消化后 ,
用 017%琼脂糖凝胶电泳分离 ; 然后将 DNA片段转移到 HybondTM 2N尼龙膜上 ; 探针以 SCR132b探针引
物 1 (5′2GCTAATCTGATGATGCCTTGTGG23′) 和探针引物 2 ( 5′2TTTTGACTAAGACGAATTTTGGA23′)
用地高辛标记获得 ; 凝胶在变性液 (015 mol·L - 1 NaOH和 115 mol·L - 1 NaCl) 中处理后 , 65 ℃水
浴锅中进行杂交 ; 杂交后 , 用 2% SSC和 011% SDS的溶液在室温下将膜洗两次 , 每次 5 m in; 再用
011% SSC和 011% SDS溶液在 65 ℃洗 30 m in, 进行 X光片显影。
113　SCR132b重组蛋白质的原核表达及纯化
11311　原核表达质粒 pGEX2KG2SCR132b及 pET232a2SCR132b的构建 　
引物 P1 ( 5′2GC TCTAGA TAATCTGATGATGCCTTGTGGC23′) , 下划线代表 X ba Ⅰ酶切位点 ; P2
(5′2GCCAAGCTTCTAACACAATTTACAATCACA23′) , 下划线代表 H ind Ⅲ酶切位点。及 P3 ( 5′2CG
GGATCCAATCTGATGATGCCTTGTGGC23′) , 下划线代表 B am H Ⅰ和 P4 ( 5′2CCGAAGCTTCTAACA2
CAATTTACAATCAC23′) , 以 pGEM 2SCR132b质粒为模板 , 扩增编码 SCR132b成熟蛋白的 165 bp 序列。
PCR反应采用 KOD高保真酶 (东洋纺 ) , 扩增条件为 94 ℃变性 15 s, 55 ℃退火 30 s, 68 ℃延伸 1
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　4期 蓝兴国等 : 羽衣甘蓝花粉 SCR132b基因的分离及其功能分析 　
m in, 共 30个循环后 , 72 ℃延伸 7 m in。 PCR产物回收、双酶切后 , 分别插入到 pGEX2KG载体和
pET232a载体中 , 连接产物转化大肠杆菌 DH5α。重组质粒经 PCR和酶切鉴定正确后 , 进行 DNA序
列分析。
11312　SCR132b重组蛋白质的原核表达 　
将鉴定正确的 pGEX2KG2SCR132b、pET232a2SCR132b质粒转化到 BL21 (DE3) pLysS菌株中。分别挑
取单菌落于 5 mL LB培养基 (含氨苄青霉素 ) 中 , 37 ℃振摇培养至对数期 A600 = 016, 加入终浓度为
1 mmol·L - 1的异丙基β2D - 硫代半乳糖苷 ( isop ropy2β2D2thiogalactoside, IPTG) , 37 ℃诱导 4 h后 ,
进行 12%的 SDS2PAGE电泳 , 考马斯亮蓝染色进行表达检测。
11313　GST融合蛋白的纯化 　
对表达的 pGEX2KG2SCR132b菌落以 100 mL进行大量扩增诱导 , 5 000 r·m in - 1室温离心 10 m in,
收集细菌。将细菌沉淀重悬于 5 mL PBS缓冲液 ( 137 mmol·L - 1 NaCl; 217 mmol·L - 1 KCl; 10
mmol·L - 1 Na2 HPO4 ; 2 mmol·L - 1 KH2 PO4 ; pH 716) 中 , 超声破碎后 , 12 000 r·m in - 1、4 ℃离心
15 m in。取上清液加入用 PBS缓冲液平衡过的 Poly2Prep chromatography column层析柱 (B io2Rad公司 )
中 , 再加入 100μL GST B indTM树脂 , 4 ℃结合 30 m in。用 600μL PBS缓冲液洗涤 3次 , 最后用 250
μL洗脱缓冲液 (10 mmol·L - 1还原型谷胱甘肽 , 50 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 810) 洗脱并收集融合
蛋白 , 取 10μL蛋白质样品进行 12% SDS2PAGE电泳并进行检测。
11314　H is融合蛋白纯化 　
对表达的 pET232a2SCR132b菌落以 100 mL进行大量扩增诱导 , 离心收集细菌 , 将细菌沉淀重悬于
5 mL结合缓冲液 (20 mmol·L - 1 Tris2base; 30 mmol·L - 1 NaCl; 10 mmol·L - 1咪唑 ; pH 810) , 超声
破碎后 , 12 000 r·m in - 1、4 ℃离心 15 m in。取上清液加入用结合缓冲液平衡 Poly2Prep chromatogra2
phy column层析柱中 , 加入 100μL N i2NTA琼脂糖 (Novagen公司 ) , 4 ℃结合 30 m in。依次用 20、30
和 40 mmol·L - 1咪唑洗脱缓冲液冲洗 N i2NTA琼脂糖 , 最后用 250 mmol·L - 1咪唑洗脱并收集融合蛋
白。
114　SCR132b融合蛋白质的授粉生物活性分析
对 S132b S132b自交不亲和系植株进行自交并与 14号 (自交亲和系 ) 花粉杂交授粉。对未散花粉的
花进行去雄处理 , 在柱头乳突细胞上涂抹约 015μL 600 ng·μL - 1的 GST2SCR132b或 H is2SCR132b重组蛋
白。干燥 1 h后 , 授 14号花粉。授粉 6 h后各取 15个雌蕊 , 在 FAA固定液中固定 24 h。水洗后室温
放置在 8 mol·L - 1的 NaOH中 20 h。用水冲洗后 , 用 011%的苯胺蓝 (011 mol·L - 1 K3 PO4缓冲液 ) 染
色 4 h。通过荧光显微镜观察花粉管的生长。
2　结果与分析
211　SCR132b基因的分离
通过 RT2PCR的方法获得了羽衣甘蓝 SCR132b的 cDNA序列 (图 1) , GenBank收录号为 EF577028。
羽衣甘蓝 SCR132b cDNA序列含有 237 bp的开放读码框 (ORF) , 编码 78个氨基酸的蛋白质。SCR132b蛋
白的 N端含有一个由 24氨基酸组成的信号肽区域 , C端含有一个由 54氨基酸组成的成熟肽区域。羽
衣甘蓝 SCR132b与甘蓝 SCR13氨基酸的序列 ( Schopfer et al. , 1999) 比对具有 9813%的同源性。
利用 SCR132b的特异性引物 1和 2通过对基因组 DNA进行 PCR, 获得 SCR132b DNA序列。与 SCR132b
cDNA序列进行比较发现 , 羽衣甘蓝 SCR132b基因含有一个 758 bp的内含子 , 内含子 5′供体位点和 3′受
体位点边界序列分别是 5′2GU和 3′2AG, 符合 GU2AG规则 , AT的含量达到 6914% (图 1)。
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图 1　SCR132b的核酸序列及推测的氨基酸序列
小写字母表示内含子区域 , gt和 ag分别为供体位和受体位 , 大写字母表示外显子区域 ,
TAG为终止密码子 , 核酸序列下排为推测的氨基酸序列。信号肽区域 (1～24氨基酸 ) 下划线显示。
F ig. 1　 Nucleotide sequence of SCR132b and its deduced am ino ac id sequence
The intron regions are shown in lowercase letters, with the sp lice donor/accep tor sequence in frame letters.
The exon regions are shown in uppercase letters, with the underlined TAG sequence indicating the stop codon,
and the deduced am ino acid sequence is dep icted below the nucleotide sequence.
The characteristic signal pep tide ( am ino acids 1 - 24) is underlined with a single line.
212　SCR132b的 D NA blot分析
为了进一步研究 SCR132b在基因组中的拷贝
数 , 基因组 DNA 经 EcoR Ⅰ、X ba Ⅰ、H ind Ⅲ、
B am H Ⅰ限制性内切酶酶切消化 , 用 SCR132b特异
性探针进行杂交 , 显示出只有单一的条带 (图
2) , 这说明 SCR132b在基因组中只存在单一的拷
贝。
图 2　SCR132b的 D NA blot分析
F ig. 2　D NA blot ana lysis of SCR132b
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　4期 蓝兴国等 : 羽衣甘蓝花粉 SCR132b基因的分离及其功能分析 　
213　SCR132b重组蛋白的纯化
将构建好的 pGEX2KG2SCR132b表达质粒转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS菌株中 , 在 37 ℃下
LB培养基进行细菌培养 , 当细菌 OD600到达 016左右 , 加入 IPTG进行诱导表达。对表达后的细菌进
行裂解 , 通过亲和层析的方法纯化出一条 32 kD左
右的蛋白条带 (图 3, A )。由于 pGEX2KG载体
表达的 GST大约 26 kD , 而 SCR132b的大小预测 6
kD左右 , 因此 , 认为纯化出的条带是目的条带
GST2SCR132b。
将 pET232a2SCR132b表达质粒转化到大肠杆菌
BL21 (DE3) pLysS菌株中 , 进行蛋白质的诱导
与表达。经 N i2 + 2NTA亲合树脂亲合层析纯化后 ,
在 SDS2PAGE电泳结果如图 3, B。从图中可以看
出纯化得到一个 26 kD左右的蛋白质条带 , 由于
pET232a载体本身能够表达一个 20 kD 左右的标
签蛋白质 , 纯化出的目的条带是 H is2SCR132b。 图 3　SCR132b重组蛋白的纯化F ig. 3　Pur if ica tion of recom b inan t SCR132b
214　SCR132b授粉生物活性分析
本研究结果显示 S132b S132b柱头自交授粉 , 花粉粒没有萌发和生长 (图 4, A ) ; 利用 14号花粉给
S132b S132b柱头授粉 , 有大量的花粉萌发和生长 (图 4, B ) ; 但经过 GST2SCR132b、H is2SCR132b融合蛋白处
理的 S132b S132b柱头上 , 14号花粉几乎没有萌发 (图 4, C、D )。说明 S132b S132b柱头乳突细胞经过 SCR132b
重组蛋白刺激后产生了 SI反应 , 从而抑制了亲和花粉的正常萌发和生长。
图 4　利用荧光显微镜观察花粉萌发和花粉管的生长情况
A. S132b S132b自交授粉 ; B. S132b S132b ×14号杂交授粉 ;
C. GST2SCR132b重组蛋白处理柱头后杂交授粉 ; D. H is2SCR132b重组蛋白处理柱头后杂交授粉。
F ig. 4　O bserva tion of pollen germ ina tion and pollen tube growth by fluorescence m icroscopy
A. Self2pollination; B. S132b S132b ×14 cross2pollination; C. S132b S132b ×14 cross2pollination
after stigma treated by GST2SCR132b ; D. S132b S132b ×14 cross2pollination after stigma treated by H is2SCR132b.
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3　讨论
本研究获得了一个新的 SCR基因 ———SCR132b , SCR132b cDNA序列含有一个 237 bp的开放读码框 ,
编码一个 78个氨基酸的蛋白质。SCR132b蛋白的 N端由 24个氨基酸组成的信号肽区域 , C端由 54个
氨基酸组成的成熟肽区域。在氨基酸的序列比对中 , 羽衣甘蓝 SCR132b与甘蓝 SCR13具有 9813%的同源
性。在羽衣甘蓝 SCR132b基因中含有一个 758 bp的内含子 , 内含子 5′供体位点和 3′受体位点边界序列
符合 GU2AG规则 , AT的含量高达 6914%。在其它 S单倍型的 SCR中 , 同样发现含有一个的内含子 ,
但长度却存在着很大的差别 , 如芜菁 (B rassica rapa ) SCR8内含子的长度约 4 kb, SCR9约 017 kb和
SCR12约 013 kb; 甘蓝中 SCR6约 019 kb ( Schopfer et al. , 1999; Takayama et al. , 2000)。通过上述的研
究对 SCR基因的结构有了进一步的认识。
授粉生物活性分析是一种快速鉴定 SCR生物活性的方法 , 通过在体外进行蛋白质的表达和纯化 ,
然后对柱头进行重组蛋白的刺激 , 如果重组的 SCR蛋白具有生物活性就会启动 SI反应 , 导致亲和授
粉的花粉也不能够正常的在柱头上生长 ( Takayama et al. , 2000; Sato et al. , 2004)。本研究获得的羽
衣甘蓝重组 SCR132b能够启动 SI反应 , 干扰或抑制了杂交亲和花粉的正常生长 , 这说明了 SCR132b在 SI
上具有重要的功能。上述研究为更好地理解 “SCR”与 “SRK”这种 “钥匙 ”与 “锁 ”的关系 , 探
讨 SI分子机理的研究奠定了基础。
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