全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（6）：1139–1152 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–11–23；修回日期：2013–05–02
基金项目：北京市自然科学基金项目（6122008）；北京市属高等学校人才强教计划项目（PXM2012-014207）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：guanxl3152@sina.com）
低温胁迫下北海道黄杨叶肉细胞 Ca2+ 和
Ca2+-ATPase 的变化
杨 蕊，关雪莲*，张睿鹂，杨文莉，郑 健，冷平生
（北京农学院园林学院，北京 102206）
摘 要：利用焦锑酸钙沉淀和硝酸铅沉淀的电镜细胞化学方法，以室温生长的北海道黄杨植株为对
照，研究了人工 4 ℃低温胁迫过程中北海道黄杨（Euonymus japonicus‘Cuzhi’）叶肉细胞 Ca2+和
Ca2+-ATPase 的动态变化。在 4 ℃低温胁迫的初期（3 ~ 12 h），北海道黄杨叶肉细胞间隙和液泡内的 Ca2+
沉淀颗粒减少，而细胞质和细胞核内的 Ca2+水平升高，但 Ca2+-ATPase 在细胞的分布几乎没有变化，主要
分布在质膜和液泡膜上，有较高的活性；低温胁迫 24 h，细胞质和细胞核内增加的 Ca2+开始回到细胞间
隙和液泡中，Ca2+-ATPase 在质膜和液泡膜上活性增强；在低温胁迫 48 ~ 96 h，细胞内的 Ca2+又回到低温
胁迫前的低水平，但 Ca2+-ATPase 在质膜和液泡膜上仍有很高的活性。叶肉细胞内 Ca2+稳态平衡和
Ca2+-ATPase 的活性变化与植物的抗寒性存在一定的相关性。
关键词：北海道黄杨；低温胁迫；Ca2+；Ca2+-ATPase；叶肉细胞
中图分类号：S 687 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）06-1139-14

Changes of Ca2+ and Ca2+-ATPase in the Mesophyll Cells of Euonymus
japonicus‘Cuzhi’Under Cold Stress
YANG Rui，GUAN Xue-lian*，ZHANG Rui-li，YANG Wen-li，ZHENG Jian，and LENG Ping-sheng
（College of Landscape，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）
Abstract：Changes of Ca2+ and Ca2+-ATPase in the mesophyll cell of Euonymus japonicus‘Cuzhi’
at 4 ℃ were investigated with electromicroscopic-cytochemical methods of calcium antimonate and lead
nitrate precipitate. It is shown in the evidences that，compared with that of the plant at room temperature，
the number of calcium particles in intercellular spaces and vacuoles of the mesophyll cell decreased，but
that in the cytoplasm significantly increased at the early stage（at 4 ℃ from 3 hours to 12 hours）.
However，there was almost no changes of Ca2+-ATPase distribution. The plasma and vacuoles membrane
showed high activity of Ca2+-ATPase simultaneously. After 24 hours at 4 ℃，Ca2+ in cytoplasm and
nucleus which increased before began to go back to the intercellular spaces and the vacuoles，Ca2+-ATPase
activity on plasma and vacuoles membrane was enhanced. At 4 ℃ from 48 hours to 96 hours，Ca2+
concentration in the cytoplasm restored to the lower resting level，the same as that before the cold stress，
yet the plasma and vacuoles membrane still showed high activity of Ca2+-ATPase. Thus it could be concluded

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that there is certain relativity between Ca2+ homeostasis and dynamic changes of Ca2+-ATPase with the
plant cold resistance.
Key words：Euonymus japonicus；cold stress；Ca2+；Ca2+-ATPase；mesophyll cell

Ca2+是一种调节多种细胞功能的细胞内第二信使，在植物的生长发育以及对生物和非生物逆境
胁迫的响应起着重要作用（McAinsh & Pittman，2009；DeFalco et al.，2010），而且植物更易使用
Ca2+作为信使，因为已经发现几乎所有的信号（如生长、激素、胁迫方面）都会引起植物细胞质 Ca2+
分布的变化，或引起细胞核和细胞器 Ca2+分布的变化（Anireddy et al.，2011），这种变化可以影响
细胞核基因的转录与表达，最终调节植物细胞的生长发育和生理代谢。胞质内钙离子水平调节是通
过很多调节机制来完成的，其中钙泵，即 Ca2+-ATPase，通过把胞质内的 Ca2+泵出细胞外，维持细
胞内 Ca2+的稳态。钙泵是胞质内钙离子水平的重要调节机制（肖平 等，2008），现已证实 Ca2+-ATPase
存在于质膜、内质网、高尔基体和液泡膜，可能还存在于叶绿体外膜上（Bonza et al.，1998）。
近年来关于低温引起植物细胞内 Ca2+分布变化有很多的研究，其中大多集中在一年生的草本植
物上（王红 等，1994；雷江丽 等，2000），而对多年生的常绿阔叶木本植物的研究较少，另外同步
研究低温胁迫过程中常绿阔叶木本植物 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的时空动态变化研究还鲜有报道。北海
道黄杨是中国北方园林绿化广泛使用的常绿阔叶植物，对低温、盐、有害气体等逆境具有较强的抗
性；另外，由于木本植物采取的抗寒策略不同于草本植物，特别是作为能在北方冬季露天过冬的常
绿阔叶木本植物，其极度抗寒的机理更值得深入研究。在前期对一些常绿阔叶木本植物叶肉细胞在
低温胁迫过程中超微结构变化观察（葛秀秀 等，2010）和露天越冬的北海道黄杨叶肉细胞内 Ca2+
的动态变化的基础上（杨蕊 等，2012），本试验中采用焦锑酸钙沉淀和硝酸铅沉淀电镜细胞化学法，
通过在透射电子显微镜下观察 4 ℃低温胁迫过程中北海道黄杨叶肉细胞 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的时空
动态变化，研究北海道黄杨冷响应的细胞学机理。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2010 年 3 月，选取北京农学院学院内露天栽培的北海道黄杨（Euonymus japonicus‘Cuzhi’）进
行扦插，植株生根后，移栽入盆。盆栽苗在温室中进行培养，定期浇水以保持土壤湿度。9 月末，
选取温室中生长健壮，株高 30 ~ 40 cm 的扦插植株，置于冰箱中进行 4 ℃低温胁迫处理，在胁迫处
理的 0、3、12、24、48、96 h，分别取植株中部功能叶进行测试。以室温栽培的植株作为对照。
1.2 试验方法
1.2.1 Ca2+的定位及分布观察
采用王红等（1994）的焦锑酸钙电镜细胞化学方法：取清洗干净的叶片，在叶中脉至叶缘约 1/2
处剪取面积为 0.5 mm × 0.5 mm 的叶片小块，迅速投入用 2%焦锑酸钾（pH 7.6，用 100 mmol · L-1 pH
7.1 的磷酸缓冲液配制）配制的 3%戊二醛中，室温下固定 48 h。之后用含 2%焦锑酸钾的磷酸缓冲
液（pH 7.6）洗涤 4 次，每次约 0.5 h。将洗涤过的小叶片块转移至用含 2%焦锑酸钾的缓冲液（pH 7.6）
配制的 1%锇酸中，室温固定 3 h；然后先用重蒸水洗涤 4 次，再用 pH 10.0 的重蒸水（用 0.1 mol · L-1
KOH 调节 pH）洗涤 2 次，每次约 0.5 h。随后经 30%、50%、70%、80%、90%、95%系列乙醇脱水
各 0.5 h，100%乙醇脱水 2 次，每次 0.5 h，最后用丙酮置换 3 次，每次 7 ~ 15 min。把脱水后的叶片
6 期 杨 蕊等：低温胁迫下北海道黄杨叶肉细胞 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的变化 1141

块放入用丙酮稀释的 812 环氧树脂（比例为 3︰1）中，在 35 ℃恒温箱中渗透 1 d，最后用 812 环氧
树脂进行包埋。在 37 ℃恒温箱聚合 12 h 后继续在 45 ℃下聚合，24 h 后再在 60 ℃下继续聚合 48 h。
聚合好的包埋块经过修整，用 Leica EMUC7 型超薄切片机切片，切片经醋酸双氧铀染色，在
Hitachi-7600 型透射电子显微镜下观察、照相。
对照切片的处理：将在电镜下已确定有焦锑酸钙沉淀的定位切片漂浮在 100 mmol · L-1 的 EGTA
（pH 8.0）溶液中，在 60 ℃下保温 0.5 ~ l.0 h，使 EGTA 与 Ca2+鳌合，脱去原沉淀中的 Ca2+，然后
再把处理过的切片置于电镜下观察、照相。
1.2.2 Ca2+-ATPase的定位及分布
用 Jian 等（1999）的硝酸铅沉淀电镜细胞化学方法：取清洗干净的叶片，在叶中脉至叶缘约 1/2
处剪取面积为 0.5 mm × 0.5 mm 的叶片小块；迅速投入用 50 mmol · L-1（pH 7.2）二甲胂酸钠缓冲液
配制的 4%多聚甲醛与 2.5%戊二醛的混合固定液中，室温下初固定 48 h。之后用 50 mmol · L-1（pH 7.2）
二甲胂酸钠缓冲液清洗 4 次，每次 0.5 h。将洗涤过的材料转移到酶孵育液中，37 ℃下孵育 2.5 h。
酶孵育液的配方为：50 mmol · L-1（pH 7.2）Tris-maleate缓冲液[含有2 mmol · L-1的ATP钠盐，Pb(NO3)2
3 mmol · L-1，MgSO4 · 7H2O 5 mmol · L-1]。对照处理：在酶孵育液中不加 ATP 钠盐，加入 NaF 0.5
mmol · L-1。孵育反应后，先用 50 mmol · L-1（pH 7.2）的 Tris-maleate 缓冲液洗 2 次，每次 0.5 h，
再用 50 mmol · L-1（pH 7.2）二甲胂酸钠缓冲液洗 2 次，每次约 0.5 h；将洗涤过的小叶片块转移至
用 50 mmol · L-1（pH 7.2）二甲胂酸钠缓冲液配制的 1%锇酸中，室温固定 3 h；然后用重蒸水洗涤 2
次，每次约 0.5 h。随后经 30%、50%、70%、80%、90%、95%系列乙醇脱水各 0.5 h，100%乙醇脱
水 2 次，每次 0.5 h，最后用丙酮置换 3 次，每次 7 ~ 15 min。把脱水后的小叶片块放入用丙酮稀释
的 812 环氧树脂（比例为 3︰1）中，在 35 ℃恒温箱中渗透 1 d，最后用 812 环氧树脂进行包埋。在
37 ℃恒温箱聚合 12 h 后，继续在 45 ℃下聚合 24 h；再在 60 ℃下继续聚合 48 h。
聚合好的包埋块经过修整，用 Leica EMUC7 型超薄切片机切片，切片经醋酸双氧铀染色，在
Hitachi-7600 型透射电子显微镜下观察照相。
2 结果与分析
2.1 室温条件下生长的叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
在室温生长的叶肉细胞细胞壁清晰，质膜结构完整，紧贴细胞壁，叶绿体为梭形或椭圆形，沿
着质膜排列分布，（图 1，B、C），大多数叶绿体内都含有 1 个淀粉粒，叶绿体内间质片层之间有一
定数量的嗜锇颗粒（图 1，C、E）。在细胞质中有大量的线粒体（图 1，B），呈椭圆形，细胞中央有
一个明显的大液泡。细胞核结构完整，核仁清晰（图 1，F）。在室温下，叶肉细胞的 Ca2+主要分布
在液泡中（图 1，A），呈小颗粒或针状分散存在；在细胞外的细胞间隙中，也有大量的钙沉淀颗粒
分布（图 1，E）；细胞壁上也可见少量焦锑酸钙沉淀（图 1，C、E），而且出现的几率很高；而在细
胞质中只有少量 Ca2+的沉淀物（图 1，C、D），另外，在细胞核（图 1，F）、质膜（图 1，B、C）
上也有少量的 Ca2+分布，在叶绿体上没有观察到钙沉淀颗粒。
在室温正常生长条件下，叶肉细胞中显示 Ca2+-ATPase 活性的硝酸铅沉淀颗粒主要分布在质膜
和液泡膜上（图 1，G、H、I），质膜和液泡膜上的黑色颗粒连成一圈（图 1，H），这显示质膜和液
泡膜上有较高的 Ca2+-ATPase 活性。叶绿体膜上的硝酸铅沉淀颗粒分布不明显（图 1，I、J）。
在酶孵育液中不加底物 ATP 和加酶活抑制剂 NaF 的对照切片上未观察到硝酸铅沉淀（图 1，K、
L），这表明上述切片中的黑色沉淀物是 Ca2+-ATPase 活性的真实反映。
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图 1 室温条件下北海道黄杨叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
A ~ F 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+存在的焦锑酸钙沉淀，G ~ J 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+-ATPase 存在的硝酸铅沉淀。A：Ca2+
主要分布在液泡中，呈小颗粒或针状分散存在；B：质膜上有少量的 Ca2+分布，细胞质中有大量的线粒体；C：在叶绿体上没有钙沉淀颗粒，
质膜上有少量的 Ca2+分布；D：大多数叶绿体内都含有一个淀粉粒；E：细胞间隙中有大量的钙沉淀颗粒，叶绿体内间质片层之间有一定数
量的嗜锇颗粒（空心箭头所指）；F：在细胞核上有少量的 Ca2+；G，H：Ca2+-ATPase 主要分布在质膜和液泡膜上；I，J：叶绿体膜上几乎
没有 Ca2+-ATPase 分布；K，L：对照切片上未观察到硝酸铅沉淀，图 L 为图 K 中的局部放大。
Chl. 叶绿体；V. 液泡；M. 线粒体；Og. 嗜锇颗粒；Sg. 淀粉粒；Vm. 液泡膜；Pm. 质膜；N. 细胞核；Cw. 细胞壁；Is. 细胞间隙。下同。
Fig. 1 Ca2+ and Ca2+-ATPase distribution of the mesophyll cell at room temperature
The black particle（arrowhead）in A–F is calcium antimonite precipitate which shows calcium’s distribution. The black particle（arrowhead）in
G–J is the lead nitrate precipitate which shows the distribution of Ca2+-ATPase. A：Calcium particles were small and scattered within the vacuoles.
B：Less calcium particles on the plasma membrane，many mitochondrion in the cytoplasm. C：The chloroplasts without calcium particle. Less
calcium particles on the plasma membrane. D：A starch grain was included in most of the chloroplast respectively. E：There were a great amount of
calcium particles in the intercellular spaces. There were a few of osmilphilic granules in the chloroplast lamella（hollow arrowhead）. F：Less calcium
in the nucleus. G and H：Ca2+-ATPase mainly located on the plasma and the vacuoles membrane. I and J：There was almost no Ca2+-ATPase on the
chloroplast membrane. K and L：There was no lead nitrate precipitate in the contrast cell. L：The partial enlargement of fig. K.
Chl. Chloroplast；V. Vacuole；M. Mitochondrion；Og. Osmilphilic granule；Sg. Starch grain；Vm. Vacuole membrane；Pm. Plasma membrane；
N. Nucleus；Cw. Cell wall；Is. Intercellular space. The same below.
6 期 杨 蕊等：低温胁迫下北海道黄杨叶肉细胞 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的变化 1143

2.2 低温胁迫 3 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
经过 3 h 低温胁迫后，叶肉细胞的超微结构没有明显的变化，细胞壁、质膜结构完整，叶绿体
排列整齐，叶绿体中淀粉粒的数量很少，类囊体片层排列紧密（图 2，E），线粒体为椭圆形（图 2，
D）。细胞核的核质、核膜比较清晰且结构完整（图 2，F）。叶肉细胞的中央液泡结构完整。
这一时期叶肉细胞 Ca2+的分布发生了变化：间隙中的 Ca2+分布减少，沿着细胞壁上形成整齐的
一圈 Ca2+沉淀颗粒（图 2，A、C）；细胞液泡内 Ca2+沉淀颗粒明显减少，只在靠近液泡膜的边缘有
Ca2+的分布（图 2，B）；这时细胞质中的 Ca2+沉淀颗粒（图 2，E、F）比低温胁迫前明显增多；细
胞核上的 Ca2+沉淀颗粒也增加（图 2，F），另外，在叶绿体被膜外侧上也可见少量的 Ca2+沉淀颗粒
（图 2，E）。


图 2 低温胁迫 3 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
A ~ F 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+存在的焦锑酸钙沉淀（箭头所示），G ~ I 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+-ATPase 存在的硝酸铅
沉淀。A：Ca2+沉淀颗粒在细胞间隙中分布较少，并沿着细胞壁整齐排列；B、C：细胞液泡内有较少的 Ca2+沉淀颗粒，并分布在靠近液泡
膜的附近；D：细胞质中有大量的 Ca2+沉淀颗粒；E：在叶绿体被膜外侧上有少量的 Ca2+沉淀颗粒；F：细胞质和细胞核有较多的 Ca2+沉淀
颗粒；G、H：Ca2+-ATPase 主要分布在质膜和液泡膜上；I：叶绿体被膜上出现 Ca2+-ATPase 的分布。
Fig. 2 The calcium and Ca2+-ATPase distribution of the mesophyll cell at 4 ℃ for 3 hours
The black particle（arrowhead）in A–F is calcium antimonite precipitate which shows calcium’s distribution. The black particle（arrowhead）in
G–I is the lead nitrate precipitate which shows the distribution of Ca2+-ATPase. A：Less calcium particles distributed along the cell wall in the
intercellular space. B and C：Less calcium particles in vacuoles which distributed closely to the edge of the vacuoles membrane. D：Many calcium
particles in the cytoplasm. E：Less calcium on the outer membrane of the chloroplast. F：Many calcium particles in the cytoplasm and the nucleus.
G and H：Ca2+-ATPase mainly located on the plasma and the vacuoles membrane. I：Ca2+-ATPase on the chloroplast membrane.

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经过 4℃低温胁迫 3 h，与室温生长的叶片相比，叶肉细胞 Ca2+-ATPase 的分布（图 2，G、H 和
I）没有发生明显的变化，硝酸铅沉淀颗粒主要定位于质膜和液泡膜上；但叶绿体被膜上出现了
Ca2+-ATPase 的分布（图 2，H）。
2.3 低温胁迫 12 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
经过低温胁迫 12 h 后，叶肉细胞的超微结构没有表现出严重的伤害，细胞壁、质膜结构完整，
叶绿体排列整齐，类囊体片层排列紧密（图 3，D）。线粒体膜结构完整，内脊清晰可见（图 3，F）。
细胞核的核质、核膜、核仁都比较清晰且结构完整（图 3，E）。叶肉细胞的中央液泡结构完整。

图 3 低温胁迫 12 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
A ~ F 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+存在的焦锑酸钙沉淀，G ~ I 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+-ATPase 存在的硝酸铅沉淀。A：细
胞间隙中的 Ca2+分布较少，并且 Ca2+沉淀颗粒分布比较分散，颗粒较大；液泡中的 Ca2+沉淀颗粒极少，且沿着液泡膜内侧分布；B，C：细
胞质中有较多的的 Ca2+沉淀颗粒；D：在叶绿体被膜上有少量的 Ca2+分布，在紧邻质膜外侧的细胞壁上也有少量的 Ca2+沉淀颗粒；E：细胞
核上有较多的 Ca2+沉淀颗粒；F：具有清晰内嵴和完整膜结构的线粒体；G：Ca2+-ATPase 主要定位于质膜和液泡膜上；在细胞质基质中出
现较强的 Ca2+-ATPase 活性；H、I：液泡膜形成一些单层或双层的小膜泡，小膜泡上有很高的 Ca2+-ATPase 活性。
Fig. 3 The calcium and Ca2+-ATPase distribution of the mesophyll cell at 4 ℃ for 12 hours
The black particle（arrowhead）in A–F is calcium antimonite precipitate which shows calcium’s distribution. The black particle（arrowhead）in G–I is
the lead nitrate precipitate which shows the distribution of Ca2+-ATPase. A：Calcium particles were big and scattered within the intercellular space；
Less calcium particles distributed along the inner edge of vacuoles membrane. B and C：There were many calcium particles in the cytoplasm.
D：There were less calcium particles on the chloroplast membrane and some particles on the cell wall next to the outerface of plasmamembrane.
E：The nucleus with many calcium particles. F：The mitochondrion with clear carina and membrane. G：Ca2+-ATPase
mainly located on the plasma and the vacuoles membrane. A great amount of Ca2+-ATPase in the cytoplasm.
H and I：Vacuoles composed of unilamellar or double vesicles which showed high Ca2+-ATPase activity.

6 期 杨 蕊等：低温胁迫下北海道黄杨叶肉细胞 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的变化 1145

经过 12 h 低温胁迫的叶肉细胞，Ca2+的分布发生了比较明显的变化。这时细胞质中的 Ca2+沉淀
颗粒明显增多（图 3，B、C），Ca2+浓度可能已经达到了高峰；细胞核上的 Ca2+沉淀颗粒也增加（图
3，A、E）；而在细胞间隙中的 Ca2+分布则较少，并且 Ca2+沉淀颗粒分布比较分散，颗粒较大（图 3，
A、D）；液泡中的 Ca2+沉淀颗粒极少，沿着膜内侧分布（图 3，A、C）。另外，在叶绿体被膜外侧
上也可见少量的 Ca2+沉淀颗粒（图 3，D），在紧邻质膜外侧的细胞壁上也有少量的 Ca2+沉淀颗粒（图
3，D）。这些结果说明低温诱导的细胞钙信号的来源为胞外钙库，即细胞间隙和胞内钙库，即液泡。
经过 4℃低温胁迫 12 h，叶肉细胞 Ca2+-ATPase 的分布也是主要定位于质膜和液泡膜上（图 3，
G、H 和 I），在细胞质基质中也出现较强的 Ca2+-ATPase 活性（图 3，H、I）。这一时期液泡膜形成
一些单层或双层的小膜泡，小膜泡上有很高的 Ca2+-ATPase 活性（图 3，H、I，箭头所指），但在叶
绿体被膜上没有观察到 Ca2+-ATPase 的分布。
2.4 低温胁迫 24 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
在低温胁迫 24 h 后，虽然有些叶肉细胞的叶绿体出现轻微膨胀（图 4，E），但是基粒片层和间
质片层未见明显变化，其他细胞器结构基本保持正常。
在细胞质（图 4，A、B）及细胞核内（图 4，F）虽然可见 Ca2+沉淀颗粒，但是其浓度水平明
显低于胁迫 12 h 的处理。而细胞外和液泡内 Ca2+沉淀颗粒明显增加，大部分细胞质膜外侧的细胞壁
上有一圈整齐的 Ca2+沉淀颗粒（图 4，A、D），在细胞间隙中，有分散的 Ca2+沉淀颗粒（图 4，A）；
在液泡膜内侧有 Ca2+沉淀颗粒（图 4，B），可能是少部分的细胞质 Ca2+向液泡中转移，这说明随着
低温胁迫时间的延长，细胞中的 Ca2+通过液泡膜和质膜上的钙泵撤回到细胞钙库，即细胞间隙、细
胞壁和液泡中，但是 Ca2+向胞外转移的速度要快于向胞内的转移。另外，在叶绿体内部的 Ca2+沉淀
颗粒有增加的趋势，沿着淀粉粒外面形成一圈 Ca2+沉淀颗粒（图 4，D）。
经过 4 ℃低温胁迫 24 h，叶肉细胞的 Ca2+-ATPase 分布发生了变化：质膜和液泡膜上的硝酸铅
沉淀颗粒明显增加（图 4，H），表明其上的 Ca2+-ATPase 活性要比低温处理前和低温胁迫初期增强，
并随着低温胁迫时间的延长而增加。另外，质膜上硝酸铅沉淀颗粒的分布也比液泡膜上的多，这意
味着质膜上的 Ca2+-ATPase 比液泡膜上的 Ca2+-ATPase 活性要高些（图 4，H、I）。在叶绿体膜上也
有 Ca2+-ATPase 的分布（图 4，I、K），在质膜的内侧线粒体的数量明显增加，线粒体膜上也有硝酸
铅沉淀（图 4，I）。在细胞质中也有硝酸铅沉淀颗粒（图 4，I、J、L）。这一时期在质膜附近和液泡
中有很多小膜泡（图 4，K、L），这些膜泡可能与 Ca2+-ATPase 参与细胞信号传导机制有关。
2.5 低温胁迫 48 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
与室温对照植株相比，低温胁迫处理 48 h 后，叶肉细胞的细胞壁和质膜结构依然完整，没有出
现质壁分离现象，但在质膜的一些部位形成向内突起的小膜泡（图 5，G）；叶绿体的形状由原来的
梭形或椭圆形逐渐膨胀变圆或其他形状，叶绿体中所含淀粉粒与对照相比有所减少，有些叶绿体聚
集在一起（图 5，C）；叶肉细胞中的线粒体数量较多，结构完整（图 5，D）；在液泡内出现同心圆
状的膜结构（图 5，E）及单层膜的膜泡（图 5，H）。
低温胁迫至 48 h，Ca2+沉淀主要集中在液泡和细胞间隙中（图 5，A、B），细胞质和细胞核内的
Ca2+分布的很少，浓度水平低于胁迫 24 h 的处理（图 5，B、C、F），说明细胞质内 Ca2+在短暂升高
并行使信号传导功能后恢复到低温处理前的静息水平状态。Ca2+沉淀颗粒在液泡中呈分散分布，在
细胞间隙中 Ca2+沉淀颗粒要比处理前大，有些聚集在一起。在叶绿体和线粒体上没有 Ca2+的分布（图
5，D）。与 4 ℃低温胁迫 24 h 时相比，经过 48 h 的低温胁迫，叶肉细胞质膜和液泡膜上的硝酸铅颗
粒减少（图 5，I、J），表明质膜和液泡膜的 Ca2+-ATPase 活性降低。但是与室温生长的植株相比，
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叶肉细胞的 Ca2+-ATPase 活性分布和强弱没有特别明显的改变，依然有较高的活性。这时硝酸铅颗
粒主要分布在质膜和液泡膜上，液泡内部和细胞质中也有 Ca2+-ATPase 的分布（图 5，I、J）；但叶
绿体膜上的硝酸铅颗粒比较少，这说明叶绿体膜上的 Ca2+-ATPase 活性较弱；细胞核的内膜上和细
胞核内也有硝酸铅颗粒（图 5，L），显示细胞核内膜和细胞核内部都有 Ca2+-ATPase 的活性。另外
质膜内陷，形成小膜泡（图 5，K），这些小膜泡内有 Ca2+-ATPase 分布。





































图 4 低温胁迫 24 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
A ~ F 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+存在的焦锑酸钙沉淀，G ~ L 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+-ATPase 存在的硝酸铅沉淀。A：
细胞间隙和液泡内有较多的 Ca2+沉淀颗粒；B：液泡膜内侧有 Ca2+沉淀颗粒；C：细胞质内较少的 Ca2+沉淀颗粒；D：沿着质膜外侧和淀粉
粒外面整齐排列的 Ca2+沉淀颗粒；E：出现轻微膨胀的叶绿体；F：细胞核 Ca2+分布较少；G，H：质膜和液泡膜上出现较多的 Ca2+-ATPase；
I：线粒体膜上有 Ca2+-ATPase 分布；J：在细胞质中也有 Ca2+-ATPase 分布；K，L：质膜附近和液泡中有很多小膜泡（空心箭头所指）。
Fig. 4 The calcium and Ca2+-ATPase distribution of the mesophyll cell at 4 ℃ for 24 hours
The black particle（arrowhead）in A–F is calcium antimonite precipitate which shows calcium’s distribution. The black particle（arrowhead）in
G–L is the lead nitrate precipitate which shows the distribution of Ca2+-ATPase. A：Calcium particles in intercellular space and vacuoles. B：Calcium
particles in the inner side of the vacuole membrane. C：Less calcium particles in the cytoplasm. D：Calcium particles on the outside of plasma
membrane and starch grains. E：Chloroplasts slightly expanded. F：Less calcium particles in the nucleus. G and H：Much more Ca2+-ATPase on the
plasma and vacuoles membrane. I：Ca2+-ATPase on the mitochondrion membrane. J：Ca2+-ATPase in the cytoplasm. K and L：There were a lot of
vesicles located near the plasmamembrane and in the vacuole（hollow arrowhead）.
6 期 杨 蕊等：低温胁迫下北海道黄杨叶肉细胞 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的变化 1147








































图 5 低温胁迫 48 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
A ~ H 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+存在的焦锑酸钙沉淀，I ~ L 中的颗粒（箭头所示）是显示 Ca2+-ATPase 存在的硝酸铅沉淀。A：Ca2+
沉淀主要集中在液泡和细胞间隙中，在液泡中呈分散分布，在细胞间隙中 Ca2+沉淀颗粒聚集在一起；B、C：细胞质和细胞核内的 Ca2+分布
的很少；D：线粒体上没有 Ca2+的分布；E：在液泡内出现同心圆状的膜结构（空心箭头所指）；F：在叶绿体上没有 Ca2+的分布；G：质膜
的一些部位形成向内突入的小膜泡（空心箭头所指）；H：在液泡内出现单层膜的膜泡（空心箭头所指）；I、J：质膜和液泡膜上的 Ca2+-ATPase
减少，液泡内部和细胞质中也有 Ca2+-ATPase 的分布；K：质膜内陷形成小膜泡（空心箭头所指）；
L：细胞核内膜和细胞核内部都有 Ca2+-ATPase 的分布。
Fig. 5 The calcium and Ca2+-ATPase distribution of the mesophyll cell at 4 ℃ for 48 hours
The black particle（arrowhead）in A–H is calcium antimonite precipitate which shows calcium’s distribution. The black particle（arrowhead）in
I–L is the lead nitrate precipitate which shows the distribution of Ca2+-ATPase. A：Calcium particles were aggregative in intercellular space and
scattered in vacuoles. B and C：Less calcium particles were located in the cytoplasm and the nucleus. D：A lot of mitochondrion without the calcium
particle. E：Some concentric circle membrane structure（hollow arrowhead）in the vacuoles. F：Chloroplasts without the calcium. G：Protuberance
（hollow arrowhead）from the inner side of the plasmamembrane. H：The unilamellar vesicles（hollow arrowhead）in the vacuoles. I and J：Less
Ca2+-ATPase located on the plasma and the vacuoles membrane. Some Ca2+-ATPase in the vacuoles and the cytoplasm. K：Inner protuberance
（hollow arrowhead）of the plasmamembrane. L：Ca2+-ATPase in the nucleus matrix and on the inner nucleus membrane.
1148 园 艺 学 报 40 卷
2.6 低温胁迫 96 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
低温胁迫延长至 96 h 后，叶肉细胞的质膜完整；叶绿体结构完整，内含较多的淀粉粒，并且淀
粉粒开始聚集（图 6，A ~ D），被膜变成波浪状（图 6，D），线粒体结构完整，内脊清晰（图 6，E）；

图 6 低温胁迫 96 h 叶肉细胞的 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的分布
A ~ H 中的颗粒（箭头所示）是 Ca2+存在的焦锑酸钙沉淀，I ~ L 中的颗粒（箭头所示）是 Ca2+-ATPase 存在的硝酸铅沉淀。A：细胞质 Ca2+
沉淀较少，液泡和细胞间隙内可见大量 Ca2+沉淀颗粒；B：细胞间隙中 Ca2+沉淀沿细胞壁外面排列；C：液泡中的膜泡结构（空心箭头）；
D：具有波浪状被膜、结构完整的叶绿体；E：具有清晰内脊、结构完整的线粒体；F：细胞核内有较少的 Ca2+；G：在质膜的内侧有很多
小泡内含有 Ca2+沉淀颗粒；H：在液泡中形成很多膜泡结构内含有 Ca2+沉淀颗粒；I：Ca2+-ATPase 定位在质膜和液泡膜上；J：细胞质中有
Ca2+-ATPase 活性；K：叶绿体膜上 Ca2+-ATPase 比较少；L：液泡膜形成一些双层膜小泡，在小膜泡内有较高的 Ca2+-ATPase 活性。
Fig. 6 The calcium and Ca2+-ATPase distribution of the mesophyll cell at 4 ℃ for 96 hours
The black particle（arrowhead）in A–H is calcium antimonite precipitate which shows calcium’s distribution. The black particle（arrowhead）
in I–L is the lead nitrate precipitate which shows the distribution of Ca2+-ATPase. A：Less calcium particles in the cytoplasm. A great amount of
calcium in the intercellular spaces and the vacuoles. B：Calcium particles in the intercellular spaces distributed near the cell wall. C：There were many
membrane vesicles in the vacuoles（hollow arrowhead）. D：The chloroplast with wavy outside the membrane. E：Normal mitochondrion with clear
carina. F：Less calcium particles in the nucleus. G：Many vesicles distributed on the inner of plasmamembrane with calcium particles. H：Many
vesicles located in the vacuole with calcium particles. I：Ca2+-ATPase mainly located on the plasma and the vacuoles membrane. J：A great amount of
Ca2+-ATPase in the cytoplasm. K：Less Ca2+-ATPase on chloroplast membrane. L：Vesicles composed of double membrane formed in the vacuoles
showed high Ca2+-ATPase activity.
6 期 杨 蕊等：低温胁迫下北海道黄杨叶肉细胞 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的变化 1149

细胞核结构完好，核膜清晰，核质内没有形成聚集的大斑块（图 6，F）。
这时细胞质和细胞核内 Ca2+水平都比较低，在液泡和细胞间隙内可见大量的 Ca2+沉淀颗粒（图
6，A、B、F），这些颗粒体积较大，并且呈聚集分布；在细胞壁外面 Ca2+沉淀排列成整齐的一圈（图
6，B）。这一时期细胞内 Ca2+分布与室温生长状态相比，最为明显的特点是，在质膜的内侧有很多
小泡，内含有 Ca2+沉淀颗粒（图 6，G）；在液泡中形成的很多膜泡结构内也含有 Ca2+沉淀颗粒（图
6，H）。
随着低温胁迫时间的延长，叶肉细胞 Ca2+-ATPase 主要定位在质膜和液泡膜上（图 6，I），液泡
中也有硝酸铅颗粒（图 6，J、K）；在细胞质中也有 Ca2+-ATPase 活性（图 6，J、K）。与低温胁迫
24 h 时相比，这一时期 Ca2+-ATPase 活性降低；但是与室温生长的及低温胁迫 3、12 和 48 h 的相比，
叶肉细胞 Ca2+-ATPase 活性没有特别明显的变化，仍有较高的活性；在叶绿体膜上硝酸铅颗粒比较
少，显示其 Ca2+-ATPase 活性较弱。液泡膜形成一些双层膜的小泡（图 6，L），在小膜泡内显示有
较高的 Ca2+-ATPase 活性。
3 讨论
3.1 低温胁迫下植物细胞内增加的 Ca2+的来源
Ca2+是一种大量元素，同时作为第二信使，参与调控植物的细胞生理功能。细胞内自由 Ca2+的
出现或增加与转移是 Ca2+信号产生的基础。当细胞受到外界刺激时，细胞溶质 Ca2+浓度增加，继而
激活 Ca2+调节的靶酶，或者与 Ca2+高度亲和的受体蛋白结合，引起细胞反应，从而起到传递胞外信
号的作用。
正常生长条件下，植物细胞质游离 Ca2+水平非常低，不同的外界刺激会诱导膜上不同的 Ca2+通
道开放，引起胞外 Ca2+的进入及液泡等细胞器的 Ca2+释放到细胞质中，导致细胞质游离 Ca2+浓度的
升高。用 Ca2+通道抑制剂 LaCl3 和 Ca2+鳌合剂 EGTA 结合水母发光蛋白标记的方法观察拟南芥叶肉
细胞 Ca2+的分布，发现冷刺激引起的细胞内 Ca2+的增加，一方面来源于细胞外，另一方面来源于细
胞内 Ca2+库即液泡（Knight et al.，1996）。柑橘（李琼，2003）、三尖杉（刘学琴，2006）和番茄（雷
江丽 等，2000）在遭受低温胁迫时，细胞内增加的 Ca2+不仅来自于胞内，也可来自胞外。在本试
验中，室温条件下，叶肉细胞的 Ca2+主要分布在液泡和细胞外的细胞间隙中，而在细胞质中只有少
量 Ca2+的沉淀物；低温胁迫 3 ~ 12 h，叶肉细胞 Ca2+的分布发生了变化：液泡和细胞间隙中的 Ca2+
沉淀颗粒减少，而细胞质中的 Ca2+沉淀颗粒明显增加，在胁迫 12 h 的细胞质中 Ca2+浓度达到了最高
值。这说明在很短的时间内，低温引起了细胞内 Ca2+的分布和浓度发生变化，启动了植物的刺激—
反应偶联机制。北海道黄杨叶肉细胞质中自由 Ca2+浓度的增加主要也来自于胞外钙库（细胞间隙）
和胞内钙库（液泡）。
3.2 低温胁迫过程中细胞 Ca2+-ATPase 的动态变化与植物细胞 Ca2+稳态平衡的调节
当植物细胞质中的 Ca2+浓度及其分布在适当范围内变化时，会在植物对外界环境的适应调节反
应中起积极的作用，但是当其变化超出一定的范围，就会破坏和扰乱细胞正常的结构与功能（Bush，
1993）。胞质内存在多种 Ca2+浓度调节机制，保证细胞处于 Ca2+的稳态平衡（Ca2+-homeostasis），其
中钙泵（Ca2+-ATPase）是钙稳态调节体系中的重要组成成分，钙泵将 Ca2+从胞质内转移到胞外或液
泡和内质网等细胞器中（Bush，1995）。抗寒冬小麦在长时间低温培养过程中，叶肉细胞质膜一直
保持较高的 Ca2+-ATPase 活性，这样就可以使由于低温胁迫导致进入叶肉细胞内的 Ca2+在完成信使
1150 园 艺 学 报 40 卷
功能后，被及时运出细胞质外，保证细胞生理代谢和信息传递的正常进行，实现细胞内 Ca2+的稳态
平衡（Ca2+-homeostasis），从而提高了冬小麦的抗寒性（简令成 等，2000）。而冷敏感的植物质膜
Ca2+-ATPase 活性在持续低温过程中会失活（Jian et al.，1999）。北海道黄杨叶肉细胞，在室温生长
条件下和低温胁迫的初期（3 ~ 12 h），质膜和液泡膜上都存在较高活性的 Ca2+-ATPase。而在低温胁
迫 24 h，细胞质中的 Ca2+沉淀颗粒明显减少，同时细胞间隙和液泡内的 Ca2+沉淀颗粒明显增加，说
明细胞质中的 Ca2+完成第二信使功能后，大部分 Ca2+通过 Ca2+-ATPase 被转移到细胞外；少部分 Ca2+
被转运到液泡内；与之相伴的是，此时叶肉细胞质膜和液泡膜上的 Ca2+-ATPase 活性要比低温处理
前增强，而且质膜上的 Ca2+-ATPase 比液泡膜上的 Ca2+-ATPase 活性要高。在低温胁迫 48 ~ 96 h，
Ca2+沉淀颗粒主要集中在液泡和细胞间隙中，细胞质和细胞核内的 Ca2+分布的很少，说明细胞质内
Ca2+在短暂升高并行使信号传导功能后已恢复到低温处理前的静息水平状态。而这时叶肉细胞质膜
和液泡膜的 Ca2+-ATPase 活性相比低温胁迫 24 h 也变低了；但与室温生长的植株相比，这时叶肉细
胞中 Ca2+-ATPase 活性分布和强弱没有特别明显的改变，依然有较高的活性。这说明持续的低温胁
迫并没有破坏北海道叶肉细胞的 Ca2+-ATPase 活性，这可能是北海道黄杨有较强抗寒性的原因之一。
跨越细胞内膜系统，如叶绿体膜、线粒体膜和核膜的 Ca2+流动，在 Ca2+信号形成方面可能也具
有同样重要的作用（Miller et al.，1987）。北海道黄杨叶肉细胞随着低温胁迫时间的增加，在叶绿体
上出现了 Ca2+沉淀颗粒，在低温胁迫 24 h，叶绿体内部的 Ca2+沉淀颗粒明显增加，并沿着其内的淀
粉粒外缘排成一圈，这显示叶绿体可能在吸收细胞质中的 Ca2+，叶绿体可能是叶肉细胞的一个临时
Ca2+库；在北海道黄杨的叶肉细胞的叶绿体膜上确实有 Ca2+-ATPase 的活性，叶绿体膜上的
Ca2+-ATPase 可使细胞质中高浓度的 Ca2+转运进叶绿体，在保持细胞溶质内外 Ca2+稳态平衡中发挥
作用。在低温胁迫 48 ~ 96 h，叶绿体上没有 Ca2+的分布，这可能是因为钙信号传导结束后，叶绿体
中的 Ca2+已转移到细胞质或其他钙库中。
3.3 在低温胁迫过程中细胞核与细胞质的钙浓度变化的关系
在动物细胞中，细胞核的自由 Ca2+浓度的升高对于激活核蛋白激酶和其他影响生理活动的信号
途径是必须的（Harper et al.，2004）。细胞核被视为“细胞中的细胞”，在细胞核中含有能感应或转
换刺激的所有分子，这些在细胞核内的分子能把刺激转换成生物学反应并产生或控制细胞核钙离子
的变化（Bkaily，2006）。细胞质和细胞核通过不同的方式改变钙的浓度，细胞质自由钙浓度的大幅
度增加不会紧接着自动引起细胞核内钙的增加（Christian et al.，2009）。在低温胁迫过程中，北海道
黄杨叶肉细胞核的钙浓度发生了变化：室温下细胞核钙浓度较低，胁迫 3 ~ 12 h 细胞核钙浓度开始
增加，24 h 后细胞核钙浓度逐渐恢复到胁迫前的水平，这说明细胞核通过钙浓度的变化响应低温逆
境。但我们还无法判断细胞核和细胞质的钙浓度变化之间的关系。细胞核内的 Ca2+信号完成对低温
逆境的调控后，核内的 Ca2+也要恢复核动态平衡（nuclear calcium homeostasis）。植物细胞核 Ca2+动
态平衡是通过核膜上的 Ca2+-ATPase 和其他蛋白（Kumar et al.，2008）来完成的。如核膜上的 mGlu5
受体就是通过磷脂酶 C（Phospholipase C）途径产生钙离子瞬时变化（calcium transients）所必须的，
mGlu5 仅存在于细胞核中，可响应细胞核稳态调节的动态变化（Kumar et al.，2008）。在北海道黄
杨叶肉细胞的核膜上就有 Ca2+-ATPase 活性的分布，因此 Ca2+-ATPase 可能在保持植物细胞核的 Ca2+
动态平衡中发挥着重要作用。我们没能清晰地观察到线粒体上 Ca2+的分布，有关线粒体内膜系统在
钙信号传导系统中的作用还有待进一步研究。
3.4 叶肉细胞超微结构变化与北海道黄杨的抗寒性
北海道黄杨在低温胁迫过程中，伴随着叶肉细胞 Ca2+的动态变化，叶肉细胞的超微结构也发生
6 期 杨 蕊等：低温胁迫下北海道黄杨叶肉细胞 Ca2+和 Ca2+-ATPase 的变化 1151

一些适应性变化。叶绿体由最初的梭形或椭圆形逐渐膨胀变圆，有些叶绿体聚集在一起。抗寒性较
强的沙冬青（韩善华，1994）和云杉（Senser et al.，1975）的叶肉细胞在低温胁迫过程中也出现叶
绿体聚集现象；而冷敏感植物黄瓜（陈由强 等，2000）、龙眼（田景花 等，2002）的叶肉细胞在低
温胁迫过程中没有出现这一现象。叶绿体聚集现象可能是抗寒植物对低温的一种适应性变化，有助
于加强细胞内结构的支撑力量。另外，在低温胁迫过程中，叶肉细胞中线粒体数量增多，这可能是
植物在冷适应过程中对细胞呼吸作用增强，细胞内一些生理代谢和物质合成过程需要提供更多的能
量的适应；而且钙泵转运 Ca2+时也需要消耗能量。低温胁迫下细胞呼吸作用增强与 Ca2+迅速转运的
互相协调，才能保证钙信号顺利地向下游传递。本试验中还观察到在叶绿体之间分布很多线粒体，
这可能也是植物对低温胁迫的一种适应性表现，这种分布可以使细胞的光合作用和呼吸作用发生更
紧密的联系（杜志高，2007）。另外，在液泡内出现的同心圆状的或单层膜构成的膜泡，可能是一种
潜在的细胞自体吞噬结构，是细胞可逆的非致死性的损伤，是植物细胞对低温胁迫的抵御反应。通
过叶肉细胞这些适应性变化使北海道黄杨表现出较强的抗寒性。
北海道黄杨低温胁迫过程中，叶肉细胞一直保持较高的 Ca2+-ATPase 活性，保障了细胞质内外
Ca2+的动态平衡，使钙信号传递机制有效地进行；细胞的超微结构、生理生化指标（赵剑颖 等，2010）
发生适应性变化，这些细胞综合响应使北海道黄杨表现出较强的抗寒性。

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