全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (2) : 408～410
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 30; 修回日期 : 2005 - 12 - 14
基金项目 : 湖南省林产化工工程重点实验室资助项目 (042B28)
E2mail: daw1999@1631com
野生松乳菇和野生红汁乳菇蛋白多糖的研究
董爱文 1, 2 符星辉 1 黄美娥 1 陈 阳 1
(1 吉首大学城乡资源与规划学院 , 张家界 427000; 2 湖南农业大学生物科学与技术学院 , 长沙 410128)
摘 要 : 选用合适的溶剂、方法、条件从野生松乳菇和野生红汁乳菇中提取蛋白多糖。粗多糖经
Sevage法脱游离蛋白、DEAE -纤维素柱、SephadexG2100柱层析分离、纯化 , 纯化的蛋白多糖进行紫外及
红外光谱分析并测定蛋白质、多糖的含量及抗氧化能力。结果表明 , 松乳菇蛋白多糖中蛋白质和多糖含量
分别为 24153%和 68183% ; 红汁乳菇中分别为 15153%和 66152% , 两蛋白多糖均具有体外抗氧化的能力。
经鉴定松乳菇蛋白多糖中单糖组成主要是葡萄糖、果糖和甘露糖 , 红汁乳菇蛋白多糖中单糖组成主要是葡
萄糖、果糖和半乳糖。
关键词 : 松乳菇 ; 红汁乳菇 ; 蛋白多糖 ; 提取 ; 分离 ; 纯化
中图分类号 : Q 936; S 646 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0220408203
Stud ies on the Proteoglycan s Isola ted from the W ild L acta rius de lic iosus and
L acta rius ha tsudak
Dong A iwen1, 2 , Fu Xinghui1 , Huang Meipie1 , and Chen Yang1
(1 College of U rban and Rural Resources and Planning Sciences, J ishou U niversity, Zhang jia jie 427000, Ch ina; 2 College of B io2
science and B iotechnology, Hunan A gricultural U niversity, Changsha 410128, China)
Abstract: Proteoglycan was extracted from the L actaricus deliciosus Gray and L actarius ha tsudak Tanake
by app rop riate solvent, method and condition. Proteoglycan was further isolated and purified by Sevage,
DEAE2cellulose columns and SephdexG2100. After purified p roteoglycans was analyzed by IR, UV2spectrum,
the contents of p rotein and sugar were measured. The result shows that the p rotein and sugar content in the
p roteoglycan of L actarius deliciosus were 24153% and 68183% , and that in p roteoglycan of L actarius ha tsudak
were 15153% and 66152%. A t the same time two p roteoglycans have antioxidation. TLC analysis of p roteo2
glycan hydrolate showed that those sugars of L actarius deliciosus were mainly composed of glucose, fructose
and mannose while sugars of L actarius ha tsudak were mainly composed of glucose, fructose and xylose.
Key words: L actarius deliciosus; L acta rius ha tsudak; Proteoglycan; Extraction; Isolate; Purify
1 目的、材料与方法
松乳菇 (L acta rius deliciosus Gray) 和红汁乳菇 (L acta rius ha tsudak Tanake) 是担子菌门 (Basidio2
myocota) 红菇科 (Russulacead) 乳菇属 (L actarius) 的大型野生食用真菌〔1〕, 肉质脆嫩 , 味道鲜美 ,
营养丰富 , 含 16种氨基酸 , 还含有乳菇紫素、乳菇菌素等抗生素 , 其子实体提取物对肉瘤 S2180和
艾氏腹水癌有抑制作用。为进一步研究其蛋白多糖的药理作用 , 我们对野生乳菇蛋白多糖进行了提
取、分离、纯化与鉴定。
两种野生乳菇购于吉首大学张家界校区校门旁村民。经清洗、晾干后于 60℃恒温箱中恒温干燥
至恒重 , 粉碎过 40目筛待用。多糖测定用硫酸 —苯酚法 , 蛋白质测定用 B radford法〔2〕, 蛋白多糖的
紫外及红外光谱分析运用岛津 UV2160分光光度计和岛津 IR408型红外分光光度计。蛋白多糖的单糖
组成分析 : 取蛋白多糖纯化品各 5 mg, 加 1 mol/L H2 SO4 , 封管 , 100℃水浴水解 6 h, 水解液用碳酸
2期 董爱文等 : 野生松乳菇和野生红汁乳菇蛋白多糖的研究
钡中和硫酸 , 用岛津 CS2900薄层色谱仪和岛津 LC29A高效液相色谱仪进行薄层层析与高效液相色谱
分析其单糖组成〔3〕。蛋白多糖体外抗氧化能力的测定运用邻苯三酚自氧化法。
蛋白多糖提取剂的选择 : 取两种野生乳菇干粉各 5 g (平行 3份 ) , 石油醚脱酯后分别加入蒸馏
水、3%草酸和 012 mol/L NaOH 30 mL充分混合 , 沸水浴回流提取 1 h, 抽滤 , 滤渣再提取 1次合并
滤液 , 调 pH至 710, 真空浓缩至原体积 1 /5, 加入 3倍体积的无水乙醇。静置过夜 , 离心 , 收集沉
淀 , 用丙酮、乙醚离心洗涤两次 , 加入 85%乙醇静置 , 收集沉淀 , 60℃恒温干燥至恒重 , 得多糖粗品。
蛋白多糖提取条件的选择 : 按不同温度 (室温、30℃、70℃、100℃)、提取时间 ( 015、110、
115和 210 h)、固液比 (1∶10、1∶20、1∶30、1∶40) 和提取次数 (1、2、3、4) 4因素设计 L16 (45 )
正交试验。
蛋白多糖的分离与纯化 : 取粗多糖 015 g溶于 30 mL蒸馏水 , 用 4∶1的氯仿 ∶正丁醇混合液萃取 ,
静置 , 分出氯仿层 , 除去游离蛋白质 , 透析 , 真空冰冻浓缩至 15 mg/mL, 再进行 1次柱层析 , 收集
洗脱的蛋白多糖 , 得初步纯化的蛋白多糖。两种野生乳菇粗多糖经 Sevage法脱游离蛋白 , 20% H2 O2
脱色 , 透析脱盐 , 浓缩后取 5 mL初步纯化的蛋白多糖上 HCO -3 型 DEAE - 纤维素柱 ( ∶h = 1∶20) ,
洗脱液为蒸馏水 , 流速 1 mL /m in, 以每管 5 mL收集 , 检测多糖洗脱峰 , 收集从 30到 80 mL的洗脱
液 , 冰冻浓缩至 20 mg/mL。取浓缩液 5 mL上 B4 O -7 型 DEAE -纤维素柱 ( ∶h = 1∶20, 同上法 ) , 流
速 015mL /m in , 收集从 25～75mL的洗脱液 , 冰冻浓缩至 20mg /mL。取浓缩的蛋白多糖液 5mL上
SephadexG2100柱 ( ∶h = 1∶20) , 以 1%的 NaCl为洗脱液 , 流速 015 mL /m in, 收集洗脱的蛋白多糖。
2 结果与分析
211 蛋白多糖提取剂的选择和提取次数 , 固液比的确定
溶剂不同对多糖提取影响较大 , 用 012 mol/L NaOH提取多糖得率 (两种乳菇的平均数 ) 最高 ,
占菌丝体干质量的 2713% , 酸提取多糖得率为 713% , 水提取多糖得率最低 , 占菌丝体干质量的
2185% , 说明两种乳菇中含有较多的酸性多糖。
经正交试验及方差分析得出提取次数和固液比对野生乳菇中蛋白多糖的提取影响最显著 , 两种乳
菇蛋白多糖的提取最佳条件为提取温度 30℃, 每次提取 1 h, 固液比为 1∶40, 分 4次提取 , 采用此条
件提取时松乳菇多糖得率为 31118% , 红汁乳菇多糖得率为 23126%。
212 蛋白多糖洗脱分析
结果见图 1、图 2。收集从 30～75 mL的洗脱蛋白多糖液 , 经紫外光谱分析表明蛋白多糖液在 220
nm、280 nm处有吸收峰 , 苯酚硫酸法检测含有糖类物质 , B radford法检测含有蛋白质成分 , 因此它
们属蛋白多糖。
图 1 松乳菇蛋白多糖 SephadexG2100柱层析检测图谱
F ig. 1 The chroma togram of am ylose ( one) , prote in ( two)
proteoglycan of L acta ricus deliciosus by SephadexG2100 图 2 红汁乳菇蛋白多糖 SephadexG2100柱层析检测图谱F ig. 2 The chroma togram of am yla se ( one) , prote in ( two)in proteoglycan of L acta rius ha tsudak by SephadexG2100
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园 艺 学 报 33卷
213 紫外及红外光谱分析
两种纯化的乳菇蛋白多糖的紫外光谱基本一致 , 从 800～200 nm自动扫描 , 它们在 260 nm处无
吸收 , 在 220 nm、280 nm左右有吸收峰 , 这是蛋白结合多糖的特征吸收。两种蛋白多糖纯品粉末用
KB r压片 , 红外光谱检测 , 多糖纯品均显示出 3 350、2 910、1 645和 1 050 cm - 1等多糖特征性吸收
峰。以及 3 400 cm - 1处的一级氨基、二级氨基吸收峰 , 162～1 650 cm - 1处有酰氨基的特征吸收峰。
214 蛋白多糖主要单糖组成分析
经水解的两种蛋白多糖 , 在硅胶 H薄层层析板上点样 , 以正丁醇 ∶醋酸 ∶水为 4∶1∶5的展开剂展
开 , 苯胺 -邻苯二甲酸溶液作为显色剂 , 喷洒加热 , 结果层析板主要显示出 3个斑点。刮取 3个斑点
再层析 2次 , 分离的单糖与标准单糖同板层析 , 岛津 CS2900薄层色谱仪扫描测定 Rf值 , 结果显示松
乳菇多糖的 3个斑点分别为葡萄糖、果糖和甘露糖 ; 红汁乳菇多糖的 3个斑点分别为葡萄糖、果糖和
半乳糖。经高效液相色谱内标法测定松乳菇多糖中葡萄糖为 56125%、果糖为 1136%、甘露糖为
5124% ; 红汁乳菇多糖中葡萄糖为 51145%、果糖为 1148%、半乳糖为 0187%。
215 蛋白多糖得率及多糖和蛋白质含量分析
两种野生乳菇蛋白多糖得率见表 1, 取两种纯化乳菇蛋白多糖各 011 g, 溶解并定容至 100 mL, 摇
匀、然后取 5 mL稀释至 100 mL, 检测多糖和蛋白质含量。结果表明松乳菇纯化蛋白多糖中多糖和蛋白
质含量分别为 68183%和 24153% , 红汁乳菇纯化蛋白多糖中多糖和蛋白质分别为 66152%和 15153%。
表 1 两种乳菇蛋白多糖得率及多糖和蛋白质含量
Table 1 The obta in ing ra tio of proteoglycan and the con ten t of prote in and am ylose ( %)
样品名
Name of samp le
粗蛋白多糖得率
Obtaining ratio of coarse proteoglycan
纯蛋白多糖得率
Obtaining ratio of pure p roteoglycan
多糖含量
Content of amylose
蛋白质含量
Content of p rotein
松乳菇 Lactaricus deliciosus 31118 2116 68183 24153
红汁乳菇 Lactaricus hatsudak 23126 1169 66152 15153
216 蛋白多糖体外抗氧化能力的鉴定
采用邻苯三酚自氧化法检测两种野生乳菇蛋白多糖抗氧化能力 , 结果表明测定体系中加入蛋白多
糖时 , A425吸收值明显下降 , 表明两种野生乳菇蛋白多糖均能明显抑制邻苯三酚的自氧化作用 , 具有
体外抗氧化能力 , 且松乳菇蛋白多糖抗氧化能力略比红汁乳菇蛋白多糖抗氧化能力强。
两种野生乳菇蛋白多糖的含量与香菇蛋白多糖含量 (2169% )〔4〕接近。松乳菇比红汁乳菇蛋白多
糖得率要高 , 但松乳菇子实体目前尚不能人工栽培 , 仅靠野生采集 , 产量有限。为了能够获得更多的
子实体 , 通过发酵法获得松乳菇子实体是当前开发的方向 , 两种野生乳菇蛋白多糖的组成也不尽相
同 , 其药理性质还有待进一步研究。
参考文献 :
1 敖常伟 , 惠 明 , 李忠海 , 钟海雁 , 常银子. 松乳菇营养成分分析及松乳菇多糖的提取分离. 食品工业科技 , 2003, 24 (9) : 77～79
Ao C W , HuiM, L i Z H, Zhong H Y, Chang Y Z. Nutritional components of L. deliciosus and extraction of L. deliciosus polysaccharides. Sci2
ence and Technology of Food Industry, 2003, 24 (9) : 77～79 ( in Chinese)
2 B radford M H. Rap id and sensitive method for the quantitation of m icrogram quantities of p rotein utilizing the p rincip le of p rotein2dye binding.
Anal. B iochem. , 1976, 72: 248～254
3 程光宇 , 吴国荣 , 邹玉珍 , 陈胜兰. 深层培养云芝菌丝体蛋白质多糖的提取及性质. 植物资源与环境学报 , 1998, 7 (4) : 19～23
Cheng G Y, W u G R, Zhou Y Z, Cheng S L. Extraction and character of p roteoglycan from the mycelium of Polystictus versicolor (L. ) Fr. by
submerged culture. Journal of Plant Resources and Environment, 1998, 7 (4) : 19～23 ( in Chinese)
4 陈哲建 , 林宇野 , 谢必峰 , 林跃鑫 , 陈松生 , 吴松刚. 香菇柄多糖蛋白提取的研究. 中国食用菌 , 1996, 1: 28～30
Chen Z J, L in Y Y, Xie B F, L in Y X, Chen S S, W u S G. Study on extracting lentinan p rotein. Edible Fungi of China, 1996, 1: 28～30
( in Chinese)
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