全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（8）：1329–1338
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–01–04；修回日期：2010–05–25
基金项目：中国博士后科学基金项目（2005037740）；江苏省博士后科学基金项目（0501030C）；南京农业大学青年启动基金项目（2003）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail: nnzsl@njau.edu.cn）
中国杏自交不亲和花粉特异 SFB 基因的鉴定与
序列分析
吴 俊 1，谷 超 1，张绍铃 1,*，张树军 1，宋宏峰 2，赵习平 3
（1南京农业大学园艺学院，南京 210095；2江苏省农业科学院园艺研究所，南京 210014；3河北省农林科学院石家
庄果树研究所，石家庄 050061）
摘 要：利用花粉 SFB 基因的同源扩增结合内切酶酶切的方法，在 9 个中国杏品种中首次克隆了 6
个花粉 SFB基因，对应花柱 S-RNase基因序号将其分别命名为 Par-SFB8、Par-SFB9、Par-SFB11、Par-SFB17、
Par-SFB23和 Par-SFB26，在 GenBank上的登录号分别为 EU652883、EU935588、EU652884、EU652885、
EU652886和 EU652887。序列分析表明杏的花粉 SFB基因具有蔷薇科李属植物 SFB基因的典型结构特征；
其内含子位于 5′端非翻译区，长度 90 ~ 108 bp，核苷酸序列的同源性为 63.9% ~ 93.3%。氨基酸序列的同
源性比较表明，杏花粉 SFB基因的种内同源性为 73.7% ~ 85.3%；与李属其他植物花粉 SFB基因的种间同
源性为 75.2% ~ 97.7%。利用特异 PCR扩增进一步确定了杏的 S9、S11、S17和 S26单元型花柱 S-RNase与花
粉 SFB基因间距离，表明花柱 S-RNase与花粉 SFB基因紧密连锁；同时组织特异性表达分析确定 SFB基
因在花粉组织中特异表达。以上结果说明获得的 SFB基因为杏的花粉候选 S基因。
关键词：杏；自交不亲和；花粉 SFB基因；克隆；序列
中图分类号：S 662.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）08-1329-10

Identification and Sequence Analysis of Pollen-sepecific SFB Genes in
Self-incompatible Chinese Apricot（Prunus armeniaca）
WU Jun1，GU Chao1，ZHANG Shao-ling1,*，ZHANG Shu-jun1，SONG Hong-feng2，and ZHAO Xi-ping3
（1College of Horticulture，Nanjng Agricultural University，Nanjing 210095，China；2Institute of Horticulture，Jiangsu
Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China；3Shijiazhuang Pomology Institute，Hebei Academy of
Agricultural and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050061，China）
Abstract：Six pollen-specific SFB genes were cloned by PCR amplification from nine cultivars of
apricot（Prunus armeniaca）native to China，these novel SFB genes were denoted as Par-SFB8，Par-SFB9，
Par-SFB11，Par-SFB17，Par-SFB23 and Par-SFB26 in corresponding to style-specific S-RNases，respec-
tively. The gene sequences were submitted to the GenBank and their accession number are EU652883，
EU935588，EU652884，EU652885，EU652886 and EU652887，respectively. The apricot SFB genes
showed similar structural characteristics to SFB genes of other Prunus species. Introns of SFBs were
located at 5′ terminal upstream of the initial codon，with intron lengths of 90–108 bp，and nucleotide
sequence homologies of 63.9%–93.3%. Based on amino acid sequence alignment，the similarity of SFB

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alleles ranged from 73.7% to 85.3% in P. armeniaca，and from 75.2% to 97.7% comparing with other
Prunus species. The intergenic distances for the S9，S11，S17 and S26 haplotypes were determined directly by
specific PCR amplification，implying that the two genes are physically linked in apricot. The SFB genes
are specifically expressed in pollen. All these evidence indicated that the SFB genes were good candidates
for pollen S-determinants in apricot.
Key words：Chinese apricot；self-incompatibility；pollen SFB genes；cloning；sequence

杏是我国北方地区果树生产的重要树种之一，为蔷薇科李属植物。与欧洲杏的多数品种表现自
交亲和截然不同，中国杏的大多数品种自花不实或结实率很低，表现严重的自交不亲和，已有研究
表明杏与蔷薇科的樱桃、李等其它核果类果树一样，为典型的配子体型自交不亲和（gametophytic
self-incompotibility，GSI）果树，该性状受单一基因座（S-locus）的复等位基因控制，在 S 基因座
中至少包括两个基因，即花柱 S基因与花粉 S基因，故又被称为 S单元型（S-haplotype）（McCubbin，
2000）。
相对于已开展的自交不亲和花柱 S基因克隆及表达产物 S-RNase的研究而言，关于花粉 S基因
的探索与研究比较滞后。在蔷薇科植物上开展的花粉 S候选基因研究，最先在核果类果树上获得突
破。Ushijima等（2003）首先在扁桃上克隆了在花粉中特异表达的，具有等位多样性的 SFB基因。
随后，Entani等（2003）在梅、Yamane等（2003a）在欧洲甜樱桃、Romero等（2004）在欧洲杏、
Yamane等（2003b）在酸樱桃、Zhang 等（2007）在中国李上也获得了表现专一序列多态性的花粉
S候选基因。花粉候选 S基因的获得为进一步探明 GSI植物花柱与花粉间相互识别的作用机制迈进
了一大步。
近年来，随着分子生物学技术的发展和应用，中国杏自交不亲和性研究取得了一定的进展，Qi
等（2005）利用等位 PCR扩增的方法鉴定了 5个杏品种的 S基因型；Zhang等（2008）在 16个中
国杏品种的基因型鉴定中发现了 10个新的 S-RNase基因；吴俊等（2008）鉴定了 11个中国杏品种
的 S基因型，并发现 6个新的 S-RNase基因。Chen等（2006）和 Feng等（2007）利用自交亲和的
‘凯特’杏与不亲和的中国杏杂交后代群体研究了自交（不）亲和的遗传特性。从已有报道来看，
对中国杏自交不亲和性研究主要集中在基于花柱 S-RNase的基因鉴定、克隆与遗传特性研究，对花
粉 S基因的研究尚未有报道。
本研究中以 9个中国杏品种为研究试材，利用李属植物花粉 SFB基因同源扩增结合内切酶分析
的方法鉴定不同花粉 SFB等位基因，并通过与花柱 S-RNase基因的连锁分析以及组织特异性表达确
定所克隆的 SFB基因为花粉 S候选基因。研究旨在进一步丰富 GSI植物花粉 S基因遗传信息，并为
深入探讨果树自交不亲和作用的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
9个中国杏品种由江苏省农业科学院和河北省农林科学院石家庄果树研究所提供，包括‘二红’
（S11/S9）、‘中华大杏梅’（S8/S9）、‘翼光’（S8/S9）、‘虹桥’（S11/S8）、‘超仁’（S11/S8）、
‘植丸子’（S11/S17）、‘宇宙红’（S17/S23）、‘大丰’（S17/S23）、‘黄口外’（S11/S26）（吴俊，
2008）。
2007年春季采集各品种幼嫩叶片进行基因组 DNA提取（吴俊，2008）。
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1.2 花粉SFB基因的等位PCR扩增
参照Zhang等（2007）设计的李花粉SFB基因的保守区引物PsSFB-F1/ PsSFB-R1，同时合成5′非
翻译区正向引物5′SFB-F（引物序列：5′-TTKSCHATTRYCAACCKCAAAAG-3′，由上海英骏生物技
术有限公司合成），组成5′SFB-F/ PsSFB-R1引物。利用两组引物对各品种进行扩增，PCR反应体系
为：DNA模板100 ng，2.0 µL 10 × Buffer，0.2 mmol · L-1 dNTP，0.5 µmol · L-1 正反向引物，1.5
mmol · L-1 MgCl2，1 U的Taq酶，ddH2O补足20 µL。反应程序参照Zhang等（2007）的方法。取PCR
产物5 µL，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增图谱。
1.3 花粉SFB等位基因PCR扩增产物的酶切检测
由于花粉SFB基因的内含子序列较短，因此需借助内切酶酶切扩增产物以筛选不同的等位基因。
将 SFB等位基因的扩增产物连接到 pMD19-T载体（大连宝生物公司）中，转化大肠杆菌 DH5α，随
机挑取 20 个以上阳性克隆，并使用花粉 SFB 基因相同的扩增引物和体系检测单克隆中是否插入目
的片段，再对菌液扩增产物进行内切酶酶切。选择的内切酶为 csp6I（Invitrogen，CA，USA），酶切
体系 8 µL：4 µL PCR产物；0.8 µL 10 × Buffer B；0.12 µL csp6I；3.1 µL ddH2O。37 ℃条件下 8 h，
用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。选择具有不同酶切谱带的对应单克隆菌液送英骏公司进行测序。
1.4 PCR扩增花粉SFB与花柱S-RNase基因间距
根据已知的花柱 S-RNase 基因中间片段序列信息设计 S8、S9、S11、S17、S23、S26的正向特异引
物，并以花粉 SFB 基因保守序列设计反向引物 Par-SFBF（序列：5′-CCAAGCAAGTTCTTGANA
CAGG-3′），扩增两基因间的片段。PCR 反应体系和反应程序同花粉 SFB 基因扩增。将扩增的特异
片段回收、克隆、测序，与已知序列结果比较，并确定两基因间的间距。
1.5 花粉SFB及花柱S-RNase基因的组织特异性表达
春季采集‘宇宙红’品种的叶片、花柱和花粉，分别提取各组织 RNA。以提取的 RNA为模板，
oligo（dT）16为引物，superscriptⅢ反转录酶合成 cDNA，作为 RT-PCR的模板。RT-PCR反转录总
体系为 20 µL：4 µL 5 × AMV Buffer，8 µL dNTP，0.5 U RNase inhabitor，0.5 µmol · L-1 oligo（dT）
16，10 U AMV，3.5 µL ddH2O，0.8 mmol · L-1RNA模板。反转录 PCR程序为 30 10 min℃ ；42 1 ℃
h；99 5 min℃ ；5 5 min℃ 。利用引物对 Pru-C2/ PCE-R（Tao et al.，1999）和 PsSFB-F1/PsSFB-R1
（Zhang et al.，2007）分别进行花柱 S-RNase基因和花粉 SFB基因组织特异性表达分析。同时以组
成型表达的 Actin基因为参照，ActF/ActR引物序列如下：ActF 5′-CAATGTGCCTGCCAT GTATG-3′；
ActR 5′-CCAGCAGCTTCCATTCCAAT-3′。
1.6 花粉SFB基因的序列分析及系统树构建
利用 BLAST将测序结果在 GenBank等数据库中进行比较，判断其是否为新的 SFB基因。利用
DNAMAN（version 5.2）软件进行序列同源性比较，并利用Mega3.1对蔷薇科植物的 SFB序列作多
重比较，以邻位相连法（neighbor-joining method）构建系统进化树。
比对已知 SFB基因及序列登录号分别为甜樱桃（Prunu avium）：Pa-SFB1（AB111518），Pa-SFB3
（AB096857），Pa-SFB4（AY649872）；扁桃（Prunus dulcis）：Pd-SFBb（AB092967），Pd-SFBd（AB081648），
Pd-SFBc（AB081587）；梅（Prunus mume）：Pm-SFB1（AB101440），Pm-SFB7（AB101441）；杏
（Prunus armeniaca）：Par-SFB2（AY587562），Par-SFB4（AY587565）；李（Prunus salicina）：Ps-SFBb
（AB252412），Ps-SFBc（DQ849084）；黑刺李（Prunus spinosa）：Pspi-SFB8（DQ677587），Pspi-SFB10
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（DQ677589）；梨（Pyrus pyrifolia）：PpSFBB4-alpha（AB270797），PpSFBB4-beta（AB270798），
PpSFBB4-gamma（AB270799），PpSFBB5-alpha（AB270800），PpSFBB5-beta（AB270801），
PpSFBB5-gamma（AB270802）；苹果（Malus × domestica）：Md-SFB3a（AB270795），Md-SFB9a（AB270793），
Md-SLFfb1（DQ422810），Md-SLFfb2（DQ422811）。
2 结果与分析
2.1 花粉SFB等位基因的鉴定
采用两组花粉 SFB基因保守引物，即 5′SFB-F/ PsSFB-R1和 PsSFB-F1/ PsSFB-R1，对 9个品种
的基因组 DNA进行 PCR扩增，均取得了很好的扩增效果。其中 5′SFB-F/ PsSFB-R1引物扩增范围
更大，如图 1所示，各品种在 1 200 bp左右处有亮带，片段大小与引物设计位置相符合，扩增区域
包括了 SFB基因的 95%以上的序列长度。
图 1 不同杏品种基因组 DNA的花粉 SFB基因 PCR扩增图谱
M. Marker；1. 二红；2. 中华大杏梅；3. 冀光；4. 虹桥；5. 超仁；6. 植丸子；7. 宇宙红；8. 大丰；9. 黄口外。
Fig. 1 PCR amplification of SFB from genomic DNA in different apricot cultivars
M. Marker；1. Erhong；2. Zhonghua Daxingmei；3. Jiguang；4. Hongqiao；5. Chaoren；6. Zhiwanzi；7. Yuzhouhong；8. Dafeng；9. Huangkouwai.

图 2为‘植丸子’（S11/S17）与‘超仁’（S8/S11）转化花粉 SFB等位基因不同单克隆 PCR产物
的 csp6Ⅰ酶切图谱，电泳结果显示每个品种中出现两种酶切谱带，这与每个品种含有 2个 S等位基
因是相符合的；且不同品种中相同的 S等位基因具有相同的酶切谱带，如‘植丸子’与‘超仁’均
具有基因型 S11，因此相同的酶切谱带应为 S11，序列测定的结果进一步证实两者为相同的等位基因。
采用同样的方法，通过多个品种酶切图谱比较分析以及序列测定，可以确定对应于花柱 S-RNase基
因的花粉 SFB等位基因。将所克隆的杏 SFB基因在 GenBank中进行 BLAST比较，所有序列均与已
登录的李属植物 SFB 等位基因表现高度同源性，因此获得的 6 个花粉 SFB 新基因，按相应于花柱
S-RNase的序号命名分别为：Par-SFB8、Par-SFB9、Par-SFB11、Par-SFB17、Par-SFB23和 Par-SFB26，
在GenBank上的登录号分别为EU652883、EU935588、EU652884、EU652885、EU652886和EU652887。
图 2 花粉 SFB等位基因的 csp6Ⅰ酶切图谱
M. Marker；1 ~ 7. 植丸子（S11/S17）SFB等位基因酶切谱带；8 ~ 14. 超仁（S8/S11）SFB等位基因酶切谱带。
Fig. 2 Digestion pattern of PCR amplification products of SFB with restriction endonuclease csp6Ⅰ
M. Marker；1–7. Digestion pattern of allelic gene，SFB11 and SFB17，in Zhiwanzi；
8–14. Digestion pattern of allelic gene，SFB8 and SFB11，in Chaoren.
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2.2 花粉SFB基因的序列结构特征分析
利用 DNAMAN软件对克隆的花粉 SFB基因进行序列及结构特征分析，推导氨基酸序列的比对
结果表明，所获得的杏花粉 SFB基因具有与其他蔷薇科李属植物花粉 SFB基因类似的结构特征，包
括 5′末端的 F-box结构域，两个变异区 V1、V2以及两个高变区 HVa和 HVb，其中 3个变异区位于
3′端，而另一变异区直接位于 F-box结构域下游（图 3），并且表现出 S单元型特异的序列多样性。
图 3 杏和李属其他种 SFB基因推导氨基酸序列的同源性比较
保守残基用星号“*”表示；保守区的替代用点表示；间隙用直线表示；下划线部分为 F-box，V1，V2，HVa和 HVb。
Fig. 3 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of SFBs from apricot and other Prunus species
Asterisks，dots and dashes indicate conserved amino acid residues，conservative substitutions and gaps，respectively，
F-box，V1，V2，HVa and HVb regions are underlined.

对获得的杏花粉 SFB基因分析确定其内含子位于 5′端翻译区之前，长度和序列多态性分析结果
表明，内含子长度在 90 ~ 108 bp之间，核苷酸序列的多态性为 63.9% ~ 93.3%。从序列结构来看，
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杏的花粉 SFB基因内含子 5′端保守结构序列多数为 TGAG（除了 SFB9、SFB11外）；3′端的保守序列
为 TWCAG。在内含子中存在相对保守的序列，即 TTCTGCAAAAAT 和 ATTATGA（暂命名为 IC1
和 IC2）分别位于内含子的 5′和 3′端（图 4）。

图 4 杏 SFB基因内含子的核苷酸序列比较
保守残基用星号“*”显示；间隙用直线表示；下划线部分为保守区域 IC1，IC2。
Fig. 4 Nucleotide sequences comparison of the SFB introns in apricot
Asterisks and dashes indicate conserved nucleotide sequences and gaps，respectively，
conserved regions，IC1 and IC2，are underlined.
2.3 花粉SFB基因与花柱S-RNase基因的连锁关系
为了进一步确定杏花粉 SFB基因与花柱 S-RNase基因的相对位置及连锁关系，本研究利用设计
的 6个 S-RNases基因正向特异引物与花粉 SFB基因的正向保守引物 Par-SFBF，直接扩增两基因间
距离，其中 S9、S11、S17、S26获得成功扩增，扩增目的片段测序结果与相对应的花粉 SFB基因、花
柱 S-RNase基因序列相吻合，4个 S单元型两基因终止密码子间距离为 299（S11）~ 1 061 bp（S17）
（图 5），由此可以确定杏的花柱 S-RNase与花粉 SFB基因是相连锁的；同时根据引物设计的方向，
图 5 4个 S单元型内花柱 S-RNase及花粉 SFB基因的位置图示
黑色及灰色的框分别代表 S位点基因的外显子与内含子；白色框代表 S-RNase和 SFB基因间距离；
所使用的引物位置通过箭头标出。
Fig. 5 Schematic representation of the S locus from four S-haplotype
Black boxes and gray boxes represent exons and introns of S-locus genes；White boxes represent the intergenic
region between S-RNase and SFB；The positions of the primers used are indicated by arrows.

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可以确定两基因是以相反的方向进行翻译的。通过两基因间序列的扩增，补充了S9、S11、S17、S26
花粉SFB基因3′末端序列信息，从而获得4个中国杏SFB基因的全长序列（图3中SFB9，SFB11，SFB17
和SFB26为全长）。同时设计的S8和S23单元型两基因间没有扩增，可能存在较大的基因间距。
2.4 花粉SFB基因及花柱S-RNase基因的组织特异性表达
以‘宇宙红’（S17/S23）品种基因组 DNA以及叶片、花柱、花粉的 cDNA为模板，利用花柱 S-RNase
基因保守引物 Pru-C2/PCE-R 和花粉的 SFB 基因保守引物 PsSFB-F1/PsSFBR1 进行组织表达分析，
同时以 ActF/ActR 引物扩增作为对照。图 6 所示，在基因组 DNA 以及叶片、花柱、花粉的反转录
cDNA模板中均有 Act基因扩增，且基因组扩增与反转录扩增大小不同，表明以上 3个组织的 RNA
反转录成功，并且不含有基因组 DNA。当使用 S-RNase基因保守引物进行扩增时，只有花柱 cDNA
和基因组 DNA获得 PCR扩增产物，电泳显示 cDNA模板扩增片段明显小于基因组扩增片段，并且
只有 1条谱带，不能揭示不同 S等位基因的长度多态性，这是由于扩增片段不包含内含子部分，外
显子大小相近，因而不能分辨不同的 S等位基因。当使用 SFB基因的保守引物进行扩增时，仅在花
粉的 cDNA和基因组 DNA模板中获得 PCR扩增产物，由于扩增区域不包括内含子，cDNA扩增片
段大小与基因组 DNA扩增结果相同。以上结果进一步证实了 S-RNase和 SFB基因具有组织表达特
异性，其分别在花柱和花粉组织中特异表达。
图 6 杏花柱 S-RNase和花粉 SFB基因的组织特异性表达
M：Marker；S：花柱 cDNA；P：花粉 cDNA；L：叶片 cDNA；G：基因组 DNA。
Fig. 6 Expression patterns of S-RNases and SFB in apricot
M. Marker；S，P and L indicate style，pollen and leaf RNA with reverse transcriptase，respectively；G is genomic DNA.

2.5 花粉SFB基因的同源比较及系统进化树构建
根据推导的氨基酸序列，对克隆的杏花粉 SFB 基因进行种内同源性比较，同源性在 73.7%
（Par-SFB23/ Par-SFB17）~ 85.3%（Par-SFB9/Par-SFB26）之间。种间同源性比较结果显示，杏花粉
SFB基因与苹果花粉 SFB基因同源性较低，仅为 22.5% ~ 25.0%；而与李属其他植物的花粉 SFB基
因同源性较高，相似系数在 75.2% ~ 97.9%之间，甚至出现种间的 SFB基因同源性超过种内同源性
的情况。例如杏的 SFB26与甜樱桃的 SFB6同源性为 97.2%，而种内同源性最高为 93.5%；杏的 SFB9
与樱花的 SFB8同源性为 97.9%，而种内同源性最高为 85.3%。利用 DNAMAN分别比较以上两组种
间同源性较高的花粉 SFB基因，发现仅存在少数氨基酸序列的差异，而 V1、V2、HVa、HVb序列
完全相同。
将获得的杏 SFB 基因推测氨基酸序列与已公布的蔷薇科植物花粉 SFB 基因氨基酸序列进行比
对，利用Mega3.1构建系统进化树。如图 7所示，本研究中鉴定的杏花粉 SFB基因与甜樱桃、梅、
李等其他蔷薇科李属植物 SFB聚为李亚科，但各树种间 SFB并没有出现明显的分离，而是相互渗透，
彼此交错；苹果亚科中则包括了苹果和梨的候选花粉 SFB等位基因，并与李属植物的 SFB具有一定
的遗传距离。

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图 7 蔷薇科植物花粉 SFB基因的系统进化树
Fig. 7 Phylogenetic tree of SFB genes in the Rosaceae
3 讨论
3.1 杏花粉SFB基因的鉴定
继玄参科植物金鱼草中报道了花粉 S基因（AhSLF）之后，在蔷薇科植物扁桃（Ushijima et al.，
2003）、梅（Entani et al.，2003）等果树上先后克隆了花粉 S候选基因（SFB/SLF）。最早公布的花粉
SFB基因均是通过 S位点的大片段测序获得的，随着近年来李属植物更多花粉 SFB基因的克隆，使
得利用同源序列扩增获得花粉 SFB 基因成为可能，并进一步应用于不同 S 等位基因的鉴定中。
Yamane等（2003c）曾利用花粉 SFB基因序列为探针进行基因组 DNA的杂交以确定梅的不同品种
S基因型。Vaughan等（2006）在对甜樱桃的花粉 SFB基因序列分析的基础上提出结合花粉 SFB基
因内含子以及花柱 S-RNase基因第一内含子的长度多态性，通过半自动测序荧光检测来鉴定不同的
S基因型。Kitashiba等（2007）利用花粉 SFB的 HVa区域的高度变异性设计特异探针，与 SFB的
PCR扩增产物进行点杂交，成功鉴定了李的 9个 S单元型以及甜樱桃的 10个 S单元型。但是上述
应用的试验方法涉及分子杂交、引物标记或特殊的检测设备等，步骤相对繁琐。本研究中采用了花
粉 SFB 基因的 PCR 扩增结合内切酶的酶切的方法，成功的鉴别了不同的 S 等位基因，相比较其操
作步骤简单，对设备条件的要求不高，更有利于实际应用。本试验成功获得了 6个新的杏花粉 SFB
基因，可见利用同源序列扩增确定不同花粉 SFB基因是成功的。
作为筛选自交不亲和花粉候选 S基因的 3个首要条件是：（1）与花柱 S-RNase相连锁；（2）具
有序列多态性；（3）在花粉中特异表达。本研究获得的 6 个杏花粉 SFB 基因间同源性为 73.7% ~
85.3%，表现出等位序列多样性。根据已克隆的杏不同 S单元型花柱 S-RNase和花粉 SFB基因部分
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序列信息，设计特异引物扩增两基因间距，成功获得了 4个 S单元型的基因间序列，从而证明了花
柱 S-RNase和花粉 SFB基因的连锁关系。同时组织特异性表达分析也证实了 S-RNase和 SFB基因仅
在花柱和花粉组织中特异表达。以上结果从多个层面支持了获得的 SFB基因为杏的花粉候选 S基因。
3.2 杏花粉SFB基因的序列结构分析
序列比较分析表明，本研究克隆的中国杏花粉 SFB基因具有类似于扁桃、甜樱桃、果梅等李属
植物花粉 S候选基因的序列结构特征，编码蛋白具有 F-box结构域、变异区 V1和 V2、以及高变区
HVa和 HVb。其中 3个变异区（HVa，HVb，和 V2）均靠近 3′端，已有研究认为，3′末端变异区在
识别自我与非自我 S-RNases中具有重要的作用。与花柱 S-RNases相比，不同花粉 SFB基因序列比
对结果表明其保守性较高，整个 SFB基因大约一半的氨基酸残基是保守或者仅仅是保守的替代，这
些保守的位点对于 SFB基因的结构和功能是重要的。例如，在 N末端区域许多保守的氨基酸残基属
于 F-box结构域，这对于形成 SGF复合体，通过泛素/26S蛋白酶体途径完成的蛋白质降解是非常重
要的（Ushijima et al.，2003）；其他的保守位点分散在 SFB分子中，对于 SFB的结构和功能起着同
样关键的作用。
对杏花粉 SFB基因的序列分析确定在其 5′非翻译区存在 1个内含子，这与已报道的扁桃、甜樱
桃等的花粉 SFB基因分析相一致的。与花柱 S-RNase基因中存在的两个内含子相比，杏的花粉 SFB
内含子长度较短且差异较小，因此基于其序列长度的多态性很难确定不同的 S等位基因。对内含子
的序列结构分析表明，其 5′及 3′端表现出与甜樱桃相似的保守序列和结构域（Vaughan et al.，2006），
这说明李属植物花粉 SFB基因不仅在翻译区高度同源，同时还具有相似的内含子结构特征，更加说
明了李属植物不同种间花粉 SFB基因的高度保守性。
3.3 杏花粉SFB基因的种间同源性比较
对克隆的杏花粉SFB基因的同源比较发现，其与李属其他植物的花粉SFB基因表现较高的同源
性，甚至超过种内的同源性。这一现象在其他李属植物的研究中也有报道（Ikeda et al.，2004；Zhang
et al.，2007）。聚类分析结果显示，鉴定的杏花粉SFBs基因与蔷薇科李属植物SFBs聚为一亚类，但
各树种间SFBs并没有出现明显的分离，而苹果的花粉SFBs基因则单独聚为一个亚类，并与李属植物
的SFBs具有一定的遗传距离，表明花粉SFB基因的进化是形成于亚科之后，种形成之前，这与花柱
S-RNase基因的同源比较结果（Ushijima et al.，1998）类似。为了进一步了解相应的花柱S-RNase间
相似性情况，本研究对高度同源的杏S9与樱花S8单元型进行了对比，两者花粉SFB基因的同源性为
97.9%，仅存在少数的氨基酸残基替代，对两者花柱S-RNases基因的比对有趣的发现在已知序列范围
内氨基酸序列完全相同，因樱花的S8-RNase 5′端近20个氨基酸序列未知，无法进行全长比较，但可
以肯定的是两者自C1至C5区域，包括位于其中的高变区，序列是完全一样的。在已有的蔷薇科李属
植物S单元型比较中，也曾发现不同种间的花柱S-RNases相同，而花粉SFB基因发生少数变化的现象。
Sutherland等（2008）发现扁桃的S11单元型与甜樱桃的S1单元型具有同样的S-RNases，而SFB11有11
个不同的残基，其中6个是非保守替代；同时与矮扁桃S8单元型S-RNase序列有1个氨基酸差别，并且
SFB序列有3个残基差别。因此，Sutherland等（2008）认为在不同种间具有同样的S-RNase，其存在
于李属的亚类分离之前，而同源的SFB经历了变异。但是更直接的证据应该来自相互杂交授粉试验
以确定S单元型的功能异同。在本研究中发现的种间高度同源的S单元型，将对我们进一步探讨李属
植物S单元型的演化关系提供宝贵的材料。


1338 园 艺 学 报 37卷
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