全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 125～127
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 12 - 08; 修回日期 : 2005 - 05 - 123 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhangzhen_nj@ hotmail1com)
梅 PG IP基因的克隆及全序列分析
李广平 1 　房经贵 1 　蔡斌华 1 　章　镇 13 　张长青 2
(1 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095; 2 金陵科技学院园艺系 , 南京 210038)
摘 　要 : 通过 PCR扩增 , 从梅基因组中得到 1条全长 1 192 bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 ( PGIP)
基因序列。该序列包含有 1个完整的开放阅读框和 1个内元。比对结果表明 , 克隆到的序列与桃、马哈利
樱桃中相应序列一致度分别为 96%和 95% , 其蛋白质序列与桃、马哈利樱桃的蛋白质序列一致度分别为
97%和 94%。该蛋白质序列中包含着一段亮氨酸重复序列。
关键词 : 梅 ; PGIP基因 ; 克隆 ; 序列分析
中图分类号 : S 66214　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120125203
C lon ing and Sequenc ing of PG IP Gene from P runus m um e S ieb
L i Guangp ing1 , Fang J inggui1 , Cai B inhua1 , Zhang Zhen13 , and Zhang Changqing2
(1 College of Horticulture, N an jing A gricultural U niversity, N anjing 210095, Ch ina; 2D epartm en t of Horticu lture, J in ling Institu te
of Technology, N an jing 210038, China)
Abstract: A 1 192 bp sequence of polygalacturonase2inhibiting p rotein ( PGIP) gene ( Genbank locus:
AY764131) was isolated by polymerase chain reaction ( PCR ) from Prunus m um e. This sequence had a
intron and a full open reading frame encoding the polygalacturonase2inhibiting p rotein. Its gene and derived
p rotein were both highly homologous to those from P runus persica and Prunus m ahaleb. A conserved leucine2
rich fragment had existed in the derived p rotein sequence.
Key words: P runus m um e; PGIP gene; Cloning; Sequencing
1　目的、材料与方法
多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 (polygalacturonase2inhibiting p rotein, PGIP) 能专一性地抑制真菌的
内切多聚半乳糖醛酸酶活性 , 促进植物体内寡聚半乳糖醛酸积累 , 有效阻断真菌侵染过程和抑制相应
病害的发生〔1〕。目前 , 已从大豆〔2〕、苹果〔3〕、梨〔4〕、树莓〔5〕、番茄〔6〕、马铃薯〔7〕等多种植物上克隆
到了该蛋白质的完整基因或部分片段。作者以梅为试材 , 克隆了该基因 ( Genebank 登录号为
AY764131)。
采集梅 ( P runus m um e Sieb. ) 品种 ‘大粒 ’8年生植株展叶期的幼叶 , 提取 DNA。以 5pi2CGT2
TCACCCGCAATCACATTTCTTATCC23pi和 5pi2TGGCCGTGGGAATTATTTGCAGCTTG23pi为引物进行 PCR扩
增。PCR反应体系及条件 : 10 ×PCR Taq buffer 2μL, 引物 (10μmol/L) 各 2μL, dNTP (10 mmol/
L each) 1μL, MgCl2 (25 mmol/L) 215μL, Taq酶 (5 U /μL) 015μL, 模板 DNA (20 ng/μL) 1μL,
ddH2 O 9μL。94℃预变性 2 m in; 94℃变性 1 m in, 61℃退火 2 m in, 72℃延伸 2 m in, 35次循环 ; 72℃
延伸 10 m in。扩增产物克隆于 PGEM 2T Easy载体上 , 转化感受态大肠杆菌。载体连接反应体系为 : 2
×Rap id ligation buffer 5μL, PGEM 2T Easy vector (50 ng) 1μL, PCR p roduct 60 ng, T4 DNA ligase (3
weiss U /μL) 1μL, ddH2 O补至 10μL。转化后的大肠杆菌在 37℃, 150 r/m in, 振荡培养 115 h之后 ,
吸取 100μL菌液至 LB固体培养基 (Amp100 mg/L、x2gal 018 mg/mL、 IPTG 018 mg/mL) 上 , 37℃培
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
养过夜。挑取白色单菌落 , 经 PCR初步鉴定后送上海申能博彩公司测序。对测序得到的核酸序列和
推导的氨基酸序列分别用 BLASTn和 BLASTp进行相似性搜索 , 用 DNAMAN 410绘制序列聚类图。
2　结果与讨论
　　以梅基因组 DNA为模板 , 扩增出了 1条长约
1 200 bp的目的条带 (图 1)。测序结果表明 , 该
条带的实际长度为 1 192 bp (图 2)。
BLASTn比对表明 , 该 DNA 片段与 Genbank
中登录的桃、马哈利樱桃的 PGIP基因序列长度
相同 , 一致度分别达 96%和 95% , E值都为 0。
结构分析发现 , 该序列基因的实际长度为 1 140
bp, 含有两个外元 ( 41～581 bp 和 729～1 180
bp) 和 1个内元 ( 581～729 bp ) , 内元两端具有
真核生物典型的 GT2AG拼接点序列特征 (图 2)。
BLASTp比对表明 , 该基因的蛋白质序列与桃、
马哈利樱桃的一致度分别达 97%和 94% , E值分
别为 0和 e - 180 , 表现出了极高的一致性。序列保
守性分析发现 , 该蛋白质还具有 1段 24个残基长
的亮氨酸重复序列 (163～186 bp ) , 这是多数植
物 PGIP 抗病基因表达蛋白特有的保守序列
(LXXLXXLXXLXLXXNXLXGX IPXX)〔8〕。
图 1　梅 PG IP基因的 PCR扩增
M: DNA marker; 1、3、4: PCR扩增产物电泳的 3次重复 ;
2: DNA空白对照。
F ig. 1　PCR am plif ica tion of PG IP gene from P runus m um e
M: DNA marker; 1, 3, 4: Three repeats of PCR amp lified
fragment; 2: DNA blank control.
图 2　梅 PG IP基因核酸序列及推导的氨基酸序列
核酸序列中的阴影部分为内元区 , 氨基酸序列中的阴影部分为亮氨酸重复区。3 表示终止子。
F ig. 2　Nucle ic ac id sequence of PG IP gene and its prote in sequence from P runus m um e
The sequence line with shade of nucleic acid rep resents intron, and that of p rotein indicates leucine2rich repeat. 3 Term inator.
　　由序列聚类图 (图 3) 来看 , 所有的 PGIP基因序列大致分为 4组 , 梅、桃和马哈利樱桃为一组 ;
砂梨、西洋梨和大桉为一组 ; 温州蜜橘、金橘、拉提普橘、澳洲指橘和枸橘为一组 ; 大豆和菜豆为一
组 , 基本表现出属内同源性很高、属间相对较低的特点。
有研究表明 : 不同来源的 PGIP, 其抑菌效果存在差异〔9〕。因此 , 本研究需要进一步对克隆到的
PGIP基因进行真核生物表达研究 , 验证其抑菌效果。
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　1期 李广平等 : 梅 PGIP基因的克隆及全序列分析 　
图 3　PG IP基因序列聚类图
F ig. 3　Hom ology tree of nucle ic ac id sequence of PG IP
参考文献 :
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