全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 465 - 468
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 10 - 30; 修回日期 : 2007 - 03 - 12
基金项目 : 江苏省农业三项工程项目 [ sx(2003) 085 ]3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jwu4@njfu1com1cn)
铁线莲 ‘M ulti2Blue’不定芽及体细胞胚发生的初
步研究
张启香 , 方炎明 3 , 吕　梅 , 陈　娜
(南京林业大学森林资源与环境学院 , 南京 210037)
摘 　要 : 用 ‘Multi2B lue’铁线莲的幼叶、茎尖、嫩茎作为外植体进行培养 , 发现外植体来源以茎尖为
最优 , 基本培养基以低盐的 1 /2 MS为最佳。茎尖在附加 015 mg·L - 1 TDZ + 0101 mg·L - 1NAA + 2%蔗糖的
1 /2 MS固体培养基上培养 1个月后芽增殖率达 20018% , 且幼苗长势健壮。茎尖在附加 018 mg·L - 1 TDZ +
015 mg·L - 1NAA + 2%蔗糖的 1 /2 MS固体培养基上培养时可形成淡黄色块状至颗粒状愈伤 , 经多次继代培
养后可逐渐形成胚性愈伤组织 , 胚状体诱导率可达 60% , 进而获得再生植株。
关键词 : 铁线莲 ; 基本培养基 ; 不定芽 ; 体细胞胚
中图分类号 : S 682　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220465204
A Prelim inary Study on Induction of Adven titious Buds and Em bryogenesis
in C lem a tis‘M ulti2Blue’
ZHANG Q i2xiang, FANG Yan2m ing3 , LüMei, and CHEN Na
(College of Forestry Resources and Environm ent, N an jing Forestry U niversity, N anjing 210037, China)
Abstract: In a culture experiment, shoot apexes were the best exp lant and 1 /2 MS was the best basal
medium. Adventitious buds and calli were induced from shoot apexes of C lem atis‘Multi2B lue’which were
cultured on solid 1 /2 MS medium containing 015 mg·L - 1 TDZ + 0101 mg·L - 1 NAA + 2% sucrose and 018
mg·L - 1 TDZ + 015 mg·L - 1NAA + 2% sucrose, respectively. The induction rate of buds was up to 20018%
after one month and the buds were vigorous. Somatic embryos were obtained from the grey yellow lumped and
granular calli through succesive transfer culture. The induction rate of somatic embryos was up to 60% , and it
can be developed to normal seedlings in the same medium.
Key words: C lem atis; Basic media; Adventitious bud; Embryogenesis
铁线莲属 (C lem atis) 植物是常见的园艺栽培植物 , 为多年生毛茛科木质藤本 , 无花瓣 , 萼片花
瓣状 , 大且色彩丰富 , 在垂直绿化中具有重要作用 ( Essig, 1991)。尽管国内对于毛茛科铁线莲属的
研究较多 , 但绝大部分是针对铁线莲属植物的药用价值或对其资源的调查 , 而对于国外铁线莲的引种
栽培及其在园林上的应用研究较少。
C lem atis‘Multi2B lue’是由荷兰引进的一个著名的铁线莲属栽培品种 (图版 , 1) , 有较高的观赏
价值 , 其有性繁殖较困难且难以保持母本的优良性状。
在铁线莲属植物的组织培养方面 , Mandegara和 Sieber ( 2000) 以 C. in tegrifolia ×C. viticella的
节间进行培养获得了体细胞胚 , 但产生的周期长达 18个月 ; Leifert等 (1992) 使用 1 /2 MS培养基对
C. m on tana‘Rubens’进行培养获得丛生芽。
本研究以 ‘Multi2B lue’为材料进行培养 , 在不同基本培养基中附加一定的植物生长调节剂对其
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进行诱导 , 获得高频不定芽和体细胞胚 , 为铁线莲快速繁殖提供了较好的技术支持。
1　材料与方法
以铁线莲 C lem atis‘Multi2B lue’ (图版 , 1 ) 当年生枝条的幼叶、茎尖及嫩茎为外植体 , 洗净后
用 75%酒精消毒 , 无菌水冲洗 , 再用 011%升汞消毒 , 无菌水冲洗后接种于配制好的培养基中培养。
MS培养基中蔗糖 3% , 其他培养基蔗糖 2% ; 琼脂 0168% ; pH 516～518。温度 ( 25 ±1) ℃; 光照
1 500～2 000 lx, 13 h·d - 1 (张启香 等 , 2005)。
丛生芽的诱导增殖、愈伤组织诱导 : 采用 3 (基本培养基 ) ×5 ( TDZ) 的随机区组试验设计。
基本培养基为 1 /2MS、改良 1 /2MS (铁含量为 MS的 2倍 ) 和 MS, 均添加 0101 mg·L - 1 NAA; TDZ
为 0、013、015、018、110 mg·L - 1 (表 1)。茎尖接种 30 d后统计丛生芽增殖系数。
愈伤组织的继代、体细胞胚的形成与分化 : 基本培养基为 1 /2 MS。采用 4 ( TDZ) ×4 (NAA )
随机区组试验设计 (表 2) , 接种 50 d后统计诱导出胚状体的数量及其诱导率。
结构观察时取由茎尖诱导出来的非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织以及愈伤组织再生植株 , O lym2
pus体视解剖镜、倒置显微镜下观察并拍照。
2　结果与分析
211　基本培养基和 TD Z浓度对铁线莲不定芽发生的影响
取铁线莲 ‘Multi2B lue’嫩枝的茎尖作外植体 , 以 1 /2 MS为基本培养基时 , 外植体褐化、玻璃化
程度较低且不定芽叶片伸展正常 , 叶色浓绿 , 质量较高。
以 MS为基本培养基时 , 2～3周开始出现玻璃化苗 , 叶片呈细长条 , 不能正常展开 , 并且呈水渍
状 , 透明 , 较脆易断 , 难以形成健壮植株 (图版 , 12) , 且随着 TDZ浓度的增加症状逐渐明显 , 直至
死亡。
以改良 1 /2 MS为基本培养基时 , 茎基部 2周左右开始褐化 , 不能正常形成丛生芽 , 甚至死亡。
基本培养基和 TDZ的不同组合间有极显著差异 (表 1)。
表 1　不同基本培养基和 TD Z浓度对铁线莲 ‘M ulti2Blue’丛生芽诱导率的影响
Table 1　Effects of ba sic m ed ia and horm ones on adven titious buds forma tion from C lem a tis‘M ulti2Blue’shoot tips
基本培养基
Basal media
TDZ
(mg·L - 1 )
芽增殖率
Rep roduction rate ( % )
幼苗长势
V igour of buds
褐化程度
B rown degree
玻璃化程度
V itrification degree
MS 010 1013 jJ 一般 Common 无 None 少 A little
MS 013 8015 hH 较好 Better 无 None 少 A little
MS 015 17013 cC 较好 Better 无 None 较严重 A little serious
MS 018 16218 dD 一般 Common 无 None 较严重 A litter serious
MS 110 18311 bB 一般 Common 少 A little 严重 Serious
1 /2MS 010 1211 jJ 较好 Better 无 None 无 None
1 /2MS 013 9012 gG 较好 Better 无 None 无 None
1 /2MS 015 20018 aA 很好 Excllent 无 None 无 None
1 /2MS 018 18012 bB 很好 Excllent 无 None 无 None
1 /2MS 110 21013 aA 较好 Better 无 None 少 A little
1 /2MS(2Fe) 010 1015 jJ 死亡 D ie 少 A little 少 A little
1 /2MS(2Fe) 013 5011 iI 死亡 D ie 少 A little 少 A little
1 /2MS(2Fe) 015 10213 fF 一般 Common 少 A little 少 A little
1 /2MS(2Fe) 018 12112 eE 一般 Common 较严重 A little serious 少 A little
1 /2MS(2Fe) 110 9811 fF 死亡 D ie 较严重 A little serious 较严重 A litter serious
　　注 : NAA 0101 mg·L - 1。表中大、小写字母分别表示 P < 0101和 P < 0105显著水平。
Note: NAA 0101 mg·L - 1. Cap tial and little letters indicate significant differences at P < 0101, P < 0105 level, respectively.
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　2期 张启香等 : 铁线莲 ‘Multi2B lue’不定芽及体细胞胚发生的初步研究 　
基本培养基以 1 /2 MS为最佳。当 TDZ浓度为 0时 , 基本培养基对其生长的影响较小 , 芽增殖率
都处于较低的水平 , 随着浓度的增加 , TDZ对丛生芽的效应呈先促进后抑制的趋势 , 以 015 mg·L - 1
效果最佳。
212　TD Z和 NAA配比对愈伤组织的继代、胚状体的形成与分化的影响
将幼叶、茎尖及嫩茎诱导出的愈伤组织 (图版 , 2～4) 转接到继代与分化培养基上进一步培养。
在不同的分化培养基上 , 来源不同外植体的愈伤组织生长状况有明显差异。
在 1 /2MS培养基上培养的部分愈伤组织 , 继代培养约 10月后在由茎尖诱导出的块状至颗粒状愈
伤组织表面逐渐出现绿色不规则突起 (图版 , 9～11) , 其他的愈伤组织则是逐渐失去分化能力 , 直
至褐化死亡。
在 MS培养基上继代培养的愈伤组织 , 在培养 2周左右表面开始出现红褐色覆盖物 , 且愈伤组织
逐渐水渍化 , 块状愈伤表面光滑 , 无颗粒状突起 , 有时内部出现空腔或分化出成熟组织 , 出现导管等
结构 , 直至完全失去分化能力 (图版 , 7)。
在改良 MS培养基上培养的愈伤组织 , 2～3周后逐渐褐化死亡 , 可能是由于高浓度的铁盐所致。
在倒置显微镜下镜检发现 , 块状愈伤组织的细胞为椭圆形至圆形 , 细胞质较浓 (图版 , 5、6) ,
而水渍状愈伤组织多由长形、空胞细胞组成 (图版 , 8)。因此 , 应选择较小的块状愈伤组织作为进
一步继代培养和诱导体细胞胚发生的材料 , 但体细胞胚发生频率较低 , 如何提高其体细胞胚的发生
率 , 仍待进一步研究。
图版说明 : 1. 铁线莲 ‘Multi2B lue’的生长状况 ; 2. 幼叶愈伤组织的生长情况 ; 3. 嫩茎愈伤组织的生长情况 ; 4. 茎尖愈伤组织的生
长情况 ; 5. 胚性块状至颗粒状愈伤组织 ; 6. 胚性愈伤组织的细胞 ; 7. 水渍状愈伤组织 ; 8. 水渍状愈伤组织的细胞 ; 9, 10. 体细胞
胚萌发 ; 11. 块状愈伤组织中的体细胞胚萌发 ; 12. 块状愈伤组织萌发的白化苗。
Explana tion of pla tes: 1. Grow state of Clem atis‘Multi2B lue’; 2. Callus induced from leaves; 3. Callus induced from stalks; 4. Callus in2
duced from shoot tip s; 5. Somatic callus; 6. Cells of somatic callus; 7. V itrified callus; 8. Cells of vitrified callus; 9 - 11. Somatic embryos
sp routed from lump callus; 12. W hite seedlings sp routed from lump callus.
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　　表 2表明 , TDZ、NAA间不同浓度的组合差异极显著。胚状体的诱导率随着 TDZ浓度的升高而
增加 , 018 mg·L - 1时诱导率最佳 , 但 115 mg·L - 1时易玻璃化 , 叶片呈条形 , 不能正常伸展 , 诱导率
下降 (陈云凤 等 , 2006)。NAA在一定的浓度范围内对胚状体的诱导影响不大 (瞿素萍 等 , 2006) ,
其中 018 mg·L - 1 TDZ + 015 mg·L - 1NAA的组合为最佳 , 诱导率达到 60%。
表 2　TD Z和 NAA对铁线莲 ‘M ulti2Blue’愈伤组织的影响
Table 2　Effects of TD Z and NAA on ca llus induction from explan ts of C lem a tis‘M ulti2Blue’
TDZ
(mg·L - 1 )
NAA
(mg·L - 1 )
接种数
Number of incubation
胚状体数
Number of embryoid
诱导率
Induction rate ( % )
0 011 50 0 0
0 015 45 0 0
0 110 48 0 0
0 210 51 0 0
013 011 45 8 1717hH
013 015 45 10 2212ghG
013 110 53 11 2017hG
013 210 55 7 1217 iI
018 011 56 23 4111cC
018 015 50 30 6010aA
018 110 48 25 5211bB
018 210 45 22 4818bB
115 011 48 18 3715dD
115 015 54 15 2717fF
115 110 55 13 2316gG
115 210 60 19 3116eE
　　注 : 表中大、小写字母分别表示 P < 0101和 P < 0105显著水平。
Note: Cap tial and little letters indicate significant differences at P < 0101, P < 0105 level, respectively.
铁线莲 ‘Multi2B lue’在培养过程中 , 不同部位的外植体来源和在不同基本培养基条件下 , 所产
生的愈伤组织的颜色和质地均有所区别 , 其中以茎尖诱导的块状愈伤组织为最佳 , 且能发育成正常植
株 , 但其培养周期较长。在培养过程中 , 外植体极易出现玻璃化现象 , 一旦发生很难逆转 , 试验发现
降低培养基中的盐浓度 , 如用 1 /2 MS培养基能有效缓解此症状。
References
Chen Yun2feng, Zhang Chun2rong, Huang Xia, Huang Xue2lin. 2006. Effect of TDZ on somatic embryogenesis of p lant. Plant Physiology Com2
munications, 42 (1) : 127 - 133. ( in Chinese)
陈云凤 , 张春荣 , 黄　霞 , 黄学林. 2006. TDZ对植物体细胞胚胎发生的作用. 植物生理学通讯 , 42 (1) : 127 - 133.
Essig F B. 1991. Seedling morphology in C lem atis (Ranunculaceae) and its taxonom ic imp lications. Sida, 14: 377 - 390.
Leifert C, Camotta H, W aitesW M. 1992. Effect of combinations of antibiotics on m icrop ropatated Clem atis, D ephin ium , Hosta, Iris and Phote2
nia. Plant Cell Tiss. O rg. Cult. , 29: 153 - 160.
Mandegaran Z, Sieber V K. 2000. Somatic embryogenesis in Clem atis in tegrifolia ×C. viticella. Plant Cell, Tussue and O rgan Culture , 62: 163
- 165.
Qu Su2p ing, Xiong L i, L i Shu2fa, W ang L i2hua, Tang Kai2xue. 2006. Establishment of p lant regeneration from leaves exp lants of wild Roscoea
cautleoides in Yunnan. Acta Horticulturae Sinica, 33 (2) : 441 - 444. ( in Chinese)
瞿素萍 , 熊　丽 , 李树发 , 王丽花 , 唐开学. 2006. 云南野生早花象牙参叶片再生体系的建立. 园艺学报 , 33 (2) : 441 - 444.
Zhang Q i2xiang, Fang Yan2m ing, Hu Heng2kang, Huang Shao2hui. 2005. Tissue culture of Ham am elis m ollis O liv. Plant Physiology Communica2
tions, 41 (5) : 637. ( in Chinese)
张启香 , 方炎明 , 胡恒康 , 黄绍辉. 2005. 金缕梅的组织培养. 植物生理学通讯 , 41 (5) : 637.
864