全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 847 - 852
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 03 - 19; 修回日 /期 : 2008 - 05 - 12
基金项目 : 广东省自然科学基金项目 (32293) ; 广东省科技攻关项目 (2006B20201028) ; 广州市科技攻关项目 (2005Z22E0071)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jjlei@ scau1edu1cn)
中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆及其转化辣椒
陈国菊 , 石　丽 , 雷建军 3 , 曹必好 , 曾国平
(华南农业大学园艺学院 , 广州 510642)
摘 　要 : 根据美洲商陆抗病毒蛋白基因序列设计引物 , 从中国商陆 ( Phytolacca acinosa) 叶片基因组
DNA扩增克隆缺失无毒型中国商陆抗病毒蛋白基因 ( PacPA P1) , 构建该基因植物表达载体 , 采用农杆菌
介导的叶盘法转化辣椒 , 对转基因植株进行分子检测 , TMV及 CMV人工接种鉴定 , 25 d后统计发病情况。
结果表明 : 克隆得到缺失无毒型 PA P基因 PacPA P1, 大小为 714 bp, 与美洲商陆抗病毒蛋白基因 ( Pam 2
PA P) 的同源性为 9917% ; 得到了 PacPAP1整合入辣椒基因组中的阳性植株 ; 接种 TMV、CMV的阴性对照
植株都明显发病 , 转 PacPAP1植株未出现症状 , 说明转基因辣椒植株可获得抗 TMV和 CMV材料。
关键词 : 辣椒 ; 中国商陆 ; 中国商陆抗病毒蛋白基因 ; 遗传转化
中图分类号 : S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620847206
C lon ing of Pokeweed An tiv ira l Prote in Gene from Phyto lacca ac inosa and Its
Tran sfer to Pepper ( C apsicum annuum L. )
CHEN Guo2ju, SH IL i, LE I J ian2jun3 , CAO B i2hao, and ZENG Guo2p ing
(College of Horticulture, South China A gricultura l U niversity, Guangzhou 510642, Ch ina)
Abstract: The aim of this study is to obtain transgenic pepper p lants resistant to TMV and CMV that
could be used in breeding new pepper variety with virus2resistant traits. The p rimers were designed based on
the sequences of PA P in Phytolacca am ericana to amp lify non2virulent defective PA P gene, PacPAP1 from ge2
nom ic DNA of leaves in Phy tolacca acinosa. The exp ression vectors was constructed and the PacPA P1 was
transferred into pepper ( Capsicum annuum L. ) by flam ingo bill mediated2A grobacterium. In the transgenic
p lants, the molecular test were done and resistance assay was performed at 25 d following artificial inoculation
with TMV or CMV. The results showed that the size of the isolated non2virulent defective PacPAP1 is 714 bp,
bearing 9917% identity with Pam PA P from Phytolacca am ericana. The accession numbers in GenBank is
AY603353. The transgenic pepper p lants were obtained with PacPA P1. The non2transgenic pepper p lants
were suscep tible to virus, no symp tom s were observed in the positive transgenic p lants. This suggests that
transgenic pepper p lant resistant to TMV and CMV can be obtained by transferring PacPAP1.
Key words: pepper; Phytolacca acinosa; pokeweed antiviral p rotein gene; genetic transformation
商陆抗病毒蛋白 (pokeweed antiviral p roteins, PAP) 是从商陆属 ( Phytolacca) 植物体内提取出来
的一种碱性蛋白 , 属于 Ⅰ型核糖体失活蛋白 ( ribosome2inactivating p rotein Ⅰ, R IP) , 对植物病毒、真
菌、细菌有一定的抑制作用 ( Irivin, 1975; Irivin et al. , 1980; Kung et al. , 1990; L in et al. , 1991;
Irivin & Uckun, 1992; Kataoka et al. , 1992)。纯化自美洲商陆叶片中的 PAP, 能抗 7种植物病毒
(Chen et al. , 1991)。在体外 , 该蛋白可以阻碍流感病毒复制 , 甚至对人体免疫缺陷型病毒 (H IV )
也有一定的抑制功能 ( Tom linson et al. , 1974; Zarling et al. , 1990)。
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通过基因工程获得的转 PA P基因植物 , 所抗病毒的种类也比较多。1993年 , Monsanton公司成功
地将 PA P基因转入烟草和马铃薯 , 使转基因植株及其后代获得了广谱的植物抗病毒活性 , 对机械传
播和蚜虫传播的多种病毒均有效 (Lodge et al. , 1993)。转 PA P基因烟草 ( Sm ironv et al. , 1997)、马
铃薯 (傅道林 等 , 2000)、甘蓝型油菜 (张海燕和党本元 , 1999) 等对病毒有明显的抗性。转 PA P
基因植株对某些真菌也有抗性 (W ang et al. , 1998)。Tumer等 (1998) 将编码 PAP的基因转入烟草
和马铃薯 , 获得了具有广谱性的工程植株 , 但发现转基因植株比正常植株矮小 , 而 Lodge等 (1993)
将 C末端缺失一部分的 PA P基因转入烟草时发现对 CMV、PVX、PVY病毒具有明显的抗性 , 植株能
正常生长。PAP的毒性活性区与寄主细胞的毒性区彼此分离 ( Tumer et al. , 1997) , 因此可以通过基
因改造 , 去其细胞毒性区而保留抗病毒活性区 , 即可发挥其实际利用价值。
本研究从中国商陆叶片中分离到只对病毒有抑制作用而不干扰寄主植物生长的缺失无毒型 Pac2
PA P1基因 , 利用农杆菌介导方法将其导入辣椒中 , 检测转基因植株对烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒
的抗性 , 以期获得抗 TMV和 CMV的转基因植株 , 为抗病毒病育种提供抗源。
1　材料与方法
111　试验材料
中国商陆 ( Phytolacca acinosa Roxb. ) 采自贵州毕节地区。辣椒 (Capsicum annuum L. ) 材料为
自交系 B04432323212222, 华南农业大学蔬菜系提供。大肠杆菌菌株 ( DH5α) 和农杆菌菌株
( EHA105)、植物表达载体 pB I121 [含 Kan (R ) 和 S tr (R ) 基因 ] 由本实验室保存。TMV、CMV毒
源为烟草幼苗感病叶片 , 由华南农业大学资源环境学院提供。
112　中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆及序列分析
取中国商陆叶片 , 用 CTAB法 (Murry et al. , 1980) 提取基因组 DNA。
根据 L in等 (1991) 以美洲商陆为材料分离的 Pam PA P序列及陈定虎等 ( 2002) 的研究结果 ,
设计出 N、C端缺失型 PA P基因扩增引物 , 并分别在引物两端引入两个限制性内切酶的酶切位点。
5′引物 P1: CC TCTAGA　CATATG GTGAATACAATCATCTACAA;
　　　　　　　　　 X baⅠ　　N deⅠ
3′引物 P2: AA GGTACC　GGATCC TCACCACTTGGCACCACTGG。
　　　　　　　　　KpnⅠ　　B am Ⅰ
以中国商陆基因组 DNA作为模板 , 进行 PCR扩增 , 优化 PCR条件。用上海生工生物工程有限公
司的回收试剂盒回收 PCR产物 , 再利用克隆载体 pMD182T ( TaKaRa公司 ) 连接 PCR产物 , 转化大
肠杆菌 E1coli DH5α菌株 , 在含氨苄青霉素及 X2gal的 LB固体培养基上筛选白色菌落酶切鉴定重组转
化子 , 将阳性克隆送上海生工测序。用 B lastn软件将克隆得到的基因进行相似性比较。
113　构建植物表达载体
提取上述纯化重组载体经 B am HⅠ和 XbaⅠ双酶切后 , 回收纯化目的片段 , 将其亚克隆入经过相
同酶切的植物双元表达载体 pB I121中。转化感受态大肠杆菌 DH5α后 , 利用卡那霉素筛选阳性克隆 ,
先进行单菌落 PCR鉴定 , 然后抽提重组质粒用 B am HⅠ + X baⅠ双酶切鉴定。
将经过酶切鉴定的重组体从 DH5α中提取纯化后 , 再转化感受态根癌农杆菌菌株 EHA105, 涂布
在含有链霉素和卡那霉素的 YEB平板上 , 待单菌落长出后 , 挑取单菌落 , 先用 PCR法快速鉴定 , 再
裂解 EHA105, 提取纯化重组质粒 , 以此重组体作为模板 , 用 P1和 P2引物扩增目的基因进行鉴定。
114　农杆菌介导的辣椒遗传转化
将辣椒无菌苗的根和一侧子叶从叶柄基部连同顶芽及周围分生组织全部切去 , 只留一侧子叶及下
胚轴作为外植体 , 平放于培养皿或培养瓶中 , 黑暗中预培养 2～3 d, 培养基为 MS + 62BA 210 mg·
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L - 1 + IAA 012～015 mg·L - 1 +AS 100 mg·L - 1 +AgNO3 210 mg·L - 1。在稀释好的农杆菌菌液中加入
终浓度为 100 mg·L - 1的乙酰丁香酮 (AS) , 将上述预培养之后的辣椒外植体取出放入含有 AS的工
程菌液中浸染 10～15 m in, 期间不断轻轻摇动 , 取出后放在无菌滤纸上轻轻吸干菌液 , 接种回预培养
基上 , 进行共培养。每瓶 10个左右外植体 , 每批 30瓶 , 重复 5次。暗培养 2～3 d。
将共培养 2～3 d后的外植体转入抑菌培养基 (预培养基 + Cef 200 mg·L - 1 ) 中黑暗培养 7 d以
杀死农杆菌。每瓶 5～7个外植体。
抑菌培养后的外植体转接入分化筛选培养基 (MS + ZT 110 mg·L - 1 + IAA 012 mg·L - 1 + Cef 200
mg·L - 1 + Km 50 mg·L - 1 +AgNO3 210 mg·L - 1 ) 中 , 在光照培养室 (14 h光照 , 10 h黑暗 ) 中培
养 , 每两周继代一次。继代 2～3次后统计外植体分化成芽情况。
将已经长出芽的外植体转接入芽伸长诱导培养基 (MS + ZT 110 mg·L - 1 + IAA 012 mg·L - 1 + Cef
200 mg·L - 1 + Km 50 mg·L - 1 +AgNO3 210 mg·L - 1 + GA3 210 mg·L - 1 ) 中 , 每瓶 5个外植体 , 每两
周继代 1次。继代 2次后统计芽伸长情况 , 把不定芽茎长达 210 cm以上者视为芽已经伸长。将伸长
培养基中生长到约 2～3 cm长的抗性芽从外植体上切下 , 垂直插入生根培养基 (MS +NAA 012 mg·
L - 1 + IAA 011 mg·L - 1 ) 中 , 每瓶 3株小苗。20 d后统计生根情况。炼苗 , 移栽。
115　辣椒转化植株的分子检测
分单株取抗性植株叶片 3～5 g, 采用 CTAB法提取辣椒植株基因组 DNA , 用 P1和 P2引物扩增目
的基因进行 PCR检测。提取 PCR扩增呈阳性的辣椒植株总 DNA, 选用 B am H Ⅰ限制性内切酶酶切消
化 , 酶切 12 h左右 , 电泳 , 转膜。以 PacPA P1为探针 , 采用随机引物法标记 , 预杂交及杂交 , 洗膜
及杂交信号检测 , 用 B IO2RAD FX成像系统扫描 , 分析 Southern杂交检测结果。采用 Trizol法提取辣
椒叶片总 RNA, 用 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver1310反转录 PCR试剂盒将总 RNA按照规定程序
进行 RT2PCR反应 , 通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
116　转基因植株的抗病毒活性检测
分别取扩繁 TMV和 CMV的烟草出现明显症状的叶片 1 g, 用研钵捣碎 , 加入 10 mL接种缓冲液 ,
用纱布过滤 , 取滤液 , 采用摩擦接种法。接种于幼苗期顶部 3张平展叶片 , 以未转基因的辣椒植株为
对照。为防止接种造成的误差 , 首次接种 3 d后进行第 2次接种。接种后在防虫网室中培养 , 温度 25
℃左右。50 d后 , 统计病毒病的发病情况并进行分级 (李树德 , 1995)。
2　结果与分析
211　中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆及序列分析
以叶片基因组 DNA为模板 , 优化 PCR反应条件为 : 94 ℃ 1 m in, 50 ℃ 90 s, 72 ℃ 90 s, 35个
循环后 72 ℃延伸 10 m in。结果扩增出一条均匀的约 750 bp的 DNA条带 (图 1) , 与预期值一致。
测序结果表明 : 中国商陆的重组质粒 A插入的外源片段大小为 714 bp, 命名为 PacPAP1, Gen2
Bank登陆号为 AY603353 (登录名称为 papa1)。
PacPAP1与 L in等 (1991) 从美洲商陆中克隆的 Pam PA P cDNA序列同源性达 9917% , 有两处碱
基不同 , 其中第 344 bp处和第 563 bp处为 G, 而 L in等 (1991) 的为 A, 第 343～345和 562～564处
各为一个密码子 , 该基因这两处的密码子均为 AGA, 编码精氨酸 (A rg) , 而 L in等 (1991) 这两处
分离的密码子均为 AAA, 编码赖氨酸 (Lys)。该片段为一个读码框 , 可编码 238个氨基酸。
212　构建植物表达载体和农杆菌介导的辣椒遗传转化
重组子经过酶切得到了约 750 bp的目的片段 , 经测序 , 证明 PacPA P1片段已经插入 pB I121中
(图 2) , 构建了的 pB I1212PacPA P1植物表达载体 , 可以用于植物遗传转化。
共得到卡那霉素抗性植株 33株 , 将转化植株与非转化植株移栽到大棚内种植 , 观察、检测。
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图 1　中国商陆抗病毒蛋白基因的扩增
M: DL 2000 marker; 1: 中国商陆 PAP DNA的扩增产物。
F ig. 1　The am plicon s of the pokeweed an tiv ira l
prote in gene from Phyto lacca acinosa
M: DL 2000 DNA marker;
1. The amp licons of Phytolacca acinosa.
图 2　B am HⅠ + XbaⅠ酶切重组体
M: Marker; 1. 未酶切的重组体 pB I1212PacPA P1;
2. 重组体 pB I1212PacPA P1经酶切后得到目的片段。
F ig. 2　D igestion of recom b inan t vector w ith B am HⅠ + XbaⅠ
M: Marker; 1. Recombinant pB I1212PacPAP1 without digestion;
2. Recombinant pB I1212PacPA P1 vector digested with B am HⅠ + XbaⅠ.
213　辣椒转化植株的分子检测
PCR检测 , 阴性对照无扩增产物 ; 转化植株
未扩增出与阳性对照大小一样条带为假阳性 ; 扩
出与阳性对照 (质粒 ) 大小一样条带的转化植株
为阳性植株。得到 PCR检测为阳性的植株 15株。
Southern杂交结果见图 3。结果表明 : 外源基
因 PacPA P1的 DNA片段已整合到转基因辣椒的
基因组中 , 试验共得到辣椒转 PacPA P1基因植株
14株。
用总 RNA进行 RT2PCR扩增 , 图 4表明 : 5、
12、13号转基因植株未扩增出目的条带 , 外源基
因未表达 ; 其余转基因植株扩增出目的条带 , 外
源基因 PacPAP1在转录水平上得到了表达。
图 3　Southern杂交检测
M: 分子量标记 ; 1～11: PCR检测为阳性的转化体植株。
F ig. 3　Southern blotting
M: Molecular marker; 1 - 11: PCR2positive transformed p lants.
图 4　转基因植株 RT2PCR检测
M. Marker; 1. 阴性对照 ; 2. 阳性对照 ; 3～16. 转化植株。
F ig. 4　RT2PCR ana lysis of the tran sgen ic plan ts
M. Marker; 1. Negative control; 2. Positive control; 3 - 16. Transgenic p lants.
214　转基因植株的田间表现及对病毒的抗性
转基因植株与对照相比 , 其植物学特性与生物学特性都没有发生变化 , 叶色浓绿 , 叶片数、开花
时间、结果情况等均无明显差异 , 和对照一样 , 能够自交结实。
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　6期 陈国菊等 : 中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆及其转化辣椒 　
对 Southern杂交检测为阳性的转基因植株人工接种 TMV和 CMV, 以未转化植株作对照。接种 15
d后观察 , 对照有轻微顶芽干枯现象 , 转基因植株无症状 , 25 d时 , 接种 TMV病毒的对照植株有花
叶、顶芽死亡现象 (图 5) , 阳性转基因植株无症状 , 生长正常 , 表现为抗病 (图 6)。
图 5　非转基因植株感病情况
F ig. 5　 Sym ptom infected w ith TM V and CM V
in non2tran sgen ic plan t 图 6　转基因植株接种 TM V和 CM V的抗病情况F ig. 6　Tran sgen ic plan t resistan t to TM V and CM V
3　讨论
利用 PA P基因是植物抗病毒基因工程领域的一条新途径。 PAP可以抑制若干种病毒 ( Chen et
al. , 1991) , 其转基因植株对病毒有广谱抗性 , 还对某些真菌有抗性 (W ang et al. , 1998; 陈定虎
等 , 2002; Dai et al. , 2003; 刘爽 等 , 2006) , 但是同时也会导致转基因植株的一些不良反应 , 如转
Pam PA P基因 (全长 313个氨基酸 , 包含对寄主植物有毒的区域 ) 的烟草和马铃薯 , 表达的转基因植
株较正常植株生长矮小 (Lodge et al. , 1993)。
PA P基因全长 942 bp (包括终止密码子 ) , 编码 313个氨基酸。研究发现 PAP具有不同的功能
区 : 现已证明在成熟的 PAP N -端第 170～183个氨基酸处为一个活性区域 , 保守性很强 , 其主要是
对病毒产生抗性 ; 在成熟的 PAP C -末端 1～25个氨基酸的区域 , 主要功能是脱去 rRNA的特异位点
的腺嘌呤 , 并且能对寄主产生毒性 , 而与病毒抗性无关。根据由 cDNA序列推导的 PAP三维结构分
析 , 最小的 C -末端多肽至少需要 63个氨基酸才能形成与成熟 PAP相同的空间结构 ( Tumer et al. ,
1997; Schlick et al. , 1999) , 这一结构模式将 PAP的抗病毒活性与对寄主的毒性区分开。试验也证
明 , 缺少 C -末端 1～25个氨基酸的 PAP丧失了对寄主细胞的毒性 , 即不阻碍该细胞蛋白质的正常合
成 , 但是仍然赋予该细胞对侵入病毒的抗性 , 而将活性区的某一个氨基酸突变后 , 如将第 176位的氨
基酸 E变成 V , 使其失去活性 , 也就丧失了对病毒的抗性。
本试验设计出 N、C端缺失无毒型 PA P基因扩增引物 , 从中国商陆分离得到的缺失无毒型基因
( PacPA P1) , 导入辣椒后 , 既能提高植株的抗病性 , 又能使转基因植株正常生长发育 , 说明 PAP的
毒性活性区与寄主细胞的毒性区是彼此分离的 , 因此可以通过基因改造 , 去掉其细胞毒性区而保留抗
病毒活性区 , 发挥其实际利用价值。
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