全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(8)：1221—1226
Acta Horticulturae S／n／ca
万寿菊杂交一代遗传多态性的 SRAP标记分析
张西西 ，徐 进 ，王 涛 ，董爱香 ，赵梁军
( 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100094； 北京市园林科学研究所，北京 100102)
摘 要：应用 SRAP(sequence—related amplifed polymorphism)分子标记对当前市场上推广的 48个万寿
菊杂交一代品种进行遗传多态性研究，用60个引物组合进行扩增，从中筛选到 20个多态性引物组合 ，共
产生289个多态性条带，平均每个引物组合产生 l4．45个多态性条带，显示了较高的多态性比率。聚类分
析20个引物组合的扩增结果，48份材料分为两大类，Jaeeard’S相似系数在 0．25～0．91之间。
关键词：万寿菊；杂交种；多态性；SRAP
中图分类号：S 682．1 1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2008)08—1221-06
Genetic Diversity with M olecular M arker SRAP of Tagetes erecta L．
ZHANG Xi—xi · ，XU Jin ，WANG Tao ，DONG Ai—xiang ，and ZHAO Liang—jun
( Department 0厂Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beoing 1 00094，China；
Beijing Institute ofHorticulture and Gardening，Beijing 100102，China)
Abstract：Study on genetic diversity of marigold could benefit the research of cuhivar prope~y fight pro—
tecting，seanged purity testing，and genetic breeding．A new molecular marker system-SRAP(sequence—re—
lated amplified polymorphism)was firstly applied on 48 marigold hybrids genetic diversity research．Twenty
primer pairs selected from 60 amplified 289 polymorphic bands with an average of 14．45 polymorphic bands
perprimer pair．Cluster analysis using UPGMA method which based on the data of SRAP amplified bands by
20 primer pairs showed 48 hybrids could be distinguished into two main groups．Jaccard’S similarity coefficient
ranged from 0．25 to 0．91．
Key words：Tagetes erecta L．；hybrid；polymorphism；SRAP
万寿菊 (Taget~erecta L．)是重要的花坛花卉，在美国、印度、中国以及欧洲和非洲的大部分地
区有广泛的栽培，耐干旱和瘠薄，适应性强。
近20年来，研究者在万寿菊属种质资源收集 、形态学和生物学特性、遗传关系以及新品种选育
方面做了研究 (Verma et a1．，2004；李福荣 等，2005；赵景云 等，2005；李娜 等，2006；田海燕
等，2007)，同时，同工酶和分子标记辅助育种也广泛应用在万寿菊的新品种选育中 (沈一岚 等，
2006；梁顺祥 等，2007；齐迎春 等，2007)。
由于万寿菊杂交一代的遗传基础很狭窄，造成品种间多态性较低。利用 AFLP技术可以区分形态
上差异较大的父、母本以及杂交一代 (李福荣，2005)，但尚未见到利用分子标记技术区分杂交一代
品种之间特别是同一系列不同颜色的万寿菊杂交一代品种的报道。
Li和 Quiros(2001)开发了一种新型分子标记 SRAP(sequence—related amplifed polymorphism)，
可通过独特的引物设计优先扩增基因组内的开放阅读框 (ORF)，对基因组内含子区域、启动子区域
进行特异扩增。因不同个体、物种的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有简
收稿日期：2008—03—13；修回日期：2008—06—11
基金项目：北京市科委重大项目 (1)0705003040121)
}通讯作者 Author for corespondence(E—mail：zhaolj5073@163．coin)
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园 艺 学 报 35卷
便、稳定，兼有 RAPD的操作简单和 AFLP重复性好、多态性强的优点，目前已应用于图谱构建、遗
传多样性分析和品种鉴定中 (李严和张春庆，2005；韩建明 等，2007；李慧芝 等，2007；李晓慧
等，2007)。
作者将 SRAP分子标记应用于万寿菊的遗传分析，旨在了解众多万寿菊品种的遗传背景，为万寿
菊杂种优势利用中的亲本选配，花卉品种的鉴定和知识产权保护提供依据。
1 材料与方法
供试材料为当前生产上推广的万寿菊 48个杂交一代品种 (详见图2)，除0120、0130、0140、
0150、0170、0110这 6个品种是本课题组 自育之外，其他品种的种子均购自国内外各花卉种子公司。
全部采用2006年收获的种子，其株高、冠幅、叶形、花径 、花色等形态特征和农艺性状各不相同，
具有代表性。
试验于2006-2007年在中国农业大学农学与生物技术学院观赏园艺与园林系实验室进行。SRAP
引物参考 Feriol等 (2004)的引物，从中选出6条正向引物和 10条反向引物，正向引物和反向引物
两两搭配组合，形成 60个引物组合。正向引物 (forward primer)有 ME．1、ME-2、ME-3、ME-5、
ME-6，ME-8；反 向引物 (reverse primer)为 EM-1、EM-2、EM-3、EM-4、EM-5、EM-6、EM-8、
EM-9、EM-10、EM．11。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，Taq酶和反应底物均购自
该公司。
DNA提取参考 Li和Quiros(2001)的方法，提取具有 1对真叶时期的幼苗叶片 DNA，并进行了
检测。PCR扩增反应体系和反应程序参考 Feriol等 (2003，2004)的方法。PCR反应在 PTC．100温
度循环仪 (美国产)上进行。
扩增产物进行垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (6％)。变性程序为 95℃ 5 min；4℃保存。
65 w恒功率电泳2．0～2．5 h至溴酚蓝移到凝胶底部结束后进行 AgNO 染色。凝胶银染在张军等
(2000)的方法上进行了改进，10％乙醇与0．5％冰乙酸混合水溶液固定 15～20 min；用去离子水漂
洗3 min；2 g·L～ AgNO3水溶液银染25～30 min；水洗后用显色液 (15 g·L— NaOH，0．5％甲醛)
显色，直至条带清晰为止；10 g·L—Na CO 漂洗 1 rain；去离子水漂洗 1 min。银染后的凝胶利用复
H凝胶成像仪拍摄保存。试验3次重复。
数据分析计算：每个引物组合的多态性比率 (％)=引物组合扩增的多态性条带数／总条带数×
100。每个引物的鉴别能力 (％)=此引物组合可鉴别的品种类别数／总品种数 ×100。采用 Jaccard’S
相似系数，使用 NTSYS-pe 2．0软件，非加权组平均法 (UPGMA)聚类。相似系数计算公式为：S i=
a／(a+b+C)，其中a表示两份样品共有带数，b表示 i样品特有的条带数，C表示 j样品特有的条带
数。
2 结果与分析
2．1 引物的多态性分析
60个引物组合用于扩增48个万寿菊杂交品种，有20个引物组合能产生多态性条带，其中多态
性较高的引物组合有 ME．8／EM．3(图 1)、ME．1／EM-9、ME．1／EM．10、ME．3／EM．3、ME-5／EM．8和
ME-6／EM-2等，每个组合可产生 15～25条清晰条带 (表 1)。
20个引物组合共产生289条多态性条带，每个组合的多态性条带数为7～25，平均每个引物组合
产生 14．45个多态性条带，单个引物组合的多态性比率在58％ ～100％之问。这说明 SRAP多态性较
高，适于鉴别万寿菊等园艺作物品种。
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期 张西 西等 ： 万 寿菊杂交 一 代遗传多态性 的 S R A P 标记 分析 1223
622
NI 1
图 1 引物 M E - 8／E M - 3 对 4 8 个万 寿菊杂交 品种的扩增结 果
M 为 D N A m arker (pB R 322 )； l ～ 4 8 号品 种 见图 2 ； 箭头表示 多态性 条带 ：
F ig． 1 T he am plification resultof4 8 F I m arigold cultivars by the prim er pair M E
- 8／E M - 3
M ． D N A m arker (pB R 322)； C ultilar n um ber is the sam e as F ig． 2 ； A rrow s show polym orphie bands
表 1 20 个 引物 组 合对 4 8 个万 寿菊杂交 品种 的扩增 结 果
T able 1 T he am plification resultof4 8 F ． m arigold cultivars by 20 prim er pairs
V
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1224 园 艺 学 报 35卷
2．2 品种多态性鉴定
20个引物组合的鉴别能力在6．3％ ～90％之间，其中4个引物组合 ME-1／EM-10、ME-2／EM-6、
ME-5／EM．8和 ME．8／EM．3的鉴别能力达到80％以上，可以用来区分大部分品种。没有得到完全区分所
有品种的单个引物组合。这说明部分品种之问亲缘关系极为接近，多个品种共用一个亲本现象严重。
试验分别对每 2组引物组合的扩增结果采用
Jaccard’S相似系数进行 UPGMA聚类分析，得到可
以完全区分 48个品种的6组引物组合搭配 (表
2)，选取其 中的两对引物组合分别扩增比较结
果，就可以达到完全鉴别的目的。
从表2中可以看出，5个引物组合 (编号为
8、9、32、37、53)可以用来搭配成为双引物组
合用于鉴别，选择引物组合进行搭配的原则主要
依据各引物组合的鉴别能力，一般鉴别能力越高，
搭配组合的鉴别能力越高，品种间多态性越高。
根据20对引物组合的扩增结果对48个杂交
表2 鉴别48个杂交种的两对引物组合的搭配表
Table 2 Two primer pair combination to identify 48 Fl
marigold varieties
种进行聚类分析 (图2)，Jaccard’S相似系数在0．25～0．91之间。在相似系数为0．48的水平上，可以
将试材分为两大类，18、20、32、36、23、26为I类，剩余品种聚为Ⅱ类。作者所在课题组自育的6
个品种0120、0130、0140、0150、0170、0110均可和其他几个品种区分开来，说明这几个品种的遗
传背景与其它品种不同。国内外培育的品种大多数都聚在第Ⅱ类，其中包括一个白色的万寿菊品种，
作者自育的5个品种全部集中在第 Ⅱ类，说明各育种公司利用的育种材料相似或种质资源有交流；而
‘完美’、‘奇迹’和 ‘印加人’都是美国 ‘PanAmerican’和 ‘Goldsmith’公司培育的品种，被聚为
一 类，表明具有相近的遗传关系，而国内培育的 ‘北林之夏’和美国 ‘Goldsmith’公司培育的品种
也聚在 I类 (图2)，说明其亲本可能很相近，同时不排除异名同物的可能。
在两大类中，具有相同颜色的品种被聚为最相近的两类，表明这几个品种可能具有相同的亲本来
源。相同系列的品种聚在一起，例如超越系列的金黄和橘色、完美的橙和黄、奇迹的橙红和黄，安提
瓜的黄和金黄，说明他们的遗传关系较近。但安提瓜系列的橘红和金黄被分为不同类别，2个品种的
形态差异也较大，一个是黄色，一个是橘红，说明两者来 自于不同的亲本。杂种孔雀草是以万寿菊为
母本，孔雀草为父本杂交得到的，农艺性状上和其他万寿菊品种差异很大，SRAP标记显示他们距离
其他万寿菊品种较远，说明 SRAP标记分析的亲缘关系与形态特征观测结果一致。这也与齐迎春等
(2007)的研究结果一致。SRAP标记可为研究万寿菊的亲缘关系、品种演化与品种保护提供重要的
信息。
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8期 张西西等：万寿菊杂交一代遗传多态性的SRAP标记分析 1225
3 讨论
0．7O 0 85
相似系数 Coeficient
l 0140(黄)0l40(Yelow)
19 精英 (黄)Jingying(Yelow)
14 超越 (金黄)Chao3ale(Gold)
45 超越 (橘色)Chao3ase(Orange)
2 钻石 (桶红)Zuanshi(Orange)
4 叭7O(黄)0170(Yelow)
44 缤纷 (黄)Binfen(Yellow)
9 发现 (桔)Discovery(Orange)
1 6 丰盛 (黄)Fengsheng(Yelow)
47 发现 (黄)Discovery(Yelow)
22 钻石 (黄)Zuanshi(Yelow)
3O 北林之夏 (黄)Beilinzhixi Yelow)
33 优秀 (黄)Yo~u(Yelow)
38 012O(黄)0120(Yelow)
43 硕美 (桶黄)Shuomei(Orange)
46 缤纷 (橙)Binfen(orange)
4O O1 50(橘红)0l 50(Orange)
41 高贵 (黄)Gaogui(Yelow)
5 北林之春 (金黄)Beilinzhichun(GoM)
27 新纪元 (金黄)x iyuan(Gold)
l3 F1B1(金黄)F1BI(Gold)
6 奇迹 (金黄)Marvel(Gold)
12 北林之春 (黄)Beilinzhichun(Yellow)
21 F1B3(黄)F1B3(YeUow)
8 北林之春 (橙黄)Beilinzhichun(Orange)
39 新纪元 (桶黄)x iyuan(orange)
25 F1B2(浅黄)F1B2(Light yelow)
1 7 新纪元 (黄)Xinjiyuan(YeUow)
7 安提瓜 (黄)Antigua(Yelow)
48 叭10(黄)0110(Yelow)
37 奇幻 (黄)Qihuan(Yelow)
42 安提瓜 (金黄)Antigua(Gold)
1 5 香草 (自)VaniUa(White)
3 皇室 (黄)Royal(Yelow)
34 美亚 (黄)Maya(Yelow)
1 l 梦之月 (亮黄)Moomtmc~Yelow)
28 梦之月 (橙黄)Moonstruck(Orange)
29 拳王 (黄)Quanwang(Yelow)
24 叭3O (黄)叭30(Yelow)
31 安提瓜 (桶红)Antigua(Orange)
35 完美 (金黄)Perfection(Gold)
10 杂交孔雀草 (黄)Tagetes erect~patula(Orange)
l8 完美 (橙)Perfection(Orange)
2O 完美 (黄)Perfection(Yelow)
32 奇迹 (橙红)Marvel(Orange)
36 奇迹 (黄)Marvel(Yelow)
23 北林之夏 (橙)Beilinzhixia(Orange)
26 印加人 (橘黄)Inca(Orange)
1 OO
甲2 万寿菊 个杂交一代品种的UPGMA聚类图
Fig．2 UPGMA dendrogram of 48 F1 marigold varieties
由于万寿菊遗传基础狭窄，采用形态学鉴定容易混淆品种。SRAP标记技术在万寿菊上的重复试
验结果稳定，能够区分绝大多数栽培品种。对于个别的遗传差异过小的品种虽不能用单个引物组合进
行鉴别，但可用两个引物组合来联合鉴别。SRAP聚类分析技术在扩增产物检测时采用较复杂的聚丙
烯酰胺凝胶电泳和银染，但与琼脂糖电泳检测结果相比其分辨率大大提高，且不使用溴化乙锭，环境
污染与操作危险小，可以为探讨万寿菊品种演化与亲缘关系提供有用信息。
本文讨论了部分 SRAP引物组合，但对比研究结果显示出万寿菊品种的SRAP多态性水平比矮牵
牛 (资料未列出)低，且同一系列的杂交种不能完全聚为一类。这进一步印证了万寿菊品种遗传基
础狭窄的事实，同时反映出一些公司在规划品种系列时主要根据农艺性状与形态学指标，同一系列的
品种其遗传背景不一定很相近。另外，万寿菊品种的聚类结果与花色的关联性不明显，可能万寿菊的
品种演化与花色相关基因没有必然的联系。在今后的育种材料选用时应充分注意这些信息。
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