全 文 ：园 艺 学 报 , 一
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不 同引物组合对中国杏品种资源 基因特异扩增效
果比较
张立杰 , 陈学森 ’ , 陈晓流 , 冯建荣 , 刘晓丽 , 慈志娟
山东农业大学 , 作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安
摘 要 利用已报道的 对蔷薇科李属通用引物组合对起源于我国的 个杏 乃“。
品种进行了 等位基因的专一性 扩增 一 一 , 并依据扩增系数和扩增成功率两个指标
对扩增效果进行了评价。 结果表明 ①不同的引物组合对参试杏品种的扩增系数和扩增成功率差异很大
,
其中引物组合 一 一 扩增系数和扩增成功率均为最高 和 , 效果
最好 ②引物组合 一 一 对 ‘ 华县大接杏 ’ 和 ‘ 猪皮水杏 ’ 未能扩增出任何条
带 , 而 和 一 一 两对组合却能对其扩增出两条带 此外 , 对组合均没
有对 ‘ 兰州大接杏 ’ 和 ‘ 白木杏 ’ 这两个品种扩增出任何条带 , 表明要对中国杏品种资源的 基因型进行
全面 、 准确鉴定 , 除了采用不同的引物组合外 , 还需要根据中国杏的 基因序列进一步开发
、
设计新的专
用引物 ③ 一 一 和 以 两对组合对 ‘ 红丰 ’ 、 ‘ 新世纪 ’
、 ‘ 红荷包 ’
和 ‘ 二花槽 ’ 等 个品种的扩增结果表明 , 依据本试验所提出的扩增系数和扩增成功率两个指标评价不同
引物组合的扩增效果是有效的。
关键词 杏 基因 引物组合 扩增效果
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
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收稿 日期 一 一 修回 日期 一 一
基金项 目 国家自然科学基金项 目
通讯作者 一 。
园 艺 学 报 卷
一
果树 基因的克隆 、 序列分析 、 遗传及 基因型的鉴定等是植物自交不亲和分子机理研究的重要
内容 , 对于果树自交亲和品种的选育及授粉树选配等具有重要意义 陈晓流 等 , 。 传统的
基因型鉴定 , 是通过田间授粉试验及对花柱核糖核酸酶 一 电泳分析完成 , 但这两种方法均
费时费力 , 并且容易受自然环境条件的影响。 等 在苹果上发展了一种利用等位基因
专一性 扩增确定 基因型的方法 , 并利用该方法确定了一批苹果品种的 基因型 。 李属果树上 ,
首先由 等 根据甜樱桃 基因的保守区序列设计了 、 和
等 个引物 , 应用于甜樱桃 , 位 , 及梅
, , 等果树树种的 基因型鉴定 随后 , 等 根据
甜樱桃 基因的 和 保守区序列设计了引物 一 和 一 , 等 根据
扁桃 的 对 基因序列设计了引物 和 最近 等 根据
樱桃 、 扁桃 、 梅 、 乌苏里李 尸 和樱桃李 尸 诉 等 个李属树种 个
基因序列的保守区设计了 一 和 一 引物 , 用这对引物对李属果树品种进行
基因型鉴定 , 效果较好 。
我国是杏的原生起源中心之一 , 种质资源极为丰富 陈学森 等 , , 但有关杏 基因型的研
究报道甚少 齐洁 , 朋 吴燕 等 , 。 因此 , 我们选用已报道的蔷薇科李属通用引物组合 , 对起
源于我国的 个杏 尸城 品种进行了 等位基因特异扩增 、 克隆测序及基因型鉴定 ,
目前已克隆并在 登录了 个 新基因 , 同时结合田间授粉试验鉴定了 个杏品种的 基因
型 。 在研究过程中发现 , 不同的引物组合扩增效果差异很大。 为此 , 本文将有关结果报道如下 , 旨在为
相关研究提供参考。
材料与方法
材料
试验于 一 年在山东农业大学果树生物学实验室进行 , 所用试材采自新疆农业科学院轮
台国家果树资源圃及山东农业大学泰安市横岭果树育种基地 , 共 个品种 表 。 春季采集新梢幼
嫩叶片 , 用硅胶干燥保存备用 。
方法
基因组 的提取采用吴树敬和陈学森 的改良 法 , 经 的琼脂糖电泳检测
后 , 于 一 ℃贮存备用 。
本试验选用的 对蔷薇科李属通用引物组合及其序列见表 。
等位基因特异 扩增以各品种的基因组 为模板 , 分别用不同的引物组合进行 专一性
扩增 , 各引物组合扩增的退火温度依次为 、 、 、 及 ℃ , 其它反应条件参照各 自引物文献。
反应结束后 , 用 的琼脂糖凝胶电泳 , 澳化乙锭 染色法检测 产物的有无和大小 。
已有的研究表明 , 包括本试验采用的 个品种 类型 在内的杏品种均为二倍体 , 基因的扩
增产物 , 每个品种理论上应有两条带 。 因此 , 扩增效果的评价主要依据如下两个指标
扩增系数 实际扩增出的条带总数 应扩增出的理论条带总数
扩增成功率 两条带的品种数 参试品种数 。
两条带长度十分相近以致在琼脂糖凝胶上无法分开的情况可能存在 , 但机率甚小 , 需要进一步通
过测序进行验证 , 对本试验扩增效果的评价也影响甚微 , 因此 , 本文中可以忽略。
期 张立杰等 不同引物组合对中国杏品种资源 基因特异扩增效果比较
表 选用的蔷薇科李属通用引物组合及其序列
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序号
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引物组合
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结果与分析
不同的引物组合对 个参试杏品种的扩增效果
个引物组合对 个参试杏品种的扩增结果见图 和表 。 从图 和表 可以看出
①不同的引物组 合对参试杏 品种 的扩增 系数和扩增成功率差 异很 大 , 其 中引物组 合
一 扩增系数和扩增成功率均为最高 和 , 故扩增效果最好 ,
其次为引物组合 〕 , 虽然扩增系数 比 一 一 引物组合的
扩增系数 低 , 但扩增成功率 高于后者 , 而引物组合 十 的扩
增系数及扩增成功率均为最低 和 , 扩增效果最差 。
②引物组合 一 一 的扩增效果虽然最好 , 但对 ‘ 华县大接杏 ’ 和 ‘ 猪
皮水杏 ’ 没有扩增出任何条带 , 而 和 一 一 两对引物组合对 ‘ 华
县大接杏 ’ 和 ‘ 猪皮水杏 ’ 两个品种均能扩增出两条带 , 说明中国杏品种资源 基因之间的差异较
大 , 要对不同杏品种 基因型进行准确的鉴定 , 需要采用不同的引物组合。
③本试验选用的 对引物组合均没有对 ‘ 兰州大接杏 ’ 和 ‘ 白木杏 ’ 这两个品种扩增出任何条
带 , 表明要对所有的中国杏品种资源的 基因型进行全面鉴定 , 还需要根据中国杏的 基因序列进一
步开发 、 设计新的专用引物 。
图 引物 一 一 对部分杏品种基因组 的 等位基因扩增图
以洲〕 一 为品种编号
,
详见表 。
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园 艺 学 报 卷
扩增效果评价结果的有效性
本试验参试的 个杏品种中 , ‘ 红丰杏 ’ 和 ‘ 新世纪杏 ’ 为本课题组近几年选育的新品种 陈
学森 等 , , , 是 ‘ 红荷包杏 ’ 和 ‘ 二花槽杏 ’ 杂交后代的姊妹系。 由图 和表 可以
看出 , 本试验根据扩增系数和扩增成功率两个指标所选择的 一 一 和
飞」 扩增图略 两个引物组合 , 不仅扩增效果最好 , 而且均能对以上 个品种扩增出两条带 ,
其中 ‘ 红丰 ’ 和 ‘ 新世纪 ’ 的两条带分别来 自其亲本 ‘ 红荷包 ’ 和 ‘ 二花槽 ’ , 表明用本试验所提
出的扩增系数和扩增成功率两个指标评价扩增效果是有效的。
表 不同引物对参试杏品种基因组 的 等位基因扩增结果
·
编号 品种 一
一 一
一
一
扩增系数
石
扩增成功率
西农
二转子
短枝杏
圆旦杏
白沙杏
白杏
串枝红
红荷包
银香白杏
硬条京
巴旦水杏 劝
晚杏
红丰
新世纪
二花槽
水杏
猪皮水杏
华县大接杏
甜仁杏
晚熟杏
红玉杏
大果杏 即
大黄杏
实生大黄杏
大红杏 卿
假麦香 石
龙王帽
骆驼黄
兰州大接杏
白木杏
十 十
十
十 十
十
注
囚
扩增出两条带 十 扩增出一条带 一 未扩增出带 。
币
期 张立杰等 不同引物组合对中国杏品种资源 基因特异扩增效果比较
讨论
设计或选用合适的引物组合是利用 等位基因专一性 扩增法进行果树 基因型鉴定的关键
环节 。 在李属 乃“ 果树上 , 先后根据甜樱桃 尸 和扁桃 尸 基因的
保守区序列而设计了引物
、 、 、 一 、 一 、 和 , 并
成功应用于甜樱桃及梅等果树树种的 基因型鉴定 , 。 ,
·
,
·
, , 等 根据樱桃
、
扁
桃 、 梅 尸 、 乌苏里李 和樱桃李 毋 等李属
个树种的 个 基因序列设计了引物组合 一 和 一 , 并分别对基因型 已知
的 ‘ ’ 等 个樱桃品种和 ‘ ’ 等 个扁桃品种以及 ‘ ’ 等 个杏品种
进行扩增 , 所有参试品种均能扩增出两条带 , 初步认为该引物组合对蔷薇科李属植物的 基因扩增具
有较好的通用性 。
本试验选用已报道的 对引物组合对 ‘ 红丰 ’ 及 ‘ 新世纪 ’ 等 个中国杏品种的 基因进行特
异性扩增 , 并提出了扩增系数和扩增成功率两个指标对不同引物组合的扩增效果进行评价 , 结果也验
证了 等 的结论 , 在 对引物组合中以引物组合 一 , 一 的
扩增效果最好 , 其中 ‘ 红丰 ’ 和 ‘ 新世纪杏 ’ 的两条带分别来 自其亲本 ‘ 红荷包 ’ 和 ‘ 二花槽 ’ 。
等 利用 , 和 等 个引物对 个梅品种进行 基因型鉴定时
发现 , 其中有 个品种 , 引物组合 只能扩增出一条带 , 而 均扩增出了
两条带 等 利用引物组合 一 一 检测出了樱桃的 和
、 扁桃的 和 以及杏的 、 和 这些不能被 和 等引物组合检
测的基因 , 并指出引物序列几个碱基的细微差异足以抑制引物与目的序列结合 和
利用不同的引物组合对甜樱桃品种进行了 基因鉴定 , 认为引物序列与品种序列的不匹配是
一些 基因不能被检测的原因之一 。 本研究结果也表明 , 不同的引物组合对参试杏品种的扩增系数和
扩增成功率差异很大 , 其原因可能为引物序列与中国杏的 基因保守区序列并不完全匹配 , 有待于进
一步研究 。
本研究发现 , 尽管 一 一 引物组合的扩增效果最好 , 但仍不能对 ‘ 华
县大接杏 ’ 和 ‘ 猪皮水杏 ’ 的 基因进行有效扩增 , 而 和 一 一
两对引物组合对 ‘ 华县大接杏 ’ 和 ‘ 猪皮水杏 ’ 两个品种均能扩增出两条带 同时本试验选用的
对引物组合均没有对 ‘ 兰州大接杏 ’ 和 ‘ 白木杏 ’ 这两个品种扩增出任何条带 , 这可能是由于中国
杏品种资源 基因多样性比较丰富 , 基因之间的差异较大造成的。 因此 , 为了对我国丰富的杏品种
资源 基因型进行全面
、
准确的鉴定 , 不仅需要从已报道的引物组合中选用不同的引物组合 , 而且还
需要根据中国杏的 基因序列进一步开发 、 设计新的专用引物 。
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陈晓流 , 陈学森 , 束怀瑞 甜樱桃 乃“ 。 。 品种 基因型鉴定 遗传学报
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陈学森 , 高东升 , 李宪利 , 张艳敏
, 张连忠 胚培早熟杏新品种—新世纪 园艺学报
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陈学森 , 高东升 , 李宪利 , 张艳敏 , 张连忠 胚培早熟杏新品种—红丰 园艺学报
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陈学森 , 李宪利 , 张艳敏 , 昊树敬 , 沈洪波 , 束怀瑞 杏种质资源评价及遗传育种研究进展 果树学报
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