全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (12) : 1837 - 1842
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 06 - 06; 修回日期 : 2008 - 10 - 21
基金项目 : 北京市科委重大项目 (D070500340121)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhaolj5073@1631com)
部分矮牵牛品种亲缘关系的 SRAP分析
徐　进 1 , 张西西 1, 2 , 董爱香 2 , 王　涛 2 , 赵梁军 13
(1 中国农业大学观赏园艺与园林系 , 北京 100193; 2 北京市园林科学研究所 , 北京 100102)
摘 　要 : 利用 SRAP ( sequence2related amp lified polymorphism) 技术对部分矮牵牛品种进行亲缘关系分
析。采用 88对引物对我国栽培的 58个矮牵牛品种进行扩增 , 从中筛选到 20个多态性较高的引物组合 , 共
产生 389条多态性条带 , 平均每个引物组合产生 1915个多态性条带 , 每个引物组合分别产生 13～40个扩
增带 , Jaccardpis相似系数在 0155～0187之间。在遗传距离为 0167处可将 58个品种分为 4个类群 , 第 1类
群主要为暖色系列的品种 , 第 2类群为黄色花品种 , 第 3、4类群为冷色花品种 , 白色花品种聚类较散。
关键词 : 矮牵牛 ; SRAP; 亲缘关系
中图分类号 : S 681　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2008) 1221837206
Genetic Rela tion sh ip of Som e Cultivars of Petun ia Hybr ids Using SRAP
M arker
XU J in1 , ZHANG Xi2xi1, 2 , DONG A i2xiang2 , WANG Tao2 , and ZHAO L iang2jun13
(1D epartm ent of O rnam ental Horticu lture and Landscape A rchitecture, China A gricu ltura l U niversity, B eijing 100193, China;
2B eijing Institu te of Horticu lture and Gardening, B eijing 100102, Ch ina)
Abstract: In this paper, the molecular marker system2SRAP ( sequence2related amp lified polymorphism)
was firstly app lied on 58 petunia hybridspigenetic relationship research. The results obtained was as follows: 20
p rimer pairs selected from 88 p rimer pairs amp lified 389 polymorphic bands with an average of 1915 polymor2
phic bands per p rimer pair, and the number of bands amp lified by each p rimer pair was ranged from 13 to 40.
Moreover, Jaccardpis sim ilarity coefficient ranged from 0155 to 0187. Fifty2eight cultivars could be divided into
4 group s when the genetic distance was 0167. The first group mainly included warm colour serieses, and
yellow flower cultivars were in the second group, while cold colour cultivars were clustered in the third and
fourth group. In addition, the white colour cultivars were clustered in a wide range.
Key words: Petun ia hybrida; SRAP; genetic relationship
矮牵牛 ( Petun ia hybrida V ilm. ) 原产南美洲。目前我国常见的矮牵牛栽培品种有 80余个 , 花色
极为丰富。尽管矮牵牛不同品种在叶片大小、花形花色、花朵直径、植株高度等方面具有差异 , 但无
法通过形态指标来判断品种间的亲缘关系 , 这为矮牵牛的栽培利用和遗传改良带来了不便。
Cerny等 (1996) 利用 DAF (DNA2amp lification fingerp rinting) 技术分析了矮牵牛 5个种和 10个
栽培品种之间的亲缘关系 , 并将供试材料进行区分。我国对矮牵牛品种演化与亲缘关系的研究较少。
对观赏植物进行亲缘关系分析的 DNA分子标记技术主要有 RAPD和 AFLP, 但由于 RAPD的重复性较
差 , AFLP操作复杂且成本较高 , 应用受到限制 , 而相关序列扩增多态性 SRAP ( sequence2related am2
p lified polymorphism ) 技术可以弥补上述不足。
SRAP技术的原理是利用特定引物对 ORFs区域 (open reading frames) 进行扩增。上游引物长 17
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
bp, 5′端的前 10 bp是填充序列 , 紧接着是 CCGG组成核心序列及 3′端 3个选择碱基 , 对外显子进行
选择性扩增 , 下游引物长 18 bp, 5′端的前 11 bp是一段填充序列 , 紧接着是 AATT组成核心序列及 3′
端 3个选择碱基 , 对内含子区域和启动子区域进行选择性扩增 (L i & Quiros, 2001; 李慧芝 等 ,
2007)。近年来 , SRAP技术在白菜、葱、番茄、黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等重要蔬菜作物上开始应
用 ( Ferriol et al. , 2003, 2004; 李严和张春庆 , 2005; 韩建明 等 , 2007; 李慧芝 等 , 2007; 王燕
等 , 2007) , 但在观赏植物上的应用尚未见报道。作者将 SRAP技术运用于矮牵牛遗传亲缘关系的分
析当中 , 为构建指纹图谱 , 推动育种与新品种保护提供分子生物学依据。
1　材料与方法
111　材料及其基因组 D NA的提取
试验于 2007—2008年在中国农业大学观赏园艺与园林系实验室进行 , 试材为 58个我国常见矮牵
牛栽培品种 (表 1)。采用改良 CTAB法提取叶片 DNA , 在琼脂糖胶上检测 DNA浓度和完整度。
表 1　58个供试品种名称及来源
Table 1　Nam e and resource of 58 cultivars
编号
No.
品种
Cultivar
来源 3
Resource3 编号No. 品种Cultivar 来源 3Resource3
1 梦幻酒红花边 D ream s Raki Red Lace a 30 爱琴海红色 Prism Red d
2 梦幻鲑红色 D ream s Trout Reda a 31 呼啦蓝色脉纹 Hurrah B lue Stripe d
3 梦幻红色 D ream s Red a 32 呼啦粉红色 Hurrah Pink d
4 梦幻玫瑰花边 D ream s Rose Red Lace a 33 呼啦玫红色 Hurrah Rose Red d
5 梦幻玫红色 D ream s Rose Red a 34 呼啦粉色脉纹 Hurrah Pink Stripe d
6 梦幻粉色 D ream s Pink a 35 阿拉丁红色 A laddin Red f
7 黄金时代蓝色 Primetime B lue b 36 阿拉丁酒红色 A laddin Raki Red f
8 黄金时代红色 Primetime Red b 37 阿拉丁玫红色 A laddin Rose Red f
9 黄金时代猩红色 Primetime Scarlet b 38 霜系列天鹅绒色 Frost Velvet f
10 黄金时代白色 Primetime W hite b 39 霜系列火红色 Frost Flam ing f
11 黄金时代粉红色 Primetime Pink b 40 霜系列樱桃红色 Frost Cherry Red f
12 黄金时代玫红色 Primetime Rose Red b 41 喝彩粉色 B ravo Pink e
13 超越蓝星 U ltra B lue Lace b 42 喝彩白色 B ravo W hite e
14 超越红色 U ltra Red b 43 喝彩蓝色 B ravo B lue e
15 超越粉色 U ltra Pink b 44 丰花紫色 Feng Hua Purp le g
16 海市蜃楼春天 M irage Sp ring a 45 丰花白色 Feng Hua W hite g
17 海市蜃楼夏天 M irage Summer a 46 丰花玫红色 Feng Hua Rose Red g
18 海市蜃楼紫色 M irage Purp le a 47 梅林红色 Merlin Red h
19 海市蜃楼蓝星 M irage B lue Lace a 48 梅林粉色 Merlin Pink h
20 海市蜃楼酒红星 M irage Rakired Lace a 49 梅林樱桃红色 Merlin Cherry Red h
21 交响乐玫红色 Symphonyrose Red c 50 霜系列蓝色 Frost B lue b
22 交响乐红白边 Symphonyred Lace c 51 霜系列玫红圈 Frost Rose R ing b
23 交响乐红色 Symphony Red c 52 双瀑布玫红色 Double Cascade Rose Red a
24 交响乐玫红白边 Symphonyrose Red Lace c 53 双瀑布红色 Double Cascade Red a
25 交响乐蓝色 Symphony B lue c 54 超级瀑布红色 Super Cascade Red a
26 爱琴海玫红色 Prism Rose Red d 55 超级瀑布蓝色 Super Cascade B lue a
27 爱琴海白色 Prism W hite d 56 京冠玫红色 J ing Guan Rose Red i
28 爱琴海黄色 Prism Yellow d 57 京冠紫色 J ing Guan Purp le i
29 爱琴海蓝色 Prism B lue d 58 京冠大红色 J ing Guan Red i
　　3 : a. 美国泛美种子公司 ; b. 美国金匠种子公司 ; c. 日本陇井公司 ; d. 英国弗洛拉诺瓦花卉种子公司 ; e. 瑞士先正达种子公
司 ; f. 美国伯爵种子公司 ; g. 赤峰金太阳园艺公司 ; h. 日本阪田种子公司 ; i. 北京市园林科学研究所花卉研究中心。3 : a. Pan American; b. Goldsm ith; c. Takii; d. Floranova; e. Syngenta; f. Bodger; g. Chifeng Gold Horticulture; h. Sakata; i. Beijing
Institute of Horticulture and Gardening.
8381
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　12期 徐 　进等 : 部分矮牵牛品种亲缘关系的 SRAP分析 　
112　SRAP2PCR扩增与引物筛选
SRAP引物参考 Ferriol等 (2003) 与 Budak等 (2004) 的引物 , 由 8条上游引物 (ME) 和 11条
下游引物 ( EM ) 组合形成 88对引物。从供试品种中挑选出 5个形态和花色相差较大品种的 DNA样
品 , 依次用 88对引物进行特异性扩增 , 筛选能扩增出较多特异性条带的引物组合作为大群体扩增的
引物。
113　PCR扩增及产物检测
PCR扩增反应在 B IOMETRA Tgradient PCR仪 (德国 ) 上进行。反应体系参照 Ferriol等 ( 2003)
的方法并进行优化。20μL扩增体系为 : 双蒸水 1017μL, Buffer 3μL, dNTPs 2μL ( 215 mmol·
L - 1 ) , 上下游引物各 1μL (10μmol·L - 1 ) , 模板 DNA 2μL (20 ng·μL - 1 ) , rTaq酶 013μL (01075
U·μL - 1 )。扩增程序参照李慧芝等 (2007) 的方法。扩增产物进行垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(6% )。
114　数据分析计算
每个引物组合的多态性比率 ( % ) =引物组合扩增的多态性条带数 /总条带数 ×100。每个引物的
鉴别能力 ( % ) =可鉴别的品种数 /总品种数 ×100。
采用 Jaccardpis相似系数 , 使用 NTSYS2pc 210软件 , 非加权组平均法 (UPGMA) 聚类。相似系数
计算公式为 : S ij = a /( a + b + c) , 其中 a表示两份样品共有带数 , b表示 i样品特有的条带数 , c表示 j
样品特有的条带数。
2　结果与分析
211　SRAP多态性分析
在 88对引物组合中 , 有 20对可以扩增出较多特异性条带。图 1为 ME27 /EM 29的扩增图谱。
图 1　引物 M E27 /EM 29对 58个矮牵牛品种的扩增结果 (部分 )
M. pBR322 marker; 1～58号品种见表 1。箭头表示多态性条带。
F ig. 1　The am plif ica tion result of 58 petun ia hybr ids by the pr im er pa ir M E27 /EM 29
M. DNA marker (pBR322) ; Cultivar number are the same as Table 1.
A rrows show polymorphic bands.
9381
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
　　用此 20对引物对 58个品种 DNA进行 SRAP扩增 , 结果 (表 2) 表明 , 每个组合可以扩增出 13
～40条清晰的条带 , 20个引物组合共产生 527条多态性条带 , 其中 389条为多态性条带 , 多态性比
率为 7318% , 每个组合的多态性条带数为 10～32不等 , 平均每个引物组合产生 1915个多态性条带 ,
单个引物组合的多态性比率在 6010% ～8819%之间。
表 2　20对引物产生的多态性
Table 2　The num ber of polym orph ic bands genera ted by 20 pr im er pa irs
组合编号
Primer pair
serial number
组合名称
Name of
p rimer pair
总条带数
Total number
多态性条带数
Number of
polymorphic bands
多态性比率 /%
Polymorphic
rate
可鉴别品种数
Number of
distinguishable kind
鉴别能力 /%
D istinguished
ability
1 ME21 /EM21 13 10 7619 14 2411
2 ME21 /EM22 24 19 7912 39 6712
3 ME21 /EM24 21 15 7114 47 8110
8 ME21 /EM28 33 26 7818 57 9813
9 ME21 /EM29 16 11 6818 41 7017
11 ME21 /EM211 19 13 6814 47 8110
12 ME22 /EM21 29 22 7519 41 7017
14 ME22 /EM23 21 14 6617 33 5619
16 ME22 /EM25 25 15 6010 31 5314
27 ME23 /EM25 35 25 7114 53 9114
36 ME24 /EM23 19 14 7317 47 8110
37 ME24 /EM24 23 15 6512 36 6210
59 ME26 /EM24 38 30 7819 50 8612
60 ME26 /EM25 36 32 8819 51 8719
65 ME26 /EM210 25 22 8810 54 9311
66 ME26 /EM211 23 20 8710 47 8110
68 ME27 /EM22 24 17 7018 38 6515
71 ME27 /EM25 24 15 6215 31 5314
75 ME27 /EM29 39 26 6617 58 100
77 ME27 /EM211 40 28 7010 54 9311
212　矮牵常见栽培品种的聚类分析
根据 SRAP引物扩增的 527条多态性条带 , 对 58个矮牵牛常见栽培品种进行遗传多样性分析 ,
Jaccardpis相似系数在 0155～0187之间。呼啦蓝色脉纹和黄金时代猩红色的亲缘关系最远 , 而海市蜃
楼紫色和海市蜃楼蓝星最近。我国自育品种京冠大红色和京冠玫红色的相似性系数为 0178。
在相似系数为 0167的水平上 , 可以将试材分为 4大类群 (图 2)。
第 1个类群最大 , 从梦幻酒红花边到霜系列蓝色这 45个品种属于这一类群 ; 爱琴海黄色与其他
品种亲缘关系较远 , 单独聚为第 2类群 , 第 3类群包括从黄金时代蓝色到海市蜃楼蓝星 5个品种 ; 其
余 8个品种聚为第 4大类。
从聚类结果来看 , 全部红色系列 ———大红色、酒红、粉红色、玫红色 , 以及白色系列的部分品种
和一个蓝色品种聚在第 1类群 , 爱琴海黄色是所有供试品种中惟一的也是市场上少有的黄色花品种 ,
单独聚为一类 , 绝大多数蓝色系列品种和少量白色系列品种聚为第 3类和第 4类。
0481
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　12期 徐 　进等 : 部分矮牵牛品种亲缘关系的 SRAP分析 　
图 2　58个矮牵牛栽培品种的聚类分析图
F ig. 2　The dendrogram of phylogenetic rela tion sh ip of 58 cultivars of Petun ia hybrida
3　讨论
SRAP指纹图谱不仅多态性高、重复性好、操作简单、在基因组中分布均匀、引物具有通用性 ,
而且其正向引物可以与反向引物两两搭配组合 , 因此用少量的引物可组配得到多个引物对 , 提高了引
物的使用效率 , 降低合成引物成本。因而利用 SRAP构建品种指纹图谱是一种经济实用的方法。
Cerny等 (1996) 对矮牵牛 5个种和 10个栽培品种的研究表明 , 各供试材料在聚类分析图中的
位置与花朵颜色高度相关 , 而不与品种系列相关。本研究也得出了类似的结果 , 显示出 58个矮牵牛
品种的聚类与花色密切相关 , 聚类图中第 1类群为暖色系列品种 , 第 3、4类群为冷色系列 , 黄花矮
牵牛品种奇少且在相似系数很小时就单独聚为一类 , 而白色花品种分布于各个类群中。由此推测矮牵
牛杂交育种过程中的亲本选择是以颜色为主导 , 而白色花聚类较分散可能另有其他原因。聚类结果
中 , 我国自育品种丰花紫色聚类于暖色类群 , 与其他紫色花品种的位置不同 , 这可能是各国育种者对
1481
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
花色的表述误差所致。本研究采用英国皇家园艺学会的比色卡 (RHS) 测量花色后得知 , 丰花紫色
品种的花色近似于阿拉丁酒红色品种的花色 , 所以丰花紫色品种聚类在暖色部分是合理的。
另外 , 在聚类结果中有的品种所在位置与同品种系列的其他品种距离较远 , 如呼啦系列、超越系
列、梦幻系列的品种以及我国自育的丰花系列品种。矮牵牛的花色是一个非常复杂的性状 , Cornu
(1984) 发现 , 控制花色的基因位点随机分布于基因组当中 , 在已确定的 100个基因中与花色合成有
关的就多达 32个。这进一步说明控制花色的基因在整个基因组中的地位很重要 , 花色基因数量上的
优势可能会影响控制其它性状的基因 , 从而干扰了一些品种在聚类结果中的位置。
从本聚类结果来看 , 国外同一公司培育的品种基本上聚到一起 , 说明各育种公司拥有各自的核心
种质 , 这些核心种质资源相对交流也较少。我国自育品种的聚类结果也有类似的现象 , 京冠系列的两
个暖色品种亲缘关系较近。另外 , 目前我国尚未建立矮牵牛的核心种质 , 对优良亲本资源的遗传背景
资料掌握甚少。本研究在 58个矮牵牛上获得的 SRAP标记资料有助于弄清矮牵牛品种的亲缘关系 ,
也可用于绘制矮牵牛指纹图谱 , 对于准确鉴定矮牵牛品种 , 选配杂交亲本组合 , 有效保护新品种知识
产权等方面具有重要意义。
References
Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I. 2004. Molecular characterization of buffalograss germp lasm using sequence2related amp lified polymorphism
markers. Theoretical and App lied Genetics, 108: 328 - 334.
Cerny T A, Caetano2Anollés G, Trigiano R N, Starman T W. 1996. Molecular phylogeny and DNA amp lification fingerp rinting of Petunia taxa.
Theor App l Genet, 92: 1009 - 1016.
Cornu A. 1984. Monographs on theoretical and app lied genetics∥ Sink K C. Petunia. New York: Sp ringer Verlag: 34 - 37.
Ferriol M, Pico B, Nuez F. 2003. Genetic diversity of a germp lasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers. Theor App l Gen2
et, (107) : 271 - 282.
Ferriol M, Pico B, Pascual Fernandez de Cordova, Nuez F. 2004. Molecular diversity of a germp lasm collection of squash (Cucurbita m oschata)
determ ined by SRAP and AFLP marker. Crop Science, 44: 653 - 664.
Han J ian2m ing, Hou Xi2lin, Xu Hai2m ing, Shi Gong2jun, Geng J ian2feng, Deng Xiao2hui. 2007. Genetic differentiation of non2heading Chinese
cabbage (B rassica cam pestris ssp. chinensisMakino) germp lasm based on SRAP markers. A tca Agronom ica Sinica, 33 (11) : 1862 - 1868.
( in Chinese)
韩建明 , 侯喜林 , 徐海明 , 史公军 , 耿建峰 , 邓晓辉. 2007. 不结球白菜 (B rassica cam pestris ssp. chinensis Makino) 种质资 SRAP
遗传分化分析. 作物学报 , 33 (11) : 1862 - 1868.
L i G, Quiros C F. 2001. Sequence2related amp lified polymorphism ( SRAP) , a new marker system based on a simp le PCR reaction: Its app lica2
tion to mapp ing and gene tagging in B rassica. Theoretical and App lied Genetics, 103: 455 - 461.
L i Hui2zhi, Yin Yan2p ing, Zhang Chun2qing, ZhangM in, L i J ian2m in. 2007. Evaluation of app lication of SRAP on analysis of genetic diversity in
cultivars of A llium fistu losum L. Acta Horticulturae Sinica, 34 (4) : 929 - 934. ( in Chinese)
李慧芝 , 尹燕枰 , 张春庆 , 张　敏 , 李建敏. 2007. SRAP在葱栽培品种遗传多样性研究中的适用性分析. 园艺学报 , 34 (4) : 929 - 934.
L i Yan, Zhang Chun2qing. 2005. Studies on genetic diversity with a molecular marker SRAP of watermelon hybrids. Acta Horticulturae Sinica, 32
(4) : 643 - 647. ( in Chinese)
李　严 , 张春庆. 2005. 西瓜杂交种遗传多态性的 SRAP标记分析. 园艺学报 , 32 (4) : 643 - 647.
W ang Yan, Gong Yi2qin, Zhao Tong2m in, L iu Guang, Yu Fan2m in, Ye Hai2long, L iu L i2wang. 2007. Op tim ization of SRAP2PCR system and
cultivar molecular identification in tomato (Lycopersicon esculen tum L. ) . Journal of Nanjing Agricultural University, 30 (1) : 23 - 29. ( in
Chinese)
王　燕 , 龚义勤 , 赵统敏 , 刘　广 , 郁樊敏 , 叶海龙 , 柳李旺. 2007. 番茄 SRAP2PCR体系优化与品种分子鉴定. 南京农业大学学
报 , 30 (1) : 23 - 29.
2481
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net