全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 779 - 782
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 04; 修回日期 : 2007 - 04 - 183 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fsx20@1631com)
与石刁柏性别基因 M 紧密连锁的 AFL P新标记
韩莹琰 1, 2 , 杨　凯 3 , 范双喜 13 , 张振贤 2
(1 北京农学院植物科学技术系 , 北京 102206; 2 中国农业大学农学与生物技术学院蔬菜系 , 北京 100094; 3 北京农学
院农业应用新技术北京市重点实验室 , 北京 102206)
摘 　要 : 运用 BSA法构建石刁柏雌雄基因池 , 用 64种 AFLP引物组合共检测到 4个多态性位点 , 单株
验证结果表明 , 引物组合 E2ACG/M 2CTT产生的多态性片段 (命名为 E2ACG/M 2CTT2156) 与 M 基因连锁 ,
片段大小为 156 bp; 连锁遗传距离为 8133 cM。
关键词 : 石刁柏 ; 性别基因 M ; AFLP标记 ; BSA
中图分类号 : S 64416　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320779204
AFL P M arkers L inked w ith M Gene in A spa ragus offic ina lis L.
HAN Ying2yan 1, 2 , YANG Kai3 , FAN Shuang2xi13 , and ZHANG Zhen2xian2
(1D epatrm en t of P lan t Science and Technology, B eijing A gricultural College, B eijing 102206, China; 2D epartm en t of V egetable,
College of A griculture and B iotechnology, China A gricultural U niversity, B eijing 100094, China; 3 Key Laboratory of A gricultural
N ew Technology and A pplica tion in B eijing, B eijing A gricu ltura l College, B eijing 102206, China)
Abstract: In p resent study, the male and female bulk were set up by means of BSA , and AFLP was
used to study the sex difference on A sparagus off icina lis L. , 4 polymorphic segments were detected with 64
AFLP selective p rimer pairs. The result of individual amp lification showed that the specific 156 bp fragment
from p rimer combination ( E2ACG, M 2CTT) , named E2ACG/M 2CTT2156, was linked with M gene at a link2
age genetic distance of 8133 cM.
Key words: Asparagus off icina lis L. ; M gene; AFLP marker; BSA
石刁柏 (A sparagus off icina lis L. ) 系雌雄异株植物 , 雄株产量比雌株高出约 20% ～30% , 而且雄
株生长旺盛 , 品质好 , 产量高 , 寿命长 , 抗病性强。但石刁柏雌雄株在营养生长期形态特征极其相
似 , 早期无法辨别。因此 , 石刁柏雌雄株性别的早期鉴别在生产实践中有着重要的应用价值。
石刁柏的性别控制属于单基因决定型 , 其雄性基因型为 M - , 雌性基因型为 mm , M 对 m 显性
(任吉军 等 , 1993)。
一般认为性别决定基因调节雄性或雌性分化途径的相对活性 , 在性别分化程序表达中发挥决定性
作用。性别决定基因的研究是性别分化中最高水平的研究 , 也是彻底解决性别表达机理的关键所在
(汪俏梅 等 , 2002)。
国外学者运用分子生物学手段在石刁柏性别鉴定方面做了大量工作 (J iang et al. , 1997; J iang &
Sink, 1997; Stalla et al. , 1998)。J iang和 Sink ( 1997) 用 760个 RAPD随机引物进行筛选和研究 ,
得到了 2个与 M 基因连锁的分子标记 , 对其中 1个标记进行克隆测序 , 转化为 SCAR标记。其研究小
组 (J iang et al. , 1997) 还将所用材料母本植株的 163个标记定位于 13个连锁群上 , 覆盖总基因长
度为 1 281 cM , 标记平均间距为 719 cM , 父本的 183个标记定位于 9个连锁群上 , 覆盖总基因长度为
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
1 324 cM , 标记平均间距 717 cM , 其中母本的 9个连锁群与父本的 6个是部分同源的。4个 RFLP标
记和 14个 RAPD标记被定位在 M 基因所在的 L5染色体上。Stella等 (1998) 运用 BSA和 AFLP法找
到了 9个与石刁柏 M 基因连锁的 AFLP标记 , 但还未见这 9个 AFLP标记的序列分析的报道。
作者利用 AFLP技术对与 M 基因连锁的基因组区域进行分析 , 找出与 M 基因连锁的 AFLP分子标
记 , 确认其在染色体上的位置 , 同时对所获标记进行克隆测序 , 为选择和分离 M 基因打下基础。
1　材料与方法
供试石刁柏来自北京农学院蔬菜实验站石刁柏资源圃 , 选用 A10品系 , 根据田间性别鉴定结果 ,
分别取雌株、雄株各 30份 , 拟叶 DNA等量混合成雌株、雄株集群基因池。
对雌株 DNA池、雄株 DNA池进行 AFLP扩增 , 在两池间产生多态性的引物组合即初步认为与石
刁柏性别基因 M 连锁 , 然后利用该引物组合对建池单株进行扩增 , 进一步确定所筛选到的标记与目
标性别基因的连锁关系 , 并推算遗传距离 (W inter et al. , 1998)。
DNA的提取采用改良 CTAB法 (Murray & Themposon, 1999) ; 采用本课题组建立优化的石刁柏
AFLP反应体系 (王秀峰和李宪利 , 2006)。AFLP银染所需试剂购自北京华瑞新成科技有限公司 ,
DNA提取试剂、尿素、 Taq DNA聚合酶、AFLP选择性扩增引物等为上海生工生物工程公司产品。
T4 2DNA L igase为 Promega公司产品。
将银染 AFLP凝胶特异带的区域用 70%酒精灭菌 , 用手术刀将特异条带从玻璃板上剥离 , 放入离
心管中 , 加入 25μL 1 ×TE缓冲液 , 95℃ 3 m in, 1 000 r/m in离心 , 取上清液 5μL为模板 , 利用相同
AFLP特异引物选择扩增 , 产物用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳检测 , DNA片段长度正确。
PCR产物用北京天为时代科技有限公司 DNA产物纯化试剂盒纯化。PCR产物回收纯化以后 , 使
用 pGEM 2T Vector System I或者 pGEM 2T Easy Vector System I进行连接反应 ( Promega, USA )。使用
“质粒小提试剂盒 ”〔天根生化科技 (北京 ) 有限公司 〕提取质粒 DNA并纯化。由上海生工生物工程
公司进行克隆片段的测序。
2　结果与分析
211　AFL P引物的筛选
以 8种 E端引物和 8种 M端引物 , 共 64种引物组合对雌株 DNA池和雄株 DNA池进行 AFLP分
析 , 全部电泳图谱共出现 6 798条清晰可辨的 AFLP带 , 其中有 4种引物组合产生差异片段 4条 (表
1) , 差异片段百分率仅为 0106% , 遗传相似系数为 99194% , 说明石刁柏雌雄群体的遗传背景具有高
度的相似性。
表 1　各引物组合出现的 AFL P带数及其多态性
Table 1　AFL P polym orph ic fragm en t num ber in d ifferen t pr im er com b ina tion s
引物 Primer M2CTT M2CAT M2CAA M2CTA M2CAG M2CTG M2CAC M2CTC
E2AGG 98 101 114 52 116 82 138 86
E2AGT 98 88 126 112 134 104 114 120
E2ACA 118 144 125 (1) 90 90 122 128 142
E2ACC 124 76 104 111 (1) 123 106 82 83 (1)
E2ACG 121 (1) 152 123 114 122 144 90 98
E2ACT 130 132 74 120 88 122 106 58
E2AGC 116 66 100 112 88 84 48 92
E2AAG 120 96 90 98 110 158 96 90
　　注 : 括号内是初步观测发现的差异带数。
Note: Specific segments number by elementary observation in bracket.
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　3期 韩莹琰等 : 与石刁柏性别基因 M 紧密连锁的 AFLP新标记 　
差异片段的最小分子量是 156 bp , 最大分子量是 300 bp, 这与 Stella等 ( 1998) 的试验结果一
致。但还未见 Stella研究小组找到的与石刁柏性别基因 M 连锁的 AFLP标记的序列分析的报道 , 因此
本工作须从建池开始。
引物组合 E2ACG/M 2CTT在雄株集群基因池中扩增出了一条长约为 156 bp的多态性谱带 , 命名为
E2ACG/M 2CTT2156 (图 1)。
图 1　雌雄集群基因池 AFL P扩增结果
MW: Ladder DNA; F: 雌集群 ; M: 雄集群。
F ig. 1　AFL P band ing pa ttern s from bulk D NA
MW: Ladder DNA; F: Female bulk; M: Male bulk.
212　与 M 基因连锁片段的单株验证
将标记 E2ACG/M 2CTT2156在 60株建池单株中进行验证 (图 2和图 3)。
对 A10品系单株 (30株雄株 , 30株雌株 ) 进行 AFLP分析发现 , 60株中共有 5株发生交换 , 重
组率为 8133% , 遗传距离为 8133 cM , 单株检出率为 91167%。
图 2　标记 E2ACG /M 2CTT2156对雄池单株的 AFL P扩增结果
MW: Ladder DNA; 其余部分 : 雄池单株。
F ig. 2　AFL P am plif ica tion w ith marker E2ACG /M 2CTT2156 in ma le gene bulk ind iv idua ls
MW: Ladder DNA; O ther lanes: Male gene bulk individuals.
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图 3　标记 E2ACG /M 2CTT2156对雌池单株的 AFL P扩增结果
MW: Ladder DNA; 其余部分 : 雌池单株。
F ig. 3　AFL P am plif ica tion w ith marker E2ACG /M 2CTT2156 in fema le gene bulk ind iv idua ls
MW: Ladder DNA; O ther lanes: Female gene bulk individuals.
213　E2ACG /M 2CTT2156标记的测序
对标记 E2ACG/M 2CTT2156进行克隆测序 (图 4) , 经 NCB I数据库查寻 , 发现标记序列与 NCB I
公布的石刁柏 hypothetical p rotein ABD6312411克隆有 7413%的氨基酸同源性 , 说明标记 E2ACG/M 2
CTT2156在 NCB I公布的石刁柏 locus_ tag = 181 t 00020座位上。
图 4　标记 E2ACG /M 2CTT2156序列
F ig. 4　The sequence of the marker E2ACG /M 2CTT2156
本研究找到了一个与 M 基因连锁的 AFLP标记 , 可用于石刁柏早期性别选择 , 同时为利用已经公
布的信息 , 采用 STS进一步逼近性别决定基因 M , 提供了可行性和信息。其他 3个标记有待进一步验
证。
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