全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (3) : 409 - 414
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 09 - 25; 修回日期 : 2008 - 01 - 10
基金项目 : 国家博士点基金项目 (20060019043) ; 北京市科技计划项目 (H020620110130)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhaolj5073@ sina1com)
根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立
尚爱芹 1, 2 , 田传卫 1 , 赵梁军 13 , 田颖川 3
(1 中国农业大学观赏园艺与园林系 , 北京 100094; 2 河北农业大学园艺学院 , 河北保定 071001; 3 中国科学院微生物
研究所 , 北京 100080)
摘 　要 : 在建立北海道黄杨 ( Euonym us japonicus‘Cu Zhi’) 再生体系的基础上 , 建立其遗传转化体
系 , 以获得转雪花莲外源凝集素 ( Galanthus nivalis agglutinin, GNA ) 基因植株。采用根癌农杆菌 (A gr2
robacterium tum efaciens, LBA4404菌株 ) 介导法 , 研究影响北海道黄杨遗传转化的若干因素。结果表明 , 预
培养与否、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等对转化频率都有一定的影响。在遗传转化过程中 , 不经预
培养 , 根癌农杆菌浓度 OD600 = 016, 侵染下胚轴 40 m in, 再共培养 3 d, 有利于获得最高遗传转化效率。抗
性植株经 PCR和 DNA2Southern blot检测表明 , 目的基因已整合到北海道黄杨基因组中。
关键词 : 北海道黄杨 ; 雪花莲外源凝集素基因 ; 遗传转化
中图分类号 : S 687　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0320409206
Establishm en t of Genetic Tran sforma tion System of Euonym us japon icus
‘Cu Zh i’M ed ia ted by A grobac te rium tum efac iens
SHANG A i2qin1, 2 , TIAN Chuan2wei1 , ZHAO L iang2jun13 , and TIAN Ying2chuan3
(1D epartm ent of O rnam ental Horticulture and Landscape A rchitecture, China A gricultural U niversity, B eijing 100094, China;
2 College of Horticu lture, Hebei A gricu ltura l U niversity, B aod ing, Hebei 071001, China; 3 Institu te of M icrobiology, the Chinese
A cadem y of Sciences, B eijing 100080, China)
Abstract: In order to p rovide genetically imp roved new germp lasm resources and achieve the GNA trans2
genic p lants of Euonym us japon icus‘Cu Zhi’, genetic transformation system was established based on the sys2
tem of regeneration. Several factors affected genetic transformation of Euonym us japon icus‘Cu Zhi’mediated
by A g robacterium tum efaciens (LBA4404) were studied. The results showed that p reculture or not, bacterial
concentrations, the time of infection and co2cultivation had some effect on transformation frequency. The high2
est transformation frequency was obtained through the following transformation p rocedure after p reculture for 0
d, the exp lants were infected for 40 m in with the concentration of A grobacterium tum efaciens OD600 = 016, and
then co2cultivated for 3 d. The PCR and PCR2Southern blotting analysis showed the snowdrop lection gene was
integrated into the genome of Euonym us japon icus‘Cu Zhi’. The system of genetic transformation of Euony2
m us japon icus‘Cu Zhi’’could p rovide new germp lasm resource used in genetic imp rovement of Euonym us ja2
pon icus‘Cu Zhi’and the other p lants of Euonym us.
Key words: Euonym us japon icus; snowdrop lectin gene (GNA ) ; genetic transformation
北海道黄杨 ( Euonym us japon icus‘Cu Zhi’) 是卫矛科卫矛属的常绿阔叶树 , 引自日本 , 经过多
年的栽植驯化 , 已成为适合中国北方气候条件的优良树种 , 具有极强的耐寒 (- 2319 ℃) 性和极高
的观赏价值。但卫矛属植物常受蚜虫和介壳虫等的危害 (Hodgson & Godfracy, 1999) , 目前主要采用
药物防治 , 但花费高 , 而且污染环境。
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
已有研究证实雪花莲外源凝集素 (Galan thus n iva lis agglutinin, GNA ) 对某些咀嚼式和刺吸式昆
虫有抗性 (H ilder et al. , 1995; 周岩 等 , 1996, 1998)。向北海道黄杨中导入 GNA基因有可能提高其
抗虫性。目前 , 对北海道黄杨的研究主要集中在组培快繁 (李云 等 , 2003; 刘晓东和周鑫 , 2003)
和植株再生 (尚爱芹 等 , 2005) 等方面。
作者在建立北海道黄杨高效再生体系的基础上 , 建立其 GNA基因转化体系 , 以期获得转 GNA基
因的植株 , 为培育北海道黄杨抗虫新品种提供新材料。
1　材料与方法
111　材料
北海道黄杨 ( Euonym us japon icus‘Cu Zhi’) 取自北京市园林科研所苗圃 , 试验以北海道黄杨种
子的下胚轴为外植体进行遗传转化。
112　农杆菌介导的遗传转化
根癌农杆菌 (A grobacterium tum efaciens) 菌株 LBA4404和双元表达载体 pBCGm由中国科学院微
生物研究所提供 ( Yuan et al. , 2001)。双元表达载体 pBCGm含有 CoYMV启动子调控下的 GNA基因
(图 1)。
图 1　双元表达载体 pBCGm含有 CoYM V启动子调控下的 GNA基因
F ig. 1　D iagram of b inery vector pBCGm w ith GNA gene
将长度为 5～6 mm的下胚轴外植体接种于芽分化培养基 (尚爱芹 等 , 2005) 上 , 每个处理 10个
板 , 每板约 10个外植体 , 预培养 0～4 d。
用浓度为 OD600 = 012～110的根癌农杆菌 LBA4404菌液侵染预培养后的外植体 , 以未侵染的外植
体为对照。
侵染时间为 10～40 m in, 侵染后 , 用无菌滤纸将外植体周围菌液吸干 , 转接到分化培养基上 , 黑
暗条件下共培养 1～4 d, 同时在共培养培养基中附加 0 (对照 )、50、100、200μmol·L - 1的乙酰丁
香酮 (AS) , 以研究其对转化效率的影响。然后将经共培养的外植体转接入添加有 30 mg·L - 1 Kan
( kanamycin) 和 300 mg·L - 1 Carb ( carbenicilin) 的筛选培养基上。当抗性植株长到 3～5 cm时 , 转
入添有 30 mg·L - 1 Kan的 1 /2MS生根培养基上进行生根培养。
113　转基因植株的分子检测
剪取抗性植株和非转化植株的细嫩叶片 , 采用 CTAB 法 ( Tai & Tanksley, 1990 ) 提取基因组
DNA。以提取的 DNA为模板 , 根据 pBCGm载体中 GNA基因序列合成 2对特异引物 (上海生工 ) : 上
游引物 : P1: 5′2GGCTAAGGCAAGTCTCCTCAT23′; 下游引物 : P2: 5′2ACTTTGCGGTCACGAGCTTGAT2
3′。
PCR反应体系为 25μL, 反应条件 : 94 ℃起始变性 5 m in; 94 ℃变性 40 s, 60 ℃复性 50 s, 72 ℃
延伸 1 m in, 30个循环 ; 72 ℃最终延伸 5 m in。采用常规方法进行 PCR扩增。对阳性样品 DNA酶切、
电泳和转移至尼龙膜 , 用地高辛试剂盒 (购自 Roche公司 ) 标记的 GNA基因 479 bp探针杂交 , 进行
Southern blot检测。
014
　3期 尚爱芹等 : 根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立 　
2　结果与分析
211　抗性植株的获得
共培养后的外植体在再生培养基上培养 30 d左右 (图 2, A ) , 未转化成功的外植体逐渐褐化 ,
即使有再生芽 , 也会逐渐白化死亡 ; 只有少数抗性芽能在选择培养基上生长 , 逐渐长大 (图 2, B )。
当再生芽长到 3～5 cm时 , 切下进行继代培养 (图 2, C)。
切取继代选择 3次以上的抗性苗 , 转入生根培养基中 , 约 20 d左右 , 部分幼苗基部可生出不定
根 , 形成转化植株 (图 2, D)。
对 2 600段下胚轴外植体进行了侵染转化 , 共得到 46株有 Kan抗性的阳性植株。
图 2　北海道黄杨不定芽再生 ( A)、Kan抗性植株 ( B)、再生不定芽的继代培养 ( C) 和转基因植株生根 ( D )
F ig. 2　Adven titious shoots regenera tion ( A) , Kan2resistan t shoot ( B) , prolifera tion of regenera tion
shoots of hypocotyl ( C) and rooting of trangenetic plan t ( D ) of
Euonym us japon icus‘Cu Zh i’
212　转化条件的优化
21211　预培养时间 　
对北海道黄杨下胚轴外植体分别进行 0、1、2、3、4 d预培养 , 6周后统计不定芽再生率。未经
预培养的外植体抗性芽形成率最高 , 为 3192% ; 随预培养时间的延长 , 抗性芽诱导率呈下降趋势 ,
预培养 4 d时转化率仅为 0194% , 说明预培养时间延长 , 细胞已处于转化的不敏感期 , 不利于农杆菌
的侵染和 T2DNA的整合 , 转化率降低。
21212　共培养时间 　
将侵染后的下胚轴切段在黑暗条件下共培养 0～4 d后转入选择培养基 , 结果 (表 1) 表明 , 若
不进行共培养 , 即将外植体侵染后直接接种在选择培养基 , 农杆菌很难侵入 , 没有获得转化植株 ; 共
培养 1 d时 , 农杆菌菌落生长量较少 , 最终也没有得到转化植株。共培养 3 d时 , 在外植体周围可见
明显的农杆菌菌落 , 切口处农杆菌最多 , 其转化效率达到 4100% ; 继续共培养 , 农杆菌生长过度 ,
外植体褐化死亡 , 转化率下降为 1198%。
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
表 1　共培养时间对北海道黄杨转化频率的影响
Table 1　Effects of coculture tim e on tran sforma tion frequency of Euonym us japon icus‘Cu Zh i’
共培养时间 / d
Co2cultivation day 外植体数Number of exp lant 抗性芽再生率 /%Regeneration rate of resistant shoot
0 106 0
1 105 0
2 102 1196b
3 100 4100a
4 101 1198b
　　注 : 根癌农杆菌菌液浓度为 OD600 = 015, 侵染时间 30 m in, 预培养 0 d。不同字母表示差异显著 ( P < 0105)。
Note: Agrobacterium tum efaciens solution was originally OD600 = 015, infection time was 30 m in, p reculture time was 0 d. The same letters in
the same column were not significantly different at P < 0105 by Duncanpis multip le range test.
21213　根癌农杆菌浓度和侵染时间 　
由表 2可见 , 当根癌农杆菌浓度 OD600 = 012时 , 各处理的外植体周围均没有明显的菌落形成 ,
因此均没有得到抗性芽 ; 随着浓度的增加 (OD600 = 014～016) 和侵染时间 ( 30～40 m in) 的延长 ,
转化率呈上升趋势 , 随侵染浓度和侵染时间进一步升高和延长 , 外植体周围则附着过多农杆菌 , 造成
外植体褐化死亡。OD600 = 016, 侵染时间为 40 m in时 , 抗性芽再生率最高 , 为 6110%。因此 , 菌液
浓度过低 (OD600 = 012) 或过高 (OD600 = 110) 均对转化不利。而当根癌农杆菌浓度在 OD600 = 014～
018范围内 , 浓度高时适当缩短侵染时间 , 浓度低时适当延长侵染时间均可以得到较高的转化率。
表 2　根癌农杆菌浓度和侵染时间对北海道黄杨遗传转化的影响
Table 2　Effect of A grobacterium tum efaciens concen tra tion s and infection tim es on
tran sforma tion of Euonym us japon icus‘Cu Zh i’
菌液浓度
Bacterial
concentration
(OD600 )
侵染时间
/m in
Infection
time
抗性芽再生率 /%
Regeneration
rate of
resistant shoot
菌液浓度
Bacterial
concentration
(OD600 )
侵染时间
/m in
Infection
time
抗性芽再生率 /%
Regeneration rate
of resistant
shoot
菌液浓度
Bacterial
concentration
(OD600 )
侵染时间
/m in
Infection
time
抗性芽再生率 /%
Regeneration
rate of resistant
shoot
012 10 0 016 10 0 110 10 0
20 0 20 2190c 20 1186cd
30 0 30 4191b 30 0191d
40 0 40 6110a 40 0
014 10 0 018 10 1100d
20 1100d 20 3126c
30 3110c 30 5106b
40 5107b 40 1192cd
　　注 : 侵染外植体数约为 100个 , 未经预培养 , 共培养 3 d。不同字母表示差异显著 ( P < 0105)。
Note: Exp lant number was nearly to 100, p reculture time was 0 d, co2cultivation time was 3 d. The same letters in the same column were not
significantly different at P < 0105 by Duncanpis multip le range test.
21214　乙酰丁香酮 (AS) 　
在共培养基中附加不同浓度的乙酰丁香酮 , 下胚轴不定芽分化在处理和对照间没有明显差别 , 说
明乙酰丁香酮对北海道黄杨不定芽的分化影响不明显 (数据未列出 )。
213　转基因植株的分子检测
经 Kan初步筛选获得的 46株 Kan抗性小苗 , 再经继代扩繁 3～4次 , 取顶部叶片提取 DNA , 进
行 PCR扩增 , 其中有 3株 (5、7、9号 ) 扩增出与阳性对照相同的 479 bp条带 (图 3) , 而非转化植
株则没有扩增出条带。
进一步对出现目的条带的 3株进行 Southern blot检测 (图 4) , 对照和 5号抗性株没有杂交信号 ,
其可能是假阳性植株 ; 抗性株 7号和 9号有明显的杂交信号 , 表明外源 GNA基因已经整合到其基因
组中 , 且均为单拷贝。目前正在对转基因植株进行进一步的抗虫性检测及遗传稳定性检测等研究。
214
　3期 尚爱芹等 : 根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立 　
214　转基因植株的遗传转化率
试验中共侵染 2 600段下胚轴外植体 , 产生了 46株卡那霉素抗性植株 , 通过对抗性植株的 PCR
和 Southern blot检测验证 , 有 3株扩增出与外源 GNA基因相同的 479 bp的片段 , 但只有 2株将外源基
因转移到了植物的基因组中 , 其最终转化率仅为 0108%。
3　讨论
本研究中所采用的以下胚轴为外植体的遗传转化过程具有再生芽迅速 , 易操作的优点 , 从侵染到
抗性芽的出现仅需 4～6周。但是下胚轴在应用时存在着数量有限、切口小、再生芽数量少以及转化
效率低等局限性。本研究的最终转化率仅为 0108% , 因此 , 如何提高其遗传转化效率还有待于进一
步深入研究。
关于外植体在转化前进行预培养的效果 , 有许多不同的报道。预培养对菊花 (王关林 等 ,
2004) 和苜蓿 (梁慧敏 等 , 2005) 的遗传转化是非常必要的 ; 而烟草 (柴红梅 等 , 2002) 的叶片
则不需预培养。在番茄上有报道认为需要进行预培养 (吴昌银 等 , 2000) , 但也有预培养使转化率
降低的报道 , 如番茄 (王关林和方宏筠 , 2002) 叶片未经预培养的 Gus瞬时表达率为 34% ～35% ,
而预培养 1～2 d后 , 其表达率下降到 10%以下。本研究中 , 未经预培养的转化率最高 , 而随着预培
养时间的延长 , 抗性芽的诱导率呈下降的趋势 , 说明预培养对转化有抑制作用。
乙酰丁香酮是基因转化中常用的诱导能力最强的酚类化合物 , 对单子叶植物的遗传转化有很大帮
助。而在双子叶植物中 , 不同的植物种类却有不同的要求 (王关林和方宏筠 , 2002)。很多双子叶植
物由于其组织和器官受伤后可以分泌类似酚类或酮类的物质 , 因此对 AS没有很强的依赖性 , 在没有
AS存在的情况下仍然可以获得一定的转化效率。洪波等 (2005) 报道 , 在对菊花进行遗传转化的过
程中 , 筛选培养基中附加不同浓度的 AS, 叶盘不定芽分化在处理和对照间没有明显差别 , 说明 AS对
菊花不定芽分化影响不明显。本试验在共培养过程中添加 AS没有得到明显的效果 , 可能就是因为卫
矛属植物在器官受伤后产生较多酚类物质的缘故。
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