全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (10) : 1527 - 1532
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 03 - 14; 修回日期 : 2008 - 08 - 26
基金项目 : 广东省自然科学基金项目 (07006667) ; 广东省科技计划项目 (2007B050200020)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fanyanp ing@ scau1edu1cn)
白姜花倍半萜合成酶基因的克隆及表达
李瑞红 1 , 范燕萍 13 , 余让才 2 , 陆旺金 1 , 庄楚雄 2
(1 华南农业大学园艺学院 , 广州 510642; 2 华南农业大学生命科学学院 , 广州 510642)
摘 　要 : 以白姜花的叶片为材料 , 通过 RT2PCR与 RACE相结合的方法 , 克隆到一个倍半萜合成酶基
因的 cDNA序列 , 其全长为 1 932 bp, 基因编码区共 1 653 bp, 编码 551个氨基酸 , 命名为 Hc2Sesqu i。该基
因编码蛋白的氨基酸序列与姜和玉米中的倍半萜合成酶有较高的同源性 , 并且含有 DDXXD保守序列。通
过 Clustal X进行序列分析 , 确定该基因属于植物萜类合成酶基因家族中的 Tp s2a亚族。Northern杂交的结果
表明 , 该基因在茎、叶和萼片中均有表达。
关键词 : 白姜花 ; 倍半萜合成酶 ; 基因 ; 克隆 ; 表达
中图分类号 : S 68　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2008) 1021527206
M olecular C lon ing and Expression of Sesqu iterpeno id Syn tha se Gene in
H edych ium corona rium Koen ig
L I Rui2hong1 , FAN Yan2p ing13 , YU Rang2cai2 , LU W ang2jin1 , and ZHUANG Chu2xiong2
(1 College of Horticulture, 2 College of L ife Science, South China A gricultural U niversity, Guangzhou 510642, Ch ina)
Abstract: A TPS gene named as Hc2Sesqu i was isolated from Hedych ium coronarium Koenig leaf. The
comp lete sequence of the cDNA gene was 1 932 bp, with an ORF encoding 551 am ino acids. The am ino acids
sequence shared highly homology to other sesquiterpenoid synthase, containing conserved boxes of: TPS
DDXXD. The phylogenetic analysis after Clustal X alignment suggested that the Hc2Sesqu i belonged to Tp s2a.
Northern blot revealed that the Hc2Sesqu i gene was exp ressed in leaf, stem and sepal.
Key words: Hedych ium coronarium Koenig; sesquiterpenoid synthase; gene; clone; exp ression
萜类化合物按其在植物体内的生理功能可分为初生代谢物和次生代谢物两大类。初生代谢物的萜
类化合物数量较少 , 但极为重要 , 包括甾体、胡萝卜素、植物激素、多聚萜醇和醌类等。次生代谢物
的萜类化合物通常属于植物的植保素 , 虽不是植物生长发育所必需的 , 但在调节植物与环境的关系上
发挥重要的生态功能 , 这些萜类化合物大多具有一定的气味 , 作为一种行为暗示的信号在植物间以及
植物与昆虫间起着重要作用。次生代谢物中的类萜根据其包含的异戊二烯单元的数量分为单萜
(monoterpenes, C10)、倍半萜 ( sesquiterpenes, C15)、二萜 ( diterpenes, C20) 等。其中倍半萜在植
物体内常以醇、酮、内酯等形式存在 , 多具有较强的香气和生物活性 , 是医药、食品、化妆品工业的
重要原料。研究人员已经克隆了大量不同植物种类的倍半萜类合成酶基因 , 如在玉米中克隆到橙花叔
醇合成酶基因、金合欢烯合成酶基因 ( Schnee et al. , 2002) , 在美洲油棕 ( Shah & Cha, 2000) 和青
蒿 (L iu et al. , 2002) 克隆到倍半萜类合成酶基因 , 在姜 ( Picaud et al. , 2006) 和罗勒 ( Iijima et
al. , 2004) 中克隆到大根香叶烯 - D合成酶基因等。目前倍半萜的代谢工程的热点是抗疟特效药
———青蒿素的代谢工程。在青蒿 (Han et al. , 2006)、烟草 (W allaaort et al. , 2001) 中分别有青蒿
FPS (法呢基焦磷酸合酶 ) 基因和青蒿 Amorpha24, 112diene合酶基因过量表达的报道。
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
作者前期研究发现姜花中含有大量的萜类物质 (范燕萍 等 , 2007) , 是进行萜类物质研究的较
好材料。本研究中以单子叶植物白姜花叶片为材料 , 采用 RT2PCR及 RACE技术 , 在姜花中克隆到一
个倍半萜合成酶基因并进行了表达分析 , 为其它单子叶植物中倍半萜类合成酶基因分子方面的研究提
供理论和试验参考。
1　材料与方法
本试验于 2007年 1—10月在华南农业大学园艺生物技术研究所和采后果蔬保鲜重点实验室完成。
试材为白姜花 (Hedych ium corona rium Koenig) , 购自岭南花卉市场。DNA回收的试剂盒 , pMD2
19T载体 , 菌株 DH5α, 3′Full RACE Core Set Kit试剂盒为大连宝生物公司产品。PCR D IG Probe Syn2
thesis Kit为 Roche App lied Science, Mannheim, Germany, 测序委托上海英骏生物技术公司完成。
用改良热硼法 (陆旺金和蒋跃明 , 2003) 提取总 RNA。
以总 RNA作为模板 , 用上海生工 M 2MuLV First cDNA Synthesis Kit合成第一链 cDNA。根据 Gen2
Bank中登录的姜 (登录号为 AAX40664) 和玉米 (登录号为 AAS88571) 中倍半萜合成酶基因的核苷
酸和氨基酸的保守序列设计一对简并引物 , 正向引物 5′2c ( tc) gttggtc ( ga) atggtgatacg23′; 反向引物 5′2
cgctcc ( ga) ttgaagt ( tc) atgtc23′。3′2RACE扩增基本按照 3′Full RACE Core Set Kit试剂盒说明书进行
(3′2RACE 1 st引物 : 5′2caaggaatgccaatggaggg23′; 3′2RACE 2nd 引物 : 5′2tgacataacttcaacggagc23′) , 和试
剂盒所带引物进行巢式扩增。5′2RACE以脱氧核糖核苷酸末端转移酶 TDT在 cDNA 5′末端加 C尾巴 ,
设计特异引物 (5′2RACE 1 st引物 : 5′2cgctccgttgaagttatgtc23′, 5′2RACE 2nd引物 : 5′2gtatcaccatcgaccaa2
cag23′)与锚定引物 ( GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG) , 进行巢式扩增。
PCR循环参数为 : 94 ℃预变性 4 m in; 94 ℃变性 30 s、复性 30 s (温度具体而定 )、72 ℃延伸 30
s (时间根据片段长度而定 ) , 30个循环 ; 然后 72 ℃延伸 10 m in。PCR反应结束后用 110 %琼脂糖凝
胶电泳初步检测 PCR产物 , 回收目的条带 , 连接在 pMD219T载体上 , 转化 , 测序。
在基因的 3′2UTR区设计探针引物。正向引物 : 5′2CCAATACGCAAACCGCCTCT23′; 反向引物 : 5′2
GTTGCAGTAAGGAGCTCCTC23′。提取白姜花的总苞片、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、叶片、块茎、直
立茎、根和花梗的总 RNA。取总 RNA液 10μg, 用含甲醛的 112%琼脂糖凝胶进行变性凝胶电泳 (50
V, 60 m in) , 将变性 RNA 从凝胶转移到尼龙膜上 (B iodyneµ B 0145μm , PALL )。具体操作参照
《分子克隆实验指南 》 ( Sambrook & Russell, 2002)。用 PCR D IG Probe Synthesis Kit ( Roche App lied
Science, Mannheim , Germany) 试剂盒标记探针 , 具体步骤参考说明书进行。
2　结果分析与讨论
211　基因的克隆和序列分析
以白姜花叶片 cDNA为模板扩增得到 540 bp的中间片段。经 NCB I上 B lastX分析 , 该片段序列与
多种植物倍半萜合成酶有较高的同源性 , 初步认为是目的片段。3′2RACE和 5′2RACE分别得到 590、
840 bp核苷酸 , 利用生物软件 DNA star进行拼接分析 , 获得了全长 cDNA序列 (图 1)。该核苷酸序
列为 1 932 bp, 读码框为 1 653 bp, 其中 3′端非编码长 253 bp, 推导的氨基酸序列含 551个氨基酸 ,
命名为 Hc2Sesqu i。DDXXD为萜类合成酶基因的保守序列 , 本试验克隆的基因也含有该保守序列。
212　H c2Sesqu i基因编码蛋白质与其它物种倍半萜合成酶同源性比较
从图 2可以看出 Hc2S esqu i基因编码的蛋白质与其它物种的倍半萜合成酶有较高的同源性 , 与姜
中的大根香叶烯 - D合成酶同源性达 68% , 与美洲油棕中倍半萜合成酶的同源性达到 62%以上 , 另
外 , 与罗勒中大根香叶烯 - D合成酶和玉米中的萜烯合成酶等的同源性达到 50%以上 , 因此推测该
基因也属于倍半萜类合成酶基因。
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图 1　H c2Sesqu i基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列
下划线部分为起始密码子和终止密码子的位置 , 加框部分为萜类合成酶的保守区。
F ig. 1　The nudeotile and deduced am ino ac ids sequences of H c2Sesqu i gene
The start codon and the stop codon are underlined, conserved motifs is boxed.
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图 2　H c2Sesqu i编码蛋白与其它物种倍半萜蛋白的同源性比较
黑色阴影表示完全相同 ; 灰色阴影表示部分相同。AY860846: 姜 , 大根香叶烯 - D合成酶 ;
AY693644: 罗勒 , 大根香叶烯 - D合成酶 ; AF080245: 美洲油棕 , 倍半萜合成酶 ;
AY518310: 玉米 , 萜烯合成酶 , 详见图 3。
F ig. 2　The hom ology of H c2Sesqu i2cod ing prote in and other sesqu iterpene syn tha se prote in s
B lack shadow rep resent identical; Gray shadow rep resent partly identical.
AY860846: Zo germacrene D syn; AY693644: Ob germacrene D syn;
AF080245: Eo sesquiterpene syn; AY518310: Zm terpene syn. See Fig. 3.
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213　H c2Sesqu i推导系统进化分析
在 NCB I网上经氨基酸序列同源检索 , 获得其它植物萜类合成酶基因氨基酸序列 , 用生物软件
DNA star中的 Clustal X进行序列分析 , 最邻近归并法建树并利用 Treeview得到发生树结果。从图 3可
以看出 : Hc2Sesqu i与姜中大根香叶烯 - D合成酶亲缘关系最近 , 氨基酸序列的进化与植物进化保持一
致 , 同科植物在进化树上处于同一分支。与薄荷中的金合欢烯合成酶 , 番茄中大根香叶烯 - C合成
酶 , 棉花中杜松烯合成酶 , 菊苣属中大根香叶烯 - A合成酶功能关系相似 , 同功能酶之间的亲缘关系
较近。这些酶基因都为倍半萜合成酶基因 , 属于萜类合成酶基因七个亚族中的 a亚族。萜类合成酶基
图 3　植物萜类合成酶基因家族系统进化树
Aa. 黄花蒿 ; Ag. 冷杉属 ; Am. 金鱼草 ; A t. 拟南芥 ; Cb. 仙女扇 ; Ci. 菊苣属 ; Cl. 柠檬 ; Cm. 南瓜属 ; Hc. 白姜花 ; Ga. 棉花 ;
La. 薰衣草 ; Lc. 光叶百脉根 ; Le. 番茄 ; Mp. 薄荷属 ; M s. 薄荷 ; N t. 烟草 ; Pc. 紫苏 ; Pf. 白紫苏 ;
Ro. 迷迭香 ; Sc. 一枝黄花 ; So. 鼠尾草 ; St. 茄属 ; Zo. 姜。括号内为 GenBank登录号。
F ig. 3　Phylogenetic tree illustra ting the rela tion sh ip of subfam ilies of the plan t TPS fam ily.
Aa. A rtem isia annua; Ag. Abies grandis; Am. A ntirrhinum m ajus; A t. A rabidopsis tha liana; Cb. C larkia breweri; Ci. Cichorium intybus;
Cl. C itrus lim on; Cm. Cucurbita m axim a; Hc. Hedychium coronarium ; Ga. Gossypium arboretum ; La. Lavandula angustifolia;
Lc. Lotus cornicula tus var; Le. Lycopersicon esculen tum ; Mp. M entha piperita; M s. M entha spicata; N t. N icotiana tabcum ;
Pc. Perilla citridora; Pf. Periila fru tescents; Ro. Rosam arinus off icina lis; Sc. Solidago canadensis; So. Salvia officina lis;
St. Solanum tuberosum ; Zo. Z ingiber officina le. GenBank accession numbers are shown in brackets.
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因根据其氨基酸序列的相关性以及功能的评价 , 将其分为七大亚家族 Tp s2a～Tp s2f, 其中 Tp s2a亚族
由被子植物中倍半萜合成酶基因组成 (D iane et al. , 2004)。
214　Northern杂交结果
从图 4可看出 , 姜花倍半萜合成酶基因在姜花的叶片、块茎、萼片均有一定地表达 , 而在其它部
位无表达。有报道认为萜类合成酶基因有表达的组织特异性 (Crock et al. , 1997) , 如拟南芥在花中
克隆到的 32个基因 , 其中仅有 6个只在花中特异表达 , 有部分基因在茎叶中表达 ( Chen et al. ,
2003)。作者前期研究表明倍半萜不是姜花花瓣的主要香气成分 (范燕萍 等 , 2007) , 但叶片和萼片
也是姜花产生香气的部位 , 所以倍半萜合成酶基因在这些部位表达与姜花香气形成也有一定相关性。
图 4　H c2Sesqu i在白姜花不同器官中的表达情况
1: 直立茎 ; 2: 叶片 ; 3: 萼片 ; 4: 苞片 ; 5: 根 ; 6: 雄蕊 ; 7: 雌蕊 ; 8: 花梗 ; 9: 块茎 ; 10: 花瓣。
F ig. 4　Northern blot of d ifferen t organ s in H edych ium corona rium Koen ig
1: Stem; 2: Leaf; 3: Sepal; 4: B ract; 5: Root; 6: Stamen; 7: Pistil; 8: Pedicel; 9: Tuber; 10: Petal.
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