全 文 ：园 艺 学 报 , 一
材 凡
利用茎尖离体嫁接获得大蒜体细胞嵌合体
徐启江‘ , 陈青奇 , 陈 典
‘
’东北林业大学生命科学学院
,
哈尔滨 。 东北农业大学园艺学院 , 哈尔滨 巧 ’ 哈尔滨市农业科学院
,
哈尔滨
摘 要 以 ‘ 阿城紫皮 ’ 大蒜和日本 ‘ 福地六瓣 ’ 白皮大蒜鳞茎茎尖为接穗 、 鳞茎盘为砧木 , 利用离
体茎尖微体嫁接技术 , 研究了大蒜体细胞嵌合体的培育 , 用 分子标记技术进行了嵌合体的鉴定 。 结
果表明 最佳生芽培养基为
· 一 ’ 十 · 一 ‘ 最佳生根培养基为 十
· 一 ’。 嫁接成活率达 一 。 利用引物 一 鉴定表明 , 白 紫
、
白
·
紫 紫 、 白
·
紫
白
、
紫 白 种嫁接方式获得了嵌合体。 利用引物 一 鉴定表明 , 紫 白嫁接方式获得了嵌合体 , 而引
物 一 鉴定未能检测出亲本与嫁接苗之间的差异
关键词 大蒜 离体 嫁接 嵌合体
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 刁 刁
杨汁 · ·
瓦
一 ’ , 一 ’
·
,
, 。 , ’
’ 聊 乙诉 心
, 人 凡 、 即 打, , , , 占 , 邵 , 此
邵 陇
, 占 , , 一 , 。 ’价 , 山叫 注 二 , 动 , 以
动“ ‘ 印 ’ ‘ ’
一
· 一 ’
· 一 , · 一 盯
, 一
, , , 甲 甲 , 甲 ,
印 , 一 一
印 一
‘,
大蒜 在 自然条件下不发生有性杂交过程 , 其遗传变异多源于 自然突变和驯
化演变 , 导致其遗传背景狭窄 , 新品种选育困难 。 世界各地因不同的生态环境和进化途径而形成了遗
传背景不同的大蒜种质资源 , 但因不能进行有性杂交 , 而无法利用这些丰富的遗传多样性培育优良新
品种 。
国外大蒜育性研究及杂交育种尚处于探索试验阶段 , 我国也只有徐培文等 , 对大
收稿 日期 一 一 修回 日期 一 一
基金项 目 黑龙江省 ‘ 十五 ’ 攻关项 目
通讯作者 卜‘, 」
,
,
一 。
‘
, , 。 ,
园 艺 学 报 卷
蒜有性胚培养成功的报道 。 作者针对大蒜育种上的实际困难 , 将嫁接技术与体细胞杂交
、
原生质体融
合技术原理结合起来 , 以大蒜鳞茎茎尖为外植体 , 进行体细胞嵌合体的培育 , 以期为大蒜新品种选育
提供新的途径 。
材料与方法
供试材料为中国 ‘ 阿城紫皮 ’ 大蒜和 日本 ‘ 福地六瓣 ’ 白皮大蒜 。
选用健康无病的蒜瓣 , 冲洗干净 , 切除顶部 , 用 次氯酸钠溶液浸泡杀菌消毒 , 置
于超净工作台上用无菌水冲洗 次 , 无菌滤纸吸干水分 , 双 目解剖镜下剥取约 的茎尖 , 保留
厚约为 的鳞茎盘 , 作为砧木备用 。 将剥离的茎尖纵切一分为二 , 每个品
种各取一半茎尖结合在一起作为接穗 , 用解剖刀在鳞茎盘中央划一 “ 十 ” 字形 , 用镊子将茎尖结合
体植人鳞茎盘 , 或将每个品种的完整茎尖作为接穗植人鳞茎盘 , 然后接种到各种培养基上培养 。 共有
种嫁接类型 , 即白 茎尖 白 鳞茎盘
、
白
·
紫 茎尖结合体 紫 鳞茎盘
、
白
·
紫 茎尖
结合体 白 鳞茎盘
、
白 茎尖 紫 鳞茎盘
、
紫 茎尖 白 鳞茎盘
、
紫 茎尖 紫
鳞茎盘 , 将两个品种的完整茎尖直接接种在培养基上作为对照 。
基本培养基为 , 添加蔗糖 , 琼脂 , 调 值至 。 启始培养基为
· 一 ’ 或
、 、 、 · 一 ’ , 共 个处理 。 生根培养基为 和 ,
附加
、 和
· 一 ’。 培养温度 士 ℃ , 光照强度 林
· 一 ·
,
一 ’ , 光照时
间
· 一 ’。 待初生茎尖组培苗长至 一 时 , 选取由嫁接茎尖长成的幼苗于超净工作台内切除
其顶部 , 保留基部 切段 , 转人生根培养基上进行生根培养
选择生长健壮 、 根系发达的各处理试管苗 , 打开封 口 膜 , 室内低温炼苗 一 , 然后移植到
的塑料营养钵中 , 在自然光照条件下 , 白天 一 ℃ , 夜间 一 ℃的温室内进行驯
化 。 时统计成活率 , 将成活的秧苗定植于冷床内。
取嫁接成活植株的嫩叶采用 法 王关林和方宏箔 , 进行基因组 的提取 , 利用
引物 一 忆 竹
一 ‘ 一 气 一 ‘ 一 气
’ 徐培文 等 , 对试管苗进行嵌合体鉴定 。
通过预备试验 , 确定了最佳 反应体系 模板 。
、 义 林 、 , ‘
· 一 林 、 · 一 ’ 各 林 , 引物
· 一 ’ 林 、 几、酶
· 林 一 ’ 协 , 加灭菌蒸馏水至 总体积为 林 。 扩增反应在 一 型 仪上进行 ,
℃预变性 , 随后 个循环 , 每循环 ℃ 变性 , ℃退火 , ℃ 延伸 , 完成
最后一个循环后 , ℃ 延伸 。 扩增产物在 琼脂糖凝胶 含澳化乙锭 此
· 一 ’ 中
以
· 一 ’的电压电泳分离 , 经全 自动凝胶成像系统 。 。 照相
、
记录 。
结果与分析
外植体的启始培养
茎尖外植体接种 后 , 均产生明显浅绿色芽点 , 继而 长成绿色小芽 图 ,
、 , 其中 ‘ 阿
城紫皮 ’ 大蒜和 日本 ‘ 福地六瓣 ’ 白皮大蒜两个品种的茎尖结合体中每一半茎尖均能生长形成芽点 。
随着培养时间的延长 , 部分绿色芽点逐渐变成白褐色 , 最终死亡 。 在培养过程中 , 砧木鳞茎盘表现出
种状态 色泽由白转绿 , 形成愈伤组织 , 与嫁接的茎尖分离 , 最后茎尖因不能吸收养分死亡
保持白色 , 与茎尖紧密结合直到继代 , 可为茎尖分化生长提供营养 色泽变褐 , 最终与茎
尖一同枯死 。
在
· 一 ’浓度的条件下 , 随着添加 浓度的升高嫁接成活率提高 , 当 浓度为
期 徐启江等 利用茎尖离体嫁接获得大蒜体细胞嵌合体的研究
· 一 ’时 , 各嫁接类型外植体成苗率均达到最高值 , 之后随着 浓度的升高 , 嫁接外植体的成活
率普遍降低 。 在
· 一 ’浓度的条件下 , 随着 浓度的升高嫁接成活率也表现升高的趋
当 浓度为
· 一 ’时 , 各嫁接类型外植体成苗率均达到最高值 , 之后随着 浓度的升
嫁接外植体的成活率普遍降低 。 在 和 浓度相同的条件下 , 诱导外植体成活率均高于
势高
图 茎尖组培苗
、 正常茎尖外植体在 十
· 一 ’ · 一 ’培养基上形成试管苗
、 正常试管苗在
· 一 ’ · 一 ’培养基上的生根状况
、 靠接茎尖外植体在
· 一 ’十 · 一 ’培养基上形成试管苗
、
靠接试管苗在
· 一 ’ · 一 ’培养基上生根
嫁接试管苗驯化移栽成活的再生植株 。
心 · 讲
, 石 叱
· 一 · 一
, 目 · 一 一 · 一 ,
, 一 · 一 ’ · 一 ’
, 、 “ 哪
· 一 ’ · 一 ’
一
园 艺 学 报 卷
· 一 ‘ · 一 ’培养基为微体嫁接外植体的最佳起始培养基 , 培养
后 , 完整茎尖直接接种到培养基上 , 成芽率可达 完整茎尖植人鳞茎盘后再接种到培养基上 ,
成芽率可达 一 两品种茎尖结合体植人鳞茎盘后再接种到培养基上 , 成芽率可达
一 表 试管苗生长健壮 图 , 、 。
表 嫁接方式与植物激素对大蒜茎尖组培成苗率的影响
伪 招 叨 叨 助
由加肠 ·
茎尖 鳞茎盘 接种数 刀
· 一
,
· 一
,
一 灯
白 的
白 白
白
·
紫 紫
· 印 印
白
·
紫 白
· 甲 矶
白 紫从币 “ 印
紫 白 甲
紫 紫 甲 甲 阶
紫 甲 印
在培养基相同的条件下 , 直接将完整茎尖接种到培养基的处理 , 其成苗率显著高于嫁接处理 , 而完
整茎尖植人鳞茎盘处理的成苗率显著高于茎尖结合体嫁接处理的成苗率 , 可能的原因 一是茎尖靠接不
紧密 二是茎尖结合体与鳞茎盘接穗结合不紧密 , 鳞茎盘成为茎尖结合体从培养基中吸收养分的屏障。
根的诱导
将各嫁接方式获得的试管苗切割 , 保留基部 切段 , 转接到生根培养基上 , 诱导生根 ,
后观察生根情况 。 结果显示 试管苗切段在 种培养基上均可生根 表 , 但 浓度相同情况下
的 培养基比 培养基更有利于苗和根的分化生长 , 表现在根诱导率高 、 分根数多 。 其原因
是 , 由于大量元素减半 , 特别是 元素减半 , 增加了培养基的 比 , 从而提高了试管苗的根冠比
口 , 柑 。 说明培养基中无机盐含量对根苗的分化生长有明显的影响 , 较少量的无机盐更有
利于根的分化生长 。 浓度过高会抑制生根 , 且在苗基部形成愈伤组织 。
大量元素减半并添加适宜浓度
· 一 ’ 的 能诱导根系早生快发 , 根粗而多 , 根
系发达 , 根毛多 , 地上部生长健壮 , 叶色浓绿 , 植株整齐一致 , 地上部与地下部能协调生长 图 ,
、 、 、 。
基本培养基
· 一 ’
不同培养基对大蒜试管苗生根的影响
七 肠 招 月兔 心 皿
接种无根苗数 生根率
《洲〕
注 次重复接种无根苗总数 同列内不同字母表示在 水平上差异显著。
酬 即讯
期 徐启江等 利用茎尖离体嫁接获得大蒜体细胞嵌合体的研究
炼苗与移栽
将根系发达
、
生长健壮的试管苗移出培养室 , 打开封口膜 , 于 ℃低温下炼苗 一 。 然后洗
净根系附着的琼脂 , 移植到 营养钵中
,
移植基质为 乃 草炭土
、
大田土 、 厩肥并
添加少量过筛炉灰渣 浇足水后置于温室中管理 , 成活率为 。 幼苗长至 一 片真叶后移栽到
冷床中 , 植株能很好地适应外界环境条件 , 生长势强 图 , 。
嵌合体的 鉴定
以嫁接获得的植株的基因组 为模板 , 对微体嫁接获得的植株进行 分子标记鉴定 。
在引物 一 扩增的带型中 , 白 、 白 白完全相同 紫
、
紫 紫完全相同 , 说明该引物能够检测
本试验所选紫皮蒜和白皮蒜亲缘关系的远近 白 紫
、
白
·
紫 紫
、
白
·
紫 白
、
紫 白明显出现扩增片
段减少现象 , 即位于 一 之间的两条带缺失 , 而以白皮品种基因组 为模板扩增出约
的特异条带 , 在由白 紫
、
白
·
紫 紫两种嫁接方式获得的组培苗中缺失 而 以白
·
紫 白
、
紫 白两种嫁接方式获得的组培苗的基因组 为模板仍能扩增出这一特异条带 , 初步证实这两种嫁
接方式获得了嵌合体 图 , 。
在引物 一 扩增的带型中 , 只有紫 白出现多扩增一条长度约 帅 的谱带 , 其余样品的带
型相同 图 , 。
而引物 一 未能检测出亲本之间以及亲本与茎尖微体嫁接苗之间存在扩增条带的差异 图 ,
。
试验经 次重复均出现相同的带 , 初步证明是嫁接导致遗传变异 。
图 嵌合体的 、 鉴定
引物 一 扩增结果 引物 一 扩增结果 引物 一 扩增结果 。
白 白 自 白 紫 白
·
紫 紫
自
·
紫 白 紫 白 紫 紫 紫 。
加
一 飞 一
〔 一 皿 洲卫
·
, 一甲 · 甲
· 一甲
甲 一 〕 甲
、 鉴定结果初步表明 , 通过茎尖离体嫁接是获得大蒜体细胞嵌合体的一种途径 , 但 分
析的结果还有待于细胞学
、
植物学等方面特征的进一步验证 。
讨论
植物嵌合体是指两个或两个以上遗传型不 同的细胞或组织在同一器官的某一部位发生嵌合的现
象 , 通常可以通过不同品种间 、 种间或属间嫁接而获得 , 。 等
卷通过离体嫁接技术成功获得了甘蓝与萝 卜的属间嵌合体 , 但存在繁殖后代困难
、
嵌合体类型不稳定等
问题 。 由于大蒜属于无性繁殖作物
,
有性繁殖困难 , 获得的嵌合体材料可以通过组织培养技术进行大
量繁殖 。 本试验利用茎尖离体嫁接技术成功获得了嵌合体试管苗 , 但在相同培养条件下 , 不同嫁接方
式成苗率差异显著
,
在嫁接及起始培养技术环节上还有待于进一步探索与完善 。
体细胞杂种或嵌合体的鉴定方法有很多 , 但都有不足 。 形态学鉴定是根据植物的形态特征而对材
料进行鉴定 , 但因植株形态受到环境条件的影响而使鉴定准确性受到一定的影响 。 染色体计数可以准
确区分四倍体
、 二倍体和非整倍体 , 但不能区别同源与异源融合四倍体 。 同工酶标记鉴定则只能分析
基因转录
、 翻译
、
加工后的产物 , 间接推测基因的变化 , 检测位点较少 , 而且器官
、
部位
、
生理状
态
、 环境条件等均可能直接影响基因的表达 , 如果两亲本亲缘关系较近 , 同工酶分析更是难以发挥作
用 。
技术用作生物遗传分析 , 可检测出群体差异且具有快速
、
灵敏度高
、
特异性强的优势 。 茎
尖离体嫁接试管苗的 分子标记鉴定结果显示 , 与亲本相比出现扩增条带缺失 图 , 或产
生新的特异条带 图 , 的现象 , 这种差别表明茎尖离体嫁接试管苗的基因组 发生了变化 ,
而且是由于嫁接导致的变异
,
但变异的机制还有待于更深人的研究 。
, 一 一 、 一 一 、 一 , 一 、。· 化 , 一 一 。一
, 〔, 一 一 〔, 一
、
, , ,
一
,‘, , , 二 , 一
卜 , 一 , ,生 ‘。 一 、 、 。 , ‘ 、、斤 。。“甲‘, ‘ , ‘, , , ,“ 、 ￡‘, 、了人 , , 。 ,
,二 , 〕 。七 , 爵
, 一
一 , ‘ , , 确 , , ‘ 一 。。一 一 召斤‘、、 ‘ 。
, 一 一
二,」 一 , 一 , , 〔
、 〕 一 , 、。
王关林 , 方宏药 植物基因工程 第 版 北京 科学出版社 一
一 , 。一 , 一 , 。 一 ,
,
, 一
, 川 。 , 〕叮。, 。
· 、,
,
, 。
徐培文
,
崔德才 , 杨崇良 曲士松 , 刘冰江 , 王效睦 大蒜有性胚培养首次成功 生物技术通讯
, 巧
一
,卜 一 只, , 一 , 一 , , 一 , 、「、 , 卜 , 《 「 一 , 的
」
气 , 尽
〔夕 。川 ‘
· ‘ 。 。川 , 〔 、 , 、 , 。 〔, 、 , 一 。、
徐培文
,
曲士松
,
黄宝 勇
,
石谈景 , 刘恒英
,
张 杰
,
孙晋斌 , 宋洪平 应川 技术分析大蒜种质遗传特性和检了则蒜
种纯度的研究 山东农业科学
, 一
一 , 。, 一 , 一 , , , , 一 、 , 」 一 , , 卜 , , ,卜 , , 。川
。七 , 、, , 。。 。 , ‘
·
川 · , ,‘。 , 〔二 , 一 , , 。、。
徐培文 杨崇良 , 崔德才
,
曲士松 刘冰江
,
张君亭
,
张传坤 大蒜有性生殖技术研究初报 园艺”笋报
,