全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (12) : 1751 - 1758
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 07 - 01; 修回日期 : 2008 - 09 - 22
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2007AA10Z123) ; 国家自然科学基金项目 (30370984)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: ldm lxy@ swu1edu1cn)
香橙苹果酸脱氢酶 C j MDH基因表达特性及转基因
烟草的耐铝性分析
张　觅 , 罗小英 , 白文钦 , 李怡然 , 侯　磊 , 裴　炎 , 李忠旺 , 李德谋 3
(西南大学生物技术中心 , 农业部生物技术与作物品质改良重点开放实验室 , 重庆市农业生物技术重点实验室 , 重庆
400715)
摘 　要 : 为研究柑橘砧木香橙对酸性土壤的适应机理 , 从 ‘资阳香橙 ’根 cDNA文库中随机测序克隆
了苹果酸脱氢酶基因 C jMDH ( GenBank accession No. AB I75147)。该基因 cDNA序列长 1 368 bp, 其开放阅
读框为 1 239 bp, 推测其编码 412个氨基酸残基 , 在编码氨基酸序列中存在 1个苹果酸脱氢酶的 NAD结合
位点和 8个苹果酸结合位点 , iPSORT分析表明该基因编码氨基酸序列 N端存在叶绿体转移肽。同源性分析
显示 CjMDH与拟南芥、烟草、大豆、豌豆、水稻、苜蓿等植物的 MDH一致性约为 80% , 相似性在 85%以
上。在与苹果酸脱氢酶功能有关的 NAD和苹果酸结合位点处氨基酸残基高度保守 , 表明这两个区域是
MDH重要的功能区。Northern blot和 Real2time RT2PCR分析结果表明该基因在香橙根和叶中优势表达 , 在
根中表达量最高 , 茎中表达最低。将 C jMDH基因构建到组成性启动子 CaMV35S驱动的载体中 , 对烟草进
行转化 , 从转基因烟草株系中筛选获得了 3个 C jMDH基因高表达的株系。将表达量高的转基因株系进行耐
铝试验 , 初步结果表明在烟草中超量表达 C jMDH可以提高植株对铝毒的耐受能力。
关键词 : 橙 ; 苹果酸脱氢酶基因 ; 表达特性 ; 转基因烟草 ; 耐铝分析
中图分类号 : S 66614　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1221751208
Character iza tion of M a la te D ehydrogena se Gene from C itrus junos and Its
Tran sgen ic Tobaccopis Tolerance to A lum in ium Tox ic ity
ZHANG M i, LUO Xiao2ying, BA IW en2qin, L I Yi2ran, HOU Lei, PE I Yan, L I Zhong2wang, and
L IDe2mou3
( Key Laboratory of B iotechnology and C rop Q uality Im provem ent of M in istry of A gricu lture of China, B iotechnology Research
Center, Southw est U niversity, Chongqing 400715, Ch ina)
Abstract: Malate, ubiquitously existing in p lant, p lays a crucial role in various metabolic pathways, in2
cluding resp iration, nitrogen fixation, phosphorus acquisition, and alum inum tolerance. Malate dehydrogenase
(MDH) catalyzes the interconversion of oxaloacetate and malate. Previous results suggested that overexp ress2
ing MDH gene transgenic p lants elevated tolerance to alum inum toxicity. C itrus junos, one of main rootstocks
of C itrus fruits, is widely used in the southern of China. A s most of soils are acid in the south, to investigate
the mechanism of tolerance to alum inum in C itrus p lants, a clone referred C jMDH ( GenBank accession No.
AB I75147) was isolated from the cDNA library of root from C itrus junos‘Ziyang’. C jMDH has an open read2
ing frame (ORF) of 1 239 bp encoding a putative p rotein with 412 am ino acid residues, which showed high i2
dentity to otherMDH s in p lants. The deduced p rotein contains a NAD binding site and eight malate binding
sites. Chlorop last transit pep ite was found in N2term inal of C jMDH through iPSORT software. B lastP analysis
result reveals over 80% identity and 85% sim ilarity with A rabidopsis tha liana, N icotiana tabacum , Glycine
m ax, M edicago sa tiva. Am ino acids comparison between CjMDH and other p lantsMDH reveals highly identity
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in NAD and malate binding site. Southern blot suggested that C jMDH is a single copy gene in C itrus junos ge2
nome. Northern blot and Real2time RT2PCR data indicated that C jMDH exp ressed strongly in root and leaf.
Subsequently, the C jMDH was constructed into over2exp ression vector driven by constitutive CaMV35S
p romoter. The construction was introduced into tobacco mediated by A grobacterium tum erfaciens, the overex2
p ression transgenic tobacco lines were obtained through Northern blot. Transgenic lines increased A l2tolerance
in hydroponic culture, p roviding evidence thatMDH is a potential A l2tolerance gene for p lant in acid soils.
Key words: C itrus junos; MDH; exp ression characterization; transgenic tobacco; A l2tolerance
苹果酸是植物代谢的关键产物 , 其功能多种多样 , 不仅参与呼吸作用、能量的产生、光合合成
(包括 C3和 C4植物 )、脂肪酸氧化、木质素的生物合成、氮的固定、氨基酸的合成 , 还在离子平衡
的维护、磷和铁的吸收、耐铝能力的提高等方面发挥作用 ( Gietl, 1992; Martinoia & Rentsch, 1994;
Kochian, 1995)。苹果酸的合成主要是由苹果酸脱氢酶通过可逆地还原草酰乙酸来完成。植物体内同
时含有依赖于 NAD或 NADH辅助因子的多种苹果酸脱氢酶 : 叶绿体苹果酸脱氢酶主要参与维持胞液
与基质间的平衡 ; 胞浆苹果酸脱氢酶和过氧化物酶体苹果酸脱氢酶在苹果酸 ———天冬氨酸穿梭中起作
用 ; 线粒体苹果酸脱氢酶主要在 TCA循环中存在 ; 乙醛酸体苹果酸脱氢酶在β - 氧化中行使功能 ;
根瘤苹果酸脱氢酶主要参与氮的固定和同化作用 ( Schulze et al. , 2002)。
铝离子是偏酸性土壤中植物生长的重要限制因子 , 主要抑制根的伸长和破坏根系统对营养物质的
吸收。大量研究表明多种植物在受到酸性土壤中铝毒胁迫时 , 根际受诱导能够分泌有机酸以缓解植株
所受的毒害 ( Kochian et al. , 2004)。通过修饰植物体内有机酸合成相关酶类的表达 , 改变植物体内
有机酸代谢 , 是增加植物对铝毒耐受性的有效途径。Anoop等 (2003) 将线粒体柠檬酸合成酶基因转
入油菜和铝敏感酵母菌株 , 油菜中柠檬酸活性、柠檬酸的外泌都有提高 , 酵母中柠檬酸含量提高 , 二
者对铝的耐受能力均得到了增强。已从苜蓿、豌豆等植物中克隆了苹果酸脱氢酶基因并进行了转基因
研究 ( Faske et al. , 1997; Tesfaye et al. , 2001)。其中 , 在苜蓿中超量表达苜蓿根瘤特异性的苹果酸
脱氢酶 , 增加了叶片和根中的有机酸含量 , 增加了根际有机酸的分泌量 , 同时也增加了转基因苜蓿对
铝的耐受性 ( Tesfaye et al. , 2001)。罗小英等 (2004) 将促根瘤苹果酸脱氢酶基因转入苜蓿 , 在 20
μmol·L - 1 A l3 +处理下转基因苜蓿较对照表现出明显对铝的耐受性。这些研究表明 , 在植物有机酸代
谢途径中一些编码关键酶基因参与了植物耐铝过程。
柑橘适于 pH 515～615的土壤。虽然适应性较广 , 但强酸性土壤影响其对多种矿质营养元素的吸
收 , 使产量与品质下降 (中国农业科学院郑州果树研究所 等 , 1987)。近年来 , 由于环境条件不断恶
化 , 特别是南方土壤酸化严重 , 对南方柑橘产量与品质带来严重的影响。‘资阳香橙 ’多生于中国西
南地区 , 具有抗病、抗逆性强等特性 , 是南方甜橙的优良砧木之一 (计长远 , 2007)。苹果酸脱氢酶
可催化草酰乙酸盐氧化形成苹果酸盐 , 提高植物体苹果酸的含量 , 提高植物耐酸和耐铝性。研究
‘资阳香橙’根系苹果酸脱氢酶基因的功能 , 有助于了解香橙乃至柑橘类植物耐酸性土壤的分子机
理。
1　材料与方法
111　试验材料
‘资阳香橙 ’ (C itrus junos) 由中国农业科学院柑橘研究所提供 ; 烟草 (N icotiana tobacum var.
xan th i) 由康涅狄格大学 (University of Connecticut) 植物遗传工程实验室 Yi L i教授惠赠。大肠杆菌
菌株 XL1 2B lue、农杆菌菌株 LBA4404由本实验室保存。所有试验均于 2005—2007年在西南大学生物
技术中心完成。
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112　试验方法
11211　基因克隆和生物信息学分析 　
C jMDH通过 ‘资阳香橙 ’根 cDNA文库中随机测序获得。基因编码氨基酸序列的比对通过生物
学软件 GENEDOC完成 , 系统进化树分析在 DNAStar软件下用 ClustalW的方法生成 , 氨基酸同源性比
较在 NCB I网站 ( http: / /www1ncbi1org) 用 B lastP方法进行分析 , 氨基酸序列 N端转运肽分析在 iP2
SORT网站进行 ( http: / / hc1 im s1u2tokyo1ac1 jp / iPSORT/)。
11212　Southern blot和 Northern blot分析 　
DNA和 RNA的提取均参考本实验室改良的方法 (肖月华 等 , 2002a; 2002b) , 以 32 P标记探针 ,
Southern blot和 Northern blot分析的操作均按 《分子克隆实验指南 》进行 ( Sambrook & Russell,
2002)。
11213　Real2time RT2PCR分析 　
取香橙总 RNA 210μg, 用 MB I公司 RevertA idTM First Stand cDNA Synthesis Kit以 O ligo ( dT) 作为
引物合成 cDNA一链。定量 PCR反应在 iCyclerMulticolor Real2time PCR Detection System (B io2Rad) 上
进行。柑橘植物 actin基因作为内标 , 该基因扩增引物与参考文献 ( Pillitteri et al. , 2004) 中的相同 ,
actin2up: 5′2catccctcagcaccttcc23′, actin2down: 5′2ccaaccttagcacttctcc23′。C jMDH 基因所用引物为 CjM2
DH2up: 5′2 ctggcattaccattttacc23′, CjMDH2down: 5′2gctactgcttgcttctgc23′。25 μL 反应体系中包含 1 μL
cDNA一链产物 , 012μmol·L - 1特异引物和 1 ×iQTM SYBR Green Superm ix。温度循环参数为 94 ℃预
变性 5 m in; 94 ℃, 30 s, 56 ℃, 30 s, 72 ℃, 30 s, 40个循环。
11214　C jMDH表达载体构建和烟草的遗传转化 　
C jMDH通过 ‘资阳香橙 ’根 cDNA文库中随机测序获得 , 以 pGEM 2T easy Vector ( Promega) 为
中间载体 , 插入到 pB I121上形成由组成型启动子 CaMV35S控制的超量表达载体 pB I1212C jMDH , 然
后电击转化到根癌农杆菌株 LBA4404中 , 用于烟草的转化。烟草的遗传转化操作参照 Horsch等
(1985) 的方法 , 于含有 50 mg·L - 1 Kanamycin ( Km ) 的 MS培养基上筛选获得转基因植株。
11215　烟草铝胁迫处理 　
将获得的 C jMDH T2 代转基因烟草种子在 25 ℃下 , 于去离子水中振荡培养 3 d催芽。选取萌发一
致的种子在贴于玻璃板的滤纸上铺成直线 , 然后置于含 015 mmol·L - 1 CaCl2和 20μmol·L - 1 A l3 +
(pH 413) 处理液中 , 对照处理为 015 mmol·L - 1 CaCl2 (pH 413)。25 ℃, 培养 10 d, 用于测量根伸
长量 ; 计算幼苗根的相对伸长量 ( Tesfaye et al1, 2001) , 相对伸长量 ( % ) = (铝胁迫下的伸长量 /非
胁迫下的伸长量 ) ×100。每个处理烟草幼苗为 15株 , 重复 3次。长时间铝胁迫处理采用无菌催芽 3 d
的烟草种子置于 MS培养基上 (50μmol·L - 1 A l3 + , pH 413) , 25 ℃, 培养 25 d。
11216　苏木精染色 　
将铝胁迫处理的烟草幼苗根用蒸馏水洗净 , 苏木精染液染色 20 m in, 蒸馏水再次洗净后光学显微
镜下观察 (Havas, 1986; CanÔado et al. , 1999)。
2　结果与分析
211　C jM D H 基因的克隆与同源性分析
从 ‘资阳香橙 ’根 cDNA文库中随机测序获得的香橙苹果酸脱氢酶基因 C jMDH ( GenBank登录
号 : AB I75147) , 其开放阅读框 (ORF) 由 1 239 bp组成 , 编码 412个氨基酸 , 预测的蛋白质分子量
为 43 kDa, 等电点为 712。氨基酸序列分析发现 CjMDH氨基酸序列中含有 1个 NAD结合位点 , 8个
苹果酸结合位点。氨基酸序列 N端运转肽分析发现 , 所克隆 cDNA序列的 ORF编码氨基酸 N端含有
30个氨基酸的叶绿体转移肽。同源性分析显示 CjMDH与多种高等植物苹果酸脱氢酶有较高的相似
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度 , 与拟南芥、烟草、大豆、豌豆、水稻、苜蓿等植物的 MDH一致性约为 80% , 相似性在 85%以
上。不同植物来源的 MDH多重序列比较结果显示 , CjMDH 氨基酸残基有很高的保守性 , 特别是
NAD和苹果酸结合位点处的氨基酸残基高度保守 (图 1) , 在所比较的几个 MDH氨基酸序列中 NAD
和苹果酸结合位点的氨基酸残基完全相同 , 这也表明植物 MDH蛋白质在这两个区域具有高度的保守
性 , 这两个区域是 MDH行使功能的重要的功能域。本研究所克隆的 C jMDH基因编码氨基酸序列中也
存在相同的 NAD和苹果酸结合位点 , 推测 C jMDH基因编码氨基酸可能也具有和其它苹果酸脱氢酶基
因一样催化草酰乙酸盐和苹果酸盐间相互转化的功能。
图 1　C jMDH 推测的氨基酸序列与其它相似性较高的苹果酸脱氢酶的多重比较3 : NAD结合位点 ; #: 苹果酸结合位点。
F ig. 1　A lignm en t of deduced am ino ac id sequences of ma la te2dehydrogena ses between C itrus junos and the other plan ts
Star and pound mark NAD2binding site and malate binding site respectively.
A t2cNAD2MDH: A rabidopsis thaliana chlorop lastMDH (CAA74320) ; A t2MDH: A rabidopsis thaliana MDH (NP_190336) ;
M s2neMDH: M edicago sativa MDH (AAB99757) ; N t2cNAD2MDH: N icotiana tabacum MDH (CAB45387) ;
Gm2neMDH: Glycine m ax nodule2enhanced MDH (AAC24855) ;
Ps2neMDH: Pisum sativum nodule2enhanced MDH (AAC28106) .
通过 ClustalW方法对 CjMDH进行进化树分析 , 分析结果显示 C jMDH与烟草、拟南芥叶绿体的
NAD2MDH和大豆、豌豆、苜蓿 neMDH同属一个亚族 , 其中与烟草和拟南芥的亲缘关系较近 (图 2)。
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图 2　香橙 C jMDH 系统进化树分析
MDH: 苹果酸脱氢酶 ; gMDH: 乙醛酸体苹果酸脱氢酶 ; NAD2MDH: NAD依赖苹果酸脱氢酶 ; mMDH: 线粒体苹果酸脱氢酶 ;
cMDH: 叶绿体苹果酸脱氢酶 ; pMDH: 过氧化物酶体苹果酸脱氢酶 ; neMDH: 促根瘤苹果酸脱氢酶。
Cj: 香橙 ; A t: 拟南芥 ; Bn: 油菜 ; Cl: 西瓜 ; Cr: 莱氏衣藻 ; Cs: 黄瓜 ; Eg: 冈尼桉 ;
Fa: 草莓 ; Gm: 大豆 ; Le: 番茄 ; M s: 苜蓿 ; N t: 烟草 ; O t: 绿藻 ; Ps: 豌豆 ; Vv: 葡萄。
F ig. 2　Phylogenetic tree of am ino ac id sequences of MD H prote in s from var ious organ ism s
MDH: malate dehydrogenase; gMDH: glyoxysomalMDH; NAD2MDH: NAD2dependentMDH; mMDH: m itochondrialMDH;
cMDH: chlorop lastMDH; pMDH: peroxisomalMDH; neMDH: nodule2enhanced MDH. Cj: C itrus junos; A t: A rabidopsis thaliana;
Bn: B rassica napus; Cl: Citru llus lanatus; Cr: Chlam ydom onas reinhardtii; Cs: Cucum is sativus; Eg: Eucalyptus gunnii;
Fa: Fragaria ×ananassa; Gm: Glycine m ax; Le: Lycopersicon esculentum ; M s: M edicago sativa; N t: N icotiana tabacum ;
O t: O streococcus tauri; Ps: Pisum sativum ; Vv: V itis vin ifera.
212　C jM D H 基因的结构分析
香橙基因组 DNA经 D raⅠ、EcoRⅠ、EcoRV、
X baⅠ完全酶切 , 经过 017%琼脂糖凝胶电泳后转
膜 , 从 pGEM中间载体中 EcoRⅠ酶切出的 C jMDH
全序列作为探针进行杂交。
Southern杂交结果显示 , D ra Ⅰ、 EcoR Ⅰ、
EcoRV、X baⅠ完全酶切香橙基因组 DNA的不同
酶切产物 , 均只检测到单一信号 , 且这些信号处
于不同位置 , 表明 C jMDH在香橙基因组中很有可
能以单拷贝形式存在 (图 3)。
图 3　香橙 C jMDH 基因的 Southern blot结果
Fig. 3　Southern blot analysis of CjMDH in Citrus junos
213　C jM D H 基因的表达特性分析
分别提取香橙根、茎、叶等组织 RNA , 经过变性凝胶电泳后转膜。以 C jMDH基因序列为探针进
行的 Northern分析发现 , C jMDH基因在香橙的根和叶中检测到表达信号 , 在根中表达较强 , 在茎中
没有观察到明显的杂交信号 , 表明该基因在根和叶中优势表达 (图 4)。定量 PCR分析结果与 North2
ern杂交结果一致 , C jMDH基因在根中表达高于叶和茎 , 在根中的相对表达量分别是茎和叶的 11倍
和 3倍 (图 5)。
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214　C jM D H 转基因烟草的表达水平分析与耐铝试验
为了验证 C jMDH的功能 , 将组成型启动子 CaMV35S驱动的 C jMDH基因导入烟草中 , 在其 T2代
中筛选出 C jMDH基因表达水平提高的转基因株系。Northern分析表明 , 在所检测的转基因株系中 ,
C jMDH22、C jMDH25和 C jMDH212株系检测到目的基因的表达信号 , 其中 C jMDH22和 C jMDH212株系
中表达量最高 (图 6)。
将 C jMDH22和 C jMDH212株系 T2代幼苗在 015 mmol·L - 1 CaCl2水培条件下添加 20μmol·L - 1
A l3 +进行铝胁迫处理。结果显示 , 转基因株系根的相对伸长量高于野生型 (图 7)。
从 C jMDH基因的表达分析结果来看 , C jMDH22的表达量强于 C jMDH212, 同时在铝胁迫处理后根
的相对伸长量也高于 C jMDH212株系 , 表明提高 C jMDH基因在烟草中的表达可以增加植株对铝毒的耐
受性。
　　在仅有 CaCl2和 A l3 +存在水培条件下 , 铝胁迫试验能很好地反应幼苗根对铝毒的敏感性。但由于
其营养成分单一 , 在长时间铝处理时不能真实反映铝毒对植株的影响。因此将转基因株系 C jMDH22
和野生型在 MS培养基 (pH 413) 上进行较长时间 ( 25 d) 胁迫处理。处理中发现 , 处理环境改变
后 , 烟草幼苗对 20μmol·L - 1 A l3 +铝毒不再敏感。结合前人的研究结果 , 在 MS培养基上的铝胁迫浓
度定为 50μmol·L - 1 A l3 + , 然后观察其生长状况 , 结果发现 , 野生型根的生长状况良好 , 并无明显
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伸长受抑制的现象 , 但转基因烟草地上部分生长状况优于野生型 , 主茎伸长长度和每株叶片数均高于
野生型 (图版 , A) , 表明在铝胁迫环境中提高 C jMDH基因的表达可促进转基因植株地上部的生长。
因苏木精染料能结合铝离子显色 , 着色深浅与铝的累积多少有关 (CanÔado et al. , 1999)。将胁
迫处理后的植株根进行苏木精染色发现 , 转基因株根尖部着色浅 , 而野生型根尖着色较深 (图版 ,
B )。野生型较转基因植株积累更多的铝离子在根尖部。以上结果说明在 MS培养基中 , 转入 C jMDH
的转基因烟草能促进植株地上部分的生长和降低根部对铝的累积 , 改善转基因植株在铝环境中的生长状
况。
图版说明 : A: 转基因烟草株系 CjMDH2的萌发种子在 50μmol·L - 1A l3 +下生长 25 d; B: 在铝胁迫下生长的幼苗根的苏木精染色。
Explana tion of pla tes: A: CjMDH transgenic line 2 and wild type growing in MS medium with 50μmol·L - 1 A l3 + for 25 d growth; B: Roots
after alum inum treatment stained with hematoxylin.
3　讨论
香橙中的 C jMDH编码氨基酸序列和其他植物来源的苹果酸脱氢酶高度保守 , 尤其与苹果酸脱氢
酶功能相关的 NAD和苹果酸结合位点的氨基酸序列完全相同 , 表明 C jMDH具有和其他 MDH相同的
功能。在其蛋白质 N端氨基酸序列存在叶绿体转移肽 , 将蛋白定位于叶绿体上 , 可能参与了叶绿体
中的光合作用以及呼吸电子传递链等途径 , 但系统进化树分析显示香橙 C jMDH与多种豆科植物的根
瘤苹果酸脱氢酶属于同一亚族 , C jMDH很有可能也具有根瘤苹果酸脱氢酶基因相类似的功能。这与
C jMDH基因在香橙根和叶中优势表达的结果相一致。
植物对铝毒的耐受机制复杂 , 通过有机酸提高植物耐铝能力的机制包括有机酸的体内解毒、体外
螯合铝离子和增加对磷的吸收等 (L iao et al. , 2006)。在铝胁迫条件下 , 多种植物根系会增加苹果酸
的分泌来提高对铝胁迫适应能力 (Ma et al. , 2001; Kochian et al. , 2004)。在苜蓿中超量表达苹果酸
脱氢酶基因 , 能够提高转基因植株中苹果酸脱氢酶活性 , 增加根系有机酸的分泌量 , 从而提高转基因
植株对环境铝毒的耐受能力 ( Tesfaye et al. , 2001)。Ma等 (2001) 研究表明有机酸螯合态的铝离子
对植物根尖的伤害较轻。本试验在对 C jMDH转基因烟草进行铝胁迫试验时也发现 , 导入 C jMDH提高
烟草耐铝能力 , 其可能原因是组成型启动子 35S提高了转基因植株中苹果酸脱氢酶基因的表达量 , 增
加了根系苹果酸脱氢酶的活性 , 促使根系分泌了更多的有机酸 , 分泌的有机酸和环境中游离铝离子结
合形成螯合态铝 , 降低了根系游离态铝的存在 , 减少游离态铝和胞液中敏感物质的结合 , 从而提高植
物的耐铝能力。苏木精染色结果显示转基因烟草根尖累积铝离子比野生型少 , 很可能是分泌有机酸螯
合铝离子后使能够进入植物根尖的铝离子量降低 , 减轻了对植株的伤害。这也反映了苹果酸脱氢酶基
因在提高植物对铝毒胁迫因子的适应方面具有重要作用。
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