全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 721～724
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 18; 修回日期 : 2005 - 10 - 11
基金项目 : 安徽省教育厅自然科学重点科研项目 (2005kj391ZD)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jangcj@ahau1edu1cn)
桃叶片β -半乳糖苷酶基因全长 cDNA克隆及原核
表达
卞伟华 1, 4 　江昌俊 23 　王朝霞 3
(1 安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术重点实验室 , 安徽合肥 230036; 2 安徽农业大学生物技术中心 , 安徽合肥
230036; 3 安徽教育学院生物系 , 安徽合肥 230061; 4 山东滨州医学院生化教研室 , 山东滨州 256603)
摘 　要 : 利用 RT2PCR和 RACE技术 , 从蟠桃 (Am ygdalus persica var. com pressa Bean) 中克隆出 3 285
bp的β -半乳糖苷酶基因 cDNA全长 , GenBank登录号为 AY874412。该 cDNA 2 559 bp, 编码 853个氨基
酸。将其插入到大肠杆菌表达载体 pET232a ( + ) 中 , 转化 BL21 trxB (DE3) , 筛选重组菌株。经 IPTG诱
导表达后 , SDS2PAGE呈现约 115 kDa特异表达条带。并通过体外酶促反应分析表达的融合蛋白的生物活
性。
关键词 : 桃 ; β -半乳糖苷酶 ; cDNA末端快速扩增 ; cDNA克隆 ; 原核表达
中图分类号 : S 66211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420721204
C lon ing and Expression ofβ2ga lactosida se Gene cD NA in Peach
B ian W eihua1, 4 , J iang Changjun23 , and W ang Zhaoxia3
( 1 Key Laboratory of Tea B iochem istry & B iotechnology, A nhui A gricu ltural U niversity, Hefei, A nhu i 230036, China;
2B iotechnology Center, A nhu i A gricultural U niversity, Hefei, A nhu i 230036, Ch ina; 3D epartm ent of B iology, A nhu i Institu te of
Education, Hefei, A nhu i 230061, Ch ina; 4D epartm ent of B iochem istry, B inzhou M edica l College, B inzhou, Shandong 256603,
China)
Abstract: A 3 285 bp cDNA encodingβ2galactosidase was cloned from comp ress peach by the methods
of RT2PCR and rap id amp lification of cDNA ends (RACE). The accession number is AY874412, which con2
tains 2 559 bp, encoding a 853 residue polypep tide. The cDNA was constructed into the vector pET232a
( + ) designed for recombinant strain. After IPTG induction, it was observed there was a special band about
115 kDa on SDS2PAGE. The activity of the fusion p rotein was analyzed by in vitro enzymatic reaction.
Key words: Peach; β2galactosidase; Rap id amp lification of cDNA ends; cDNA cloning; Prokaryotic
exp ression
β -半乳糖苷酶 , 又称β - D -半乳糖苷半乳糖水解酶 ( EC131211123) , 商品名为乳糖酶。它能
催化β -半乳糖苷化合物中β -半乳糖苷键发生水解 , 还具有转半乳糖苷的作用〔1〕; β - 半乳糖苷酶
能够降解细胞壁的果胶和半纤维素 , 参与果蔬成熟 ; 植物中含有丰富的β -半乳糖苷酶 , 它们在果蔬
各个时期的含量对植物的成熟、风味、颜色的形成及采收后加工都有重要意义。目前已经从鹰嘴
豆〔2〕、砂梨〔3〕、苹果〔4〕、番茄〔5〕、康乃馨、花椰菜、大麦和水稻等植物中克隆出该酶基因 , 并进行
了基因的结构、功能与表达方面的研究。大多数植物中的β -半乳糖苷酶都以同工酶形式存在 , 编码
该酶的基因为多基因家族。据 Lee等〔6〕报道 , 植物中存在 3种β - 半乳糖苷酶同工酶 : β - 半乳糖苷
酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ, Balasubramaniam等〔7〕从杨桃中也分离出 4种同工酶 , Sm ith等〔8〕报道 , 在成熟的番茄
果实中至少有 7种β -半乳糖苷酶基因被表达。作者从桃中克隆了β - 半乳糖苷酶基因 cDNA全长序
列 , 进行了原核表达 , 并通过体外酶促反应分析表达产物的生物活性 , 这将有助于了解果蔬成熟和风
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味形成的机制 , 为进一步运用生物技术进行调控或生产优质果蔬打下基础。
1　材料与方法
采摘安徽农业大学农萃园蟠桃 (Am ygdalus persica var. com pressa Bean) 两叶一心期嫩叶 (提取粗
酶液检测出有β -半乳糖苷酶活性 , 故选用叶子作为试验材料 ) , 置 - 70℃冰箱中保存待用。
111　桃总 RNA的提取
蟠桃总 RNA的提取参照江昌俊等〔9〕的方法进行。将提取的 RNA置于 - 70℃冰箱中保存。
112　RT2PCR扩增 cD NA特异片段
取 2μg总 RNA逆转录 , 以 cDNA第一链作为 PCR模板 , 从 GenBank上查找已登录植物β -半乳
糖苷酶氨基酸序列 , 用 DNAStar软件比对分析 , 设计简并引物 P1 〔gg ( agct) gg ( agct) tt ( ct) cc
( agct) gt ( agct) tgg〕; P2 〔 ( agct) gg ( agct) gc ( ag) gc ( ag) ga ( ag) tc ( ag) ta〕; P3 〔ca
( ag) gg ( agct) gg ( agct) cc ( agct) at ( act) at ( act) 〕和 P4 〔 ( ag) aa ( ag) tt ( agct) gt ( agct)
cc ( agct) cc ( agct) tg〕。以 P1和 P2为引物进行降落 PCR, 取反应产物为模板 , 以 P3和 P4为引物
进行梯度 PCR。特异片段用胶回收纯化后与 pMD182T载体连接 , 转化至 JM109, 挑取阳性菌落 , 筛
选鉴定并测序。
113　cD NA的 3’ /5’RACE反应
根据 112测序结果设计特异引物 GSP2 ( ggc ttg gag tgg ctg gtt ttc gga) 和 GSP1 ( cac atc acc cac ggc
acc cca gt) , 用 Clontech公司 BD SMARTTM RACE cDNA Amp lification Kit试剂盒扩增 cDNA的 3’末端
和 5’末端 , 扩增产物与 T载体连接并测序。
114　cD NA全长的扩增
根据 cDNA 3’和 5’末端序列 , 设计引物 P5 ( gtc ttg ctg ctt cac cac act ct) 和 P6 ( cat tcc tga act
gca ctg taa ac) , 用 TaKaRa公司 PyrobestTM DNA Polymerase进行 PCR。胶回收 PCR产物 , 末端加 A后
与 PMD182T载体连接并测序。
115　β -半乳糖苷酶重组表达载体的构建
根据全长测序结果设计引物 P7 ( ctc gaa ttc atg gaa acc aac tca gtt tcc) 和 P8 ( ctc aag ctt acc cct cga
att ggg ttc cat) , 将 PCR扩增产物定向克隆到原核表达载体 pET232a ( + ) 的 EcoRⅠ、H ind Ⅲ位点 ,
构建重组表达载体 pET2Gal, 转化至 JM109, 提取重组质粒 , 转化至表达宿主菌 BL21 trxB (DE3) , 挑
取阳性菌落 , 筛选鉴定并测序。
116　重组菌株诱导表达及电泳分析
重组菌株于 LB液体培养基中培养至 OD600值 016～110, 加 IPTG至终浓度为 1 mmol·L - 1 , 分别
培养 0、2、4、6、8 h后各取出 20 mL菌液用于分析总蛋白。离心上述菌液 , 弃上清液 , 用 1 ×PBS
缓冲液 〔8 mmol·L - 1磷酸钠 , 2 mmol·L - 1磷酸钾 , 140 mmol·L - 1 NaCl2 , 217 mmol·L - 1 KCl (pH
714) 〕重悬菌体 , 加入 2 ×SB 〔100 mmol·L - 1 DTT, 20 g·L - 1 SDS, 80 mmol·L - 1 Tris2HCl ( pH
618) , 0106 g·L - 1溴酚蓝 , 15%甘油 〕混匀。冰浴超声处理 , 变性蛋白 70℃加热 3 m in。以含有
pET232a ( + ) 表达菌株和不含质粒的表达菌株作为对照 , 进行 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
117　表达蛋白的酶活性测定
重组菌株液体培养至 OD600值 016～110, 加 IPTG至终浓度为 1 mmol·L - 1 , 诱导表达 6 h, 离心 , 弃
上清 , 加提取缓冲液 〔011 mol·L - 1柠檬酸钠 (pH 416) , 1 mol·L - 1 NaCl, 13 mmol·L - 1 EDTA, 10
mmol·L - 1β -巯基乙醇 , 10 g·L - 1可溶性 PVP〕重悬菌体。冰浴超声处理 , 离心 , 将上清贮存于 4℃。
酶活性测定反应体系 : 012 mL, 011 mol·L - 1柠檬酸钠缓冲液 (pH 410) ; 014 mL, 13 mmol·L - 1β -半
乳糖苷 (ONPG) ; 014 mL酶溶液 〔用 011 mol·L - 1柠檬酸钠缓冲液 (pH 410) 配制 〕。37℃反应 15
m in, 加 210 mL, 012 mol·L - 1 Na2 CO3 终止反应后 , 用分光光度计测定溶液在 415 nm处吸光值〔10〕。
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　3期 卞伟华等 : 桃叶片β -半乳糖苷酶基因全长 cDNA克隆及原核表达 　
2　结果与分析
211　β -半乳糖苷酶 cD NA克隆及序列分析
对已知植物来源的β -半乳糖苷酶的氨基酸序列进行比对分析 , 找出间隔一定距离且连续 6个氨
基酸高度保守的序列设计简并引物 P1、P2、P3和 P4。以 cDNA为模板 , 进行 PCR扩增得到一条 387
bp的带 (图 1, 泳道 2) , 测序表明 , 该产物是桃 β - 半乳糖苷酶基因的特异片段。引物 GSP2和
GSP1, 分别配合试剂盒所提供的 3’端和 5’端接头引物 , 各扩增出一特异条带 , 测序后分析表明 ,
它们分别是桃β -半乳糖苷酶基因的 3’端序列 , 长 2 343 bp (图 1, 泳道 3 ) 和 5’端序列 , 长 840
bp (图 1, 泳道 4 )。引物 P5 和 P6 扩增出长
3 170bp的序列 (图 1, 泳道 5) , 将上述序列进
行拼接后 , 得到β - 半乳糖苷酶基因 cDNA的全
长序列 , 全长 3 285 bp。B last搜索表明 : 该全长
序列与已登录的砂梨、番茄、葡萄、拟南芥、鹰
嘴豆、绿豆 (按同源性由高到低排列 ) 等植物β
-半乳糖苷酶基因的 cDNA序列有 80%以上的同
源性 , 其中与砂梨同源性为 90% , 且β - 半乳糖
苷酶基因在进化上比较保守。从而推断 : 得到的
序列为桃β -半乳糖苷酶基因的 cDNA全长序列 ,
其 GenBank登录号为 AY874412, 该 cDNA 编码
853个氨基酸 , 3’端非编码区长 539 bp, 翻译起
始于第 185个碱基 , 终止于第 2 746个碱基。
212　β -半乳糖苷酶基因 cD NA的原核表达
根据全长序列设计引物 , 其中上游引物 5’
端引入 EcoR Ⅰ酶切位点 , 下游引物 5’端引入
H ind Ⅲ酶切位点 , 克隆到 pET232a ( + ) 的
EcoRⅠ /H ind Ⅲ位点 , 构建表达载体 pET2Gal, 转
化表达宿主菌 BL21 trxB (DE3 )。经 IPTG诱导 ,
pET2Gal在宿主菌中得以表达 , 随诱导时间的增
加 , 表达产物也有所增加 , 而空载体及未经 IPTG
诱导的 pET2Gal均不能表达产生特异蛋白条带
(图 2)。由于在载体构建过程中 , 基本上保留了
pET232a ( + ) 载体上的所有序列 , 因而表达的
蛋白是包括β -半乳糖苷酶、硫氧还原蛋白 ( Trx
A)、H is·Tag和 S·Tag在内的融合蛋白。桃 β
-半乳糖苷酶基因编码的蛋白质的分子量理论值为
图 1　RT2PCR、RACE和全长扩增产物的电泳检测
1: DNA标准分子量 ; 2: RT2PCR产物 ; 3: 3’RACE
产物 ; 4: 5’RACE产物 ; 5: 全长产物。
F ig. 1　Electrophoresis of the product of RT2PCR, RACE
and com plete sequence
1: Marker; 2: The p roduct of RT2PCR; 3: The p roduct of 3’RACE;
4: The p roduct of 5’RACE; 5: The p roduct of comp lete sequence.
图 2　表达融合蛋白的 SD S2PAGE
1: 标准蛋白分子量 ; 2: BL21trxB (DE3) ; 3: pET232a ( + ) 未诱导 ;
4: pET232a ( + ) 诱导 4 h; 5～9: pET2Gal诱导 0、2、4、6、8 h。
F ig. 2　SD S2PAGE of fusion prote in expressed in E. coli
1: Protein marker; 2: BL21trxB (DE3) ; 3: pET232a ( + ) uninduced;
4: pET232a ( + ) induced 4 h; 5 - 9: pET2Gal induced 0, 2, 4, 6, 8 h.
94149 kDa, 而空载体 pET232a ( + ) 表达蛋白的分子量为 20167 kDa, 由此推算融合蛋白的分子量为
115116 kDa, 与电泳图谱显示的实际结果基本相符合。经酶活性检测 , 发现表达的产物没有生物活性。
3　讨论
表达的产物没有活性 , 可能是因为表达产物是β -半乳糖苷酶前体 , 需经酶切加工形成两个亚基
后才具有活性 , 由于前体在大肠杆菌宿主细胞中不能得到加工 , 导致没有酶活性。据 Balasubramani2
am等〔7〕报道杨桃β -半乳糖苷酶 Ⅰ为异源二聚体 , 由 48 kDa和 36 kDa两个亚基组成 ; Kaneko等〔10〕
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从稻中纯化出的β -半乳糖苷酶由 47 kDa和 40 kDa两个亚基组成 ; L i等〔11〕和 Kang等〔12〕分别从绿豆
和柿子中纯化出β -半乳糖苷酶 , 发现它们也是由两个不同亚基组成的异源二聚体。本研究诱导表达
的β -半乳糖苷酶分子量为 94145 kDa, 与上述报道的杨桃和稻接近 , 可以理解为是两个亚基的前体
形式。β -半乳糖苷酶氨基酸组成比较长 , 表达出的β -半乳糖苷酶在原核生物中没有得到正确折叠 ,
也可能造成没有酶活性。另外也有可能此β -半乳糖苷酶需几个亚基结合在一起 , 才能形成有活性的
β -半乳糖苷酶。
大肠杆菌表达系统是基因工程中发展最早、目前应用最为广泛的表达系统之一。很多基因都首先
选择在大肠杆菌体系中表达 , 然后尝试在其它系统中表达。pET系统以噬菌体 T7 lac启动子来指导靶
基因的转录 , 一般大肠杆菌中的 RNA聚合酶不能识别它并转录目的基因。而表达宿主菌 BL21 trxB
(DE3) 的染色体中含有 LacMV5调控下的 T7RNA聚合酶基因 , 经 IPTG的诱导可合成 T7RNA聚合
酶 , 从而指导靶基因的转录与翻译 , 表达目的蛋白。本研究选用载体 pET232a ( + ) 和宿主菌
BL21 trxB (DE3) 作为β -半乳糖苷酶的原核表达系统 , 可以把克隆与表达步骤分开 , 从而避免对宿
主细胞有毒的蛋白产物影响质粒的稳定性。由于不同来源的β - 半乳糖苷酶的最适 pH值、最适反应
温度不同 , 所以本试验设计了不同的 pH值和反应温度来测定酶活性 , 并优化反应体系组成 , 但表达
产物仍没有酶活性 , 其原因有待进一步研究。
国内外关于β -半乳糖苷酶应用的研究有不少 , 主要集中于食品工业和医药工业上 , 且在食品工
业中的应用也仅仅局限在低乳糖制品上 , 而在其他领域的应用研究还没有展开。当前所利用的β - 半
乳糖苷酶基因大多来源于微生物 , 植物来源的β -半乳糖苷酶应用于工业生产上还少见 , 这限制了β
-半乳糖苷酶的开发应用。作者从桃中克隆了β -半乳糖苷酶基因 cDNA全长并进行了原核表达 , 提
供了植物来源的β -半乳糖苷酶 , 为今后将其更安全、更可靠地运用于食品、医药工业和环境保护等
领域打下基础。
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