全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1161 - 1168
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 13; 修回日期 : 2009 - 06 - 29
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2008AA10Z155) ; 北京市科委项目 ( Z07070501770704)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yanglm@mail1caas1net1cn, ylmcaas@hotmail1com)
Bt cry1 Ia8抗虫基因对结球甘蓝的转化及其表达
崔　磊 1 , 杨丽梅 13 , 刘 　楠 2 , 郎志宏 3 , 刘玉梅 1 , 庄 　木 1 , 张扬勇 1 ,
张友军 1 , 黄大　2, 3 , 方智远 1
(1中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2中国农业科学院植物保护研究所 , 植物病虫害生物学国家重点实
验室 , 北京 100193; 3中国农业科学院生物技术研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 以结球甘蓝 (B rassica oleracea L. var. capita ta L. ) 的下胚轴和具柄子叶为外植体 , 通过根癌
农杆菌 (A grobacterium tum efaciens) 介导法将苏云金芽孢杆菌 (B acillus thuringiensis) 杀虫晶体蛋白基因
cry1 Ia8导入结球甘蓝中 , 共获得 38株卡那霉素抗性植株。PCR和 Southern blot检测证实 cry1 Ia8基因已经
成功导入并整合到甘蓝的基因组中 ; RT2PCR和 W estern blot检测表明 , cry1 Ia8基因在转录和翻译水平有一
定的表达 ; 转化植株叶片离体饲喂敏感小菜蛾 ( Plu tella xy lostella) 和对 Cry1Ac蛋白表现抗性的小菜蛾的试
验表明 , 该基因不仅对敏感小菜蛾有很强的抗性 , 对抗性小菜蛾也具有较强的抗性。
关键词 : 结球甘蓝 ; 小菜蛾 ; B t基因 ; cry1 Ia8; 转基因 ; 抗虫性
中图分类号 : S 63511; S 436134112 + 4　文献标识码 : A　文章编号 : 05132353X (2009) 0821161208
Tran sforma tion and Expressing of Bt Gene cry1 Ia8 in Cabbage
CU ILei1 , YANG L i2mei13 , L IU Nan2 , LANG Zhi2hong3 , L IU Yu2mei1 , ZHUANG Mu1 , ZHANG Yang2
yong1 , ZHANG You2jun1 , HUANG Da2fang2, 3 , and FANG Zhi2yuan1
(1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, China; 2 S tate Key Laboratory
for B iology of P lant D iseases and Insect Pests, Institu te of P lan t Protection, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing
100193, China; 3B iotechnology Research Institu te, Ch inese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, China )
Abstract: In order to obtain transgenic cabbage lineswith insect2resistance, cry1 Ia8 gene was transferred
to cabbage ( B rassica oleracea L. var. capita ta L. ) with the transformation of hypocotyl segments and
cotyledon with petiole via A grobacterium tum efaciens. Thirty2eight transformants with kanamycin2resistance
were obtained. PCR and Southern blot analysis showed that cry1 Ia8 gene was integrated into the genome of
cabbage. Moreover, RT2PCR and W estern blot detection demonstrated that cry1 Ia8 gene was exp ressed in
RNA and p rotein levels. The results of bioassay with the suscep tible and resistant diamondback moth (DBM ,
P lu tella xy lostella) disp layed that most of the transgenic p lants were resistant to the larvae of suscep tible DBM
and also to the insect strain which is resistant to Cry1Ac toxin.
Key words: cabbage; P lu tella xy lostella; B t gene; cry1 Ia8; transformation; resistance
结球甘蓝生产上的虫害日趋严重 (蒋杰贤 等 , 2002)。自 1996年转基因作物商业化以来 , 全球
种植的抗虫转基因作物面积已经达到了 2 625万 hm2 (James, 2008)。Holbrook和 M iki (1985) 首先
对甘蓝进行转化研究 , 并获得再生植株。国内外的报道表明 , 转 B t杀虫蛋白基因 (绝大多数基因为
cry1A c) 的甘蓝植株对鳞翅目害虫 , 如小菜蛾和菜青虫等都有较强的抗虫效果 ( Timothy et al. , 1995;
毛慧珠 等 , 1996; 杨广东 等 , 2002; 李汉霞 等 , 2006; 李贤 等 , 2008)。
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近年来 , 随着 B t转基因作物的应用 , 害虫在一定程度上得到了控制。然而害虫在田间产生抗性
的风险也逐年上升 ( Tabashnik et al. , 2008) , 鳞翅目、鞘翅目等十余种害虫对 B t产生了较强的抗性
( Tabashnik, 1994; 王崇利 等 , 2006)。因此 , 采用与常用的 cry1A类无交互抗性的新基因 , 培育新
型抗虫转基因植物品种 , 具有重要的理论意义和实用价值 ( Tang et al. , 2001)。
本研究中采用的 cry1 Ia8基因由中国农业科学院植物保护研究所自主分离克隆 , 经过密码子优化 ,
人工合成了新的序列 (窦黎明 等 , 2007)。该基因编码的 cry1 Ia8蛋白对玉米螟、小菜蛾等具有高毒
力 , 但与 Cry1A类蛋白没有交互抗性 (Angamuthu et al. , 1998; Tounsi et al. , 2003; Escudero et al. ,
2006)。通过农杆菌介导法建立结球甘蓝的转化体系 , 并将该基因转入甘蓝 , 获得抗虫转基因植株 ,
此研究的成功将为新一代抗虫转基因蔬菜的研制奠定基础。
1　材料与方法
111　材料
试验于 2007—2009年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。甘蓝转化材料分别为 CA2123和
CB2425, 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝组提供。
转化所用到的培养基共有 5种 , 详见表 1。
表 1　甘蓝遗传转化所用培养基
Table 1 Com position s of m ed ia for tran sforma tion of cabbage
培养基
Media
配方
Composition
用途
U sage
PM MS + 1 mg·L - 1 62BA + 011 mg·L - 1 NAA + 28 g·L - 1 Sugar + 预培养 /共培养 Pre2culture /Co2culture
7 g·L - 1 agar, pH 518
SM PM + 10 mg·L - 1 Kam + 500 mg·L - 1 Cab, pH 518 选择培养 Selective culture
RM 1 /2MS + 011 mg·L - 1 NAA + 011 mg·L - 1 IBA + 生根培养 Rooting
20 g·L - 1 Sugar + 7 g·L - 1 agar, pH 518
MS0 L iquid MS, pH 5. 8 悬浮细菌 Resuspension
YEP Yeast extract 10 g·L - 1 + Tryp tone 10 g·L - 1 +NaCl 5 g·L - 1 细菌培养 Bacteria culture
　　B t cry1 Ia8优化基因由中国农业科学院植物保护研究所提供。重组质粒载体为 pCSIaN ( 13 kb) ,
由中国农业科学院生物技术研究所提供 , 含有增强子元件的 CaMV35S启动子、 cry1 Ia8 目的基因
(211 kb) 和 N PTⅡ选择标记基因。大肠杆菌菌株为 JM110, 农杆菌菌株为 EHA105。
　　一抗为 B t毒蛋白的抗血清 , 由中国农业科学院植物保护研究所提供 , 二抗为碱性磷酸酯酶
(AP) 偶联的山羊抗兔 IgG, 购于 Sigma公司。
　　生物测定所使用的小菜蛾 ( P lu tella xy lostella) 为对 Cry1Ac蛋白表现敏感和抗性的种群 , 由中国
农业科学院蔬菜花卉研究所害虫防治组提供。
112　转化受体和菌液准备
甘蓝种子经 75%的酒精表面消毒 1 m in, 14%的次氯酸钠灭菌 14 m in, 无菌水冲洗 3次 , 接种于
MS固体培养基上。切取播种 4～5 d后的甘蓝幼苗的具柄子叶及下胚轴 , 并去掉上面的顶端分生组
织 , 接种于 PM培养基上 , 预培养 2 d, 温度 (25 ±1) ℃, 16 h /8 h光周期。
挑取含有目的基因载体的农杆菌单菌落 , 置于含利福平 50 mg·L - 1和卡那霉素 100 mg·L - 1的
YEP培养基中 , 在 28 ℃下 , 280 r·m in - 1的摇床上振荡过夜培养 , 当 OD600值达到 016～018时 ,
5 000 r·m in - 1、4 ℃下离心 10 m in, 收集细菌 , 用 MS0培养基悬浮。
113　遗传转化
取在 PM培养基上预培养 2 d的具柄子叶和下胚轴 , 将其浸入农杆菌悬浮液中 , 8～15 m in后取
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　8期 崔 　磊等 : B t cry1 Ia8抗虫基因对结球甘蓝的转化及其表达 　
出 , 吸干多余的菌液后置于铺放一层无菌滤纸的 PM培养基上 , 25 ℃下暗培养 2 d。将外植体用 MS0
培养基洗涤后 , 置于 SM培养基中 , 每 2周换 1次培养基 , 培养 40～60 d。当卡那霉素抗性芽长至
1～2 cm后切下 , 转入诱导生根的 RM培养基中直至形成完整植株。选取其中根系较发达的植株经过
1～2 d炼苗后 , 移入营养钵中 , 于温室条件下生长。同样培养条件下未经农杆菌转化的甘蓝植株作
为阴性对照。
114　转化植株检测
PCR检测 : 以甘蓝转化植株和对照植株的总 DNA为模板 , 根据 cry1 Ia8基因设计 PCR扩增引物 ,
其上游序列为 5′2AGCCGTTTGTTAGTGCCT23′, 下游序列为 5′2ACTTGGATGCGGATGGAC23′, 由上海生
工公司合成 , 预扩增片段大小为 769 bp; 反应程序为 : 94 ℃ 4 m in; 94 ℃ 60 s, 55 ℃ 60 s, 72 ℃ 90
s, 30次循环 ; 72 ℃ 10 m in。PCR扩增产物用浓度为 1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
Southern blot检测 : 试验步骤参照 Sambrook等 (1989) 的方法。用 H ind Ⅲ酶切约 15μg左右的
甘蓝基因组 DNA, 37 ℃温育过夜 , 在浓度为 1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分离 , 用 20 ×SSC过夜转
膜 , 于 120 ℃下固定 30 m in, 杂交过夜 , 利用地高辛试剂盒 (Roche公司 ) 标记含目的基因质粒 DNA
的 PCR产物作探针过夜杂交 , 再进行洗膜、显色、定影。
RT2PCR检测 : 甘蓝转化植株总 RNA的提取参照 TaKaRa公司试剂盒进行。用 DNase Ⅰ处理获得
的 RNA样品逆转录合成 cDNA的第一链 , 进行 PCR扩增。 cry1 Ia8和内对照β2actin的扩增引物分别
为 : cry1 Ia8 上游序列 : 5′2CAAAGCACTTACCGACCTC23′; cry1 Ia8 下游序列 : 5′2CATTGACAGGGT2
GAGTGAGGA23′; β2actin 上 游 序 列 : 5′2ATCTGGCATCACACTTTCTAC23′; β2actin 下 游 序 列 : 5′2
ATCTCTTTGCTCATACGGTCT23′。 cry1 Ia8引物预扩增片段大小为 893 bp , β2actin引物的预扩增片段大
小为 697 bp, 逆转录合成 cDNA样品的 PCR扩增反应条件与 PCR检测中的相同。
W estern blot检测 : 用 Tris缓冲液提取甘蓝转化植株和非转化植株的可溶性总蛋白进行免疫杂交。
蛋白样品经 SDS2PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 , 然后将蛋白转移至 PVDF膜上 , 用 BSA过夜封闭 ,
先加入一抗 (中国农业科学院植物保护研究所提供 ) , 工作浓度为 1∶5 000, 洗膜 , 再加入二抗 (购
于 Sigma公司 ) , 工作浓度为 1∶20 000, 洗膜 , 最后显色 , 定影。AP的反应底物为氯化硝基四氮唑蓝
(NBT) 和 5 -溴 - 4 -氯 - 3 -吲哚磷酸甲苯胺蓝 (BC IP)。
转基因植株的抗虫性测定 : 采用室内离体叶片饲喂法 , 取苗期转基因植株及对照植株相同部位
的、直径为 4 cm的叶片 , 分别置于 9 cm的培养皿中 , 内放 1张湿滤纸以保持适宜的湿度 , 每个培养
皿中接二龄小菜蛾幼虫 10头 , 虫体大小尽量一致 , 每个植株设 3次重复。将其置于光照培养箱中 ,
(25 ±1) ℃下 , 16 h /8 h光周期。每 3 d更换 1次叶片 , 每天调查死虫数和活虫数 , 并在第 1天试验
开始时和第 6天试验结束时称量活虫质量 , 虫体称量使用万分位电子天平 , 采用差减法 , 即先称取培
养皿的质量 m1 , 将幼虫放入培养皿中称取的质量为 m2 , 每头幼虫的质量为 m2 - m1。
相对增长率 ( % ) =终虫质量 /初虫质量 ×100; 幼虫死亡率 ( % ) =死虫数 /接虫总数 ×100; 幼
虫校正死亡率 ( % ) = (转化组死亡率 -对照组死亡率 ) / (1 -对照组死亡率 ) ×100。
2　结果与分析
211　甘蓝转基因植株的获得
共获得了 38株抗卡那霉素的 T0代植株 , 不同时期的甘蓝转化体见图版 , Ⅰ。初步试验表明 ,
CA2123的下胚轴与 CB2425的具柄子叶为较好的遗传转化材料 , 在进行 cry1 Ia8基因转化试验中发现 ,
不同材料和外植体的转化效率有明显的差异 (表 2)。对获得的甘蓝卡那霉素抗性植株进行统计 , 不
同材料所获得的转化频率为 2148% ～1016%。因此 , 在进行基因转化试验前 , 应该先对植物不同的
基因型和外植体的遗传转化能力进行筛选。
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表 2　不同基因型及外植体对甘蓝转化效率的影响
Table 2　 Effect of d ifferen t genotypes and explan ts on the tran sforma tion of cabbage
基因型
Genotype
外植体类型
Type of exp lants
外植体数
Nnmber of exp lants
再生芽数
Nnmber of transformed shoots
转化频率 /%
Transformation frequency
CA2123 具柄子叶 363 9 2148 c
Cotyledon with petiole
下胚轴 Hypocotyl 268 15 5160 b
CB2425 具柄子叶 160 17 10163 a
Cotyledon with petiole
下胚轴 Hypocotyl 236 8 3139 c
212　转基因植株的 PCR检测
以甘蓝转化植株的基因组 DNA为模板 , 经 PCR扩增检测 , 部分抗性植株得到了约 769 bp的特异
带 (5～13) (图 1) , 与阳性对照质粒 pCSIaN的扩增结果一致 , 阴性对照没有特异性扩增条带。PCR
检测结果初步表明 cry1 Ia8基因已整合到受体基因组中。
图 1　甘蓝转化植株的 PCR检测
1. Marker; 2. 阳性对照 ; 3. 阴性对照 ; 4～13. 甘蓝转化植株。
F ig. 1　PCR ana lysis of tran sgen ic plan ts
1. Marker; 2. Plasm id DNA as positive control; 3. Negative control;
4 - 13. Transgenic p lants.
213　转基因植株的 Southern blot检测
挑选 9株 PCR 阳性的甘蓝转化植株 , 提取基因组总 DNA , 用地高辛试剂盒标记探针 , 进行
Southern blot检测分析 , 结果表明 , 3～11植株均出现了杂交信号 , 同时由杂交条带数可以看出
cry1 Ia8基因插入植物基因组中的拷贝数分别为 2、1、1、1、1、2、2、1、1 (图 2)。
图 2　甘蓝转化植株的 Southern blot检测
1. 阳性对照 ; 2. 阴性对照 ; 3～11. 甘蓝转化植株。
F ig. 2　 Southern blot ana lysis of tran sgen ic plan ts
1. Positve control; 2. Negative control; 3 - 11. Transgenic p lants.
214　转基因植株的 RT2PCR检测
取 Southern blot为阳性的 9株转化植株 , 进行 RT2PCR检测。结果阴性对照和转化植株均有 697
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bp (内对照β2actin) 的条带产生 , 而阳性对照和转化植株除具有内对照条带外还产生了 893 bp的目
的片段 , 但 B1728却没有获得目的条带 , 这可能是由于目的基因插入非表达区或因多拷贝而导致基因
沉默所致。RT2PCR检测结果表明 , 目的基因在转录水平上得到了表达。
图 3　甘蓝转化植株的 RT2PCR检测
1. Marker; 2. 阳性对照 ; 3. 阴性对照 ; 4～12. 甘蓝转化植株。
F ig. 3　RT2PCR ana lysis of tran sgen ic plan ts
1. Marker; 2. Plasm id DNA as positive control; 3. Negative control; 4 - 12. Transgenic p lants.
215　转基因植株的 W estern blot检测
取 Southern blot和 RT2PCR为阳性的植株 , 提取其叶片的可溶性总蛋白 , 进行 W estern blot检测。
结果显示转基因植株在 75 kD处有明显的杂交条带 , 而非转基因植株则没有 (图 4)。
Cry1 Ia8蛋白的分子量约为 81 kD, 其在甘蓝和大肠杆菌中表达的分子量约为 75 kD , 这可能是由
于 cry1 Ia8基因在 B t自然菌株体外表达的蛋白不能形成正确的折叠或对蛋白酶敏感而部分降解 , 从而
造成分子量的差异。
图 4　转基因甘蓝植株的 W estern blot检测
1. 预染蛋白 marker; 2. 阳性对照 ; 3～9. 转基因植株 ; 10. 阴性对照。
F ig. 4　W estern blot ana lysis of tran sgen ic cabbage
1. Prestained marker; 2. Positive control; 3 - 9. Transgenic p lants; 10. Negative control.
216　抗虫性鉴定
21611　饲喂敏感小菜蛾结果分析 　
用转基因植株与对照植株的离体叶片饲喂敏感小菜蛾的二龄幼虫。发现饲喂 6 d后 , 转基因植株
A1423、A1425、A1426、A1427、A1428、A1429和 A14212均表现出明显的抗虫性 , 其叶片仅被取食几
个小孔后幼虫即死亡 , 受试小菜蛾幼虫的校正死亡率在 91138% ～100% (表 3) , 但 B1728却表现不
抗虫 , 这与其 RT2PCR的阴性结果相对应。对照植株的叶片对小菜蛾没有抗虫作用 , 试验结束时只留
下叶脉和极少量的叶片 (图版 , Ⅱ)。
21612　饲喂抗性小菜蛾结果分析 　
用转基因植株和对照植株的离体叶片饲喂 Cry1Ac蛋白抗性小菜蛾的二龄幼虫 , 生物测定结果表
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明 : 取食转化植株 A1425, A1426, A14212的害虫的校正死亡率为 88189% ～96130% , 说明其对抗性
小菜蛾具有较强的抗性 ; 而取食转化植株 A14210的小菜蛾的校正死亡率为 33133% , 表明其对抗性
小菜蛾具有部分抗性 (表 3)。而对照叶片被大量取食 , 显示不抗虫 (图版 , Ⅱ)。
表 3　甘蓝转基因植株离体叶片对小菜蛾幼虫生物测定的结果
Table 3　 B ioa ssay results of the tran sgen ic cabbage aga in st P lu tella xylostella larvae
小菜蛾种群
DBM strain
植株编号
Plant code
初始虫质量 /mg
Initial weight
of larvae
最终虫质量 /mg
Final weight
of larvae
相对增长率 / %
Relative growth
rate of weight
校正死亡率 /%
Corrected mortality
敏感小菜蛾 CA2123 (对照 Control) 0184 4170 559 a 0 a
DBM suscep tible to Cry1Ac A1423 0192 - 0 b 96155 b
A1425 0174 - 0 b 100100 b
A1426 0165 - 0 b 95169 b
A1427 0159 - 0 b 100100 b
A1428 0145 - 0 b 100100 b
A1429 0171 - 0 b 91138 b
A14212 0164 - 0 b 100100 b
CB2425 (对照 Control) 0171 3198 560 a 0 a
B1728 0140 2149 620 a - 7140 a
抗性小菜蛾 CA2123 (对照 Control) 0162 3168 594 a 0 a
DBM resistant to Cry1Ac A1425 0175 - 0 b 88189 c
A1426 0179 - 0 b 96130 c
A14210 0186 3185 448 a 33133 b
A14212 0152 - 0 b 92159 c
　　注 : 同列数据后不同字母 , 表示邓肯氏新复极差法测验差异显著 ( P < 0105) , “ - ” 表示小菜蛾死亡 , 未测。
Note: D ifferent letters in the same column indicate statistically significant difference at P < 0105, ‘ - ’means there is no data for the death
of DBM.
3　讨论
本研究中通过农杆菌介导法建立了甘蓝遗传转化体系 , 并获得了 B t cry1 Ia8基因转化甘蓝的 T0代
植株 ; 进行了较为系统的分子检测 , 从 DNA水平证明 cry1 Ia8基因已经整合到甘蓝的基因组中 , 并在
RNA、蛋白质的水平上得到了表达 ; 抗虫性试验结果表明 , 部分转基因植株对敏感和抗性小菜蛾都具
有一定的抗性。
获得的 cry1 Ia8基因转化植株离体叶片的生物测定表明 , 大部分转化植株都具有较强的抗虫性 ,
但也有部分植株的抗虫性有一定差异 , 与其他人的研究结果类似 (Cao & Earle, 1999) , 这可能与外
源基因整合位点的随机性以及整合后的基因沉默有关 (Matzke et al. , 1994)。因此部分植株虽然在
DNA水平上整合到了基因组中 , 但是在 RNA及蛋白质水平上并没有表达。
Cry1 I蛋白是一组特殊的 Cry1类蛋白 , 分子量约为 81 kD , 而一般 Cry1类蛋白的大小为 130 kD。
目前已经发现了 6种 Cry1 I蛋白 , 分别为 Cry1 Ia、Cry1 Ib、Cry1 Ic、Cry1 Id、Cry1 Ie、Cry1 If, 而它们各
自又包含多种蛋白 , 例如 Cry1 Ia含有 16 种蛋白 ( Cry1 Ia1, Cry1 Ia2, ⋯ Cry1 Ia8 等 ) ( http: / /
www1 lifesci1Sussex1ac1uk /home /Neil2Crickmore /B t)。
Cry1A类蛋白为常用的微生物杀虫制剂 , 已经在实验室和田间发现小菜蛾对其产生了抗药性
( Tabashnik et al. , 2008) ; 而 Cry1 Ia8蛋白与 Cry1A类没有同源性 , 小菜蛾对 Cry1A类和 Cry1 Ia类蛋
白没有交互抗性。蛋白杀虫活性测验表明 : Cry1 Ia8蛋白对玉米螟的毒性与已经商业化的转基因玉米
Cry1Ab相当 , 对小菜蛾的毒性与 Cry1Ac相近 (窦黎明 等 , 2007 )。本试验分别对敏感小菜蛾和
Cry1Ac抗性小菜蛾进行了离体生物测定 , 转基因植株不仅对敏感小菜蛾表现了高效的抗虫作用 , 而
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且对 Cry1Ac抗性小菜蛾也有较强的抗虫性。试验还发现 , Cry1 Ia8蛋白对敏感小菜蛾和抗性小菜蛾的
抗虫性有一定的差异 , 饲喂的敏感小菜蛾第 2天绝大多数出现僵化 , 死亡现象 , 后期全部死亡 ; 而饲
喂的抗性小菜蛾第 2天有少量存活 , 但基本停止生长 , 后期多数僵化 , 死亡。因此 , cry1 Ia8基因对扩
大 B t杀虫谱 , 延缓小菜蛾等害虫抗性的产生具有重要意义。
本研究中所使用的转化受体材料为性状优良的甘蓝高代自交系 , 所获得的转基因植株经自交筛选
得到的抗虫材料可直接用于甘蓝抗虫品种的配制。但由于外源基因的插入位点具有随机性 , cry1 Ia8
基因在后代中的表达和抗虫性还有待于进一步的研究。
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