全 文 ：园 艺 学 报 2007, 34 (2) : 513 - 516
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 10 - 30; 修回日期 : 2007 - 03 - 073 E2mail: yuxiaoying1578@hunau1net
瓜叶菊耐热无性系离体筛选初步研究
于晓英 1, 23 , 卢向阳 2 , 李 达 1 , 张宏志 1 , 姚 觉 1 , 陈翠林 1
(1 湖南农业大学园艺园林学院 , 长沙 410128; 2 湖南农业大学生化与发酵工程实验室 , 长沙 410128)
摘 要 : 以编号为 B1、N1、Z1的瓜叶菊增殖期的愈伤组织和丛生芽为材料 , 用高温胁迫和羟脯氨酸
(HYP) 分别作为直接和间接选择压 , 进行了瓜叶菊耐热无性系的离体筛选研究。结果表明 : (1) 离体直
接筛选的适宜选择压为 40℃16～20 h, HYP间接筛选的适宜浓度为 30 mmmol·L - 1 ; (2) 经过直接选择、
HYP与高温胁迫结合多次筛选获得了 Z12121和 N12221两个耐热无性系 ; ( 3) Z12121与对照母株 Z1在叶片厚度、
气孔指数、栅栏组织厚度 /海绵组织厚度 ( TPT/TST) 方面存在显著差异 , 成年植株 Z12121和 Z1在花的育性
上也差异明显 , Z1结实率 85%以上 , 而 Z12121在人工授粉的情况下结实率也仅 110% ; N12221和其对照母株 N1
在形态和花的育性上没有明显差别 ; (4) 在 40℃24 h胁迫后 , Z12121和 N12221的热害指数、细胞丙二醛含量、
电解质伤害性外漏率都低于其对照母株 , 而 POD、SOD活性明显高于其对照母株。
关键词 : 瓜叶菊 ; 耐热无性系 ; 离体筛选 ; 热胁迫
中图分类号 : S 682 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2007) 0220513204
A Prelim inary Study on in V itro Selection of Hea t2toleran t C lona l L ines in
Senec io ×hybridus
YU Xiao2ying1, 23 , LU Xiang2yang2 , L IDa1 , ZHANG Hong2zhi1 , YAO Jue1 , and CHEN Cui2lin1
(1 College of Horticulture and Landscape, Hunan A gricultural U niversity, Changsha 410128, Ch ina; 2Laboratory of B iochem istry
and Ferm entation Engineering, Hunan A gricultural U niversity, Changsha 410128, Ch ina)
Abstract: U sing high temperature and HYP as direct and indirect selection stress, in vitro selection of
heat2tolerant clonal lines from tussock p lantlets and callus of senecio cruen tus was carried out. The results
showed that: (1) 40℃ for 16 - 20 h and 30 mmol·L - 1 HYP were op timal direct and indirect selection stress
p ressure, respectively; (2) Two heat2tolerant clones ( Z12121 and N12221 ) were obtained by using high tempera2
ture direct selection, HYP and high temperature selection; (3) The regenerated p lants of Z12121 were different
significantly from their mother p lants ( Z1 ) in leaf thickness, TPT/TST and stomata index. The fruit setting
rate of adult p lant of Z12121 was only 110% after artificial pollination, and the fruit setting rate of Z1 was over
85% , (4) After heat stress (40℃ 24 h) , the heat injury index, content ofMDA and electrolyte leakage of
the regenerated p lants of Z12121 and N12221were lower than their mother p lants , but the activity of POD and SOD
were higher than their mother p lants ( Z1 and N1 ).
Key words: Senecio ×hybridus; Heat2tolerant clonal lines; In vitro selection; Heat stress
瓜叶菊 (S enecio ×hybridus) 生长适温为 10～18℃, 耐热性很差 , 在我国大部分地区均不能
安全度夏。作者在已建立的瓜叶菊离体培养和植株再生技术体系上 (于晓英 等 , 2004, 2005 ) ,
利用高温胁迫直接筛选、HYP (羟脯氨酸 ) 与高温胁迫结合等方法进行了耐热无性系离体筛选的
研究 , 获得了两个耐热性比其母株有很大提高的无性系 , 并对其再生苗移栽后相关特征进行了初
步鉴定。
园 艺 学 报 34卷
1 材料与方法
111 材料
从湖南农业大学园艺园林学院教学基地瓜叶菊品种 ‘喜庆’与 ‘小丑’混合授粉后获得的实生变
异种质中选取有代表性的 3个单株 (来自同一母株 , 但花色不同 , 耐热性不同 , 这些性状都可以通过无
性繁殖稳定遗传 ) , 分别编号为 B1、N1、Z1 (其耐热性顺序为 B1 N1 Z1 ) , 取其茎段、花梗、花托等
器官为外植体 , 按于晓英等 (2004, 2005) 的方法获得离体培养物。然后用其处于增殖期的愈伤组织
(切成约 015 cm2的小块 ) 和丛生芽 (带 3～5个小芽 ) 进行耐热无性系的离体筛选。
112 胁迫压的选择
11211 温度的选择 将处于增殖期的离体培养材料放在恒温光照培养箱中 , 温度设为 30、35和
40℃, 光照 2 000 lx, 10 h /d, 设室温 (17 ±2) ℃为对照。经不同时间高温处理后的材料再放于室温
下进行恢复培养 , 21 d后统计存活率与增殖率 , 同时将能够恢复生长的进行继代培养。每个处理取
10瓶 , 每瓶 3～5个愈伤组织和丛生芽块 , 3次重复 (光照条件 , 室温和处理重复数 , 下同 )。
11212 渗透胁迫浓度的选择 选择羟脯氨酸 (HYP) 作为渗透胁迫选择剂 , 将愈伤组织和丛生芽分
别培养在含有 0、10、20、30、40、50 mmol·L - 1 HYP的 A4培养基 (于晓英 等 , 2004, 2005) 中。
培养 3周后 , 逐步去掉选择压 , 再培养 21 d。
相对生长量 ( % ) = (处理材料的终质量 - 始质量 ) /处理材料的始质量 ×100; 相对生长率
( % ) = (处理材料的相对生长量 /未处理材料的相对生长量 ) ×100。材料没有完全变褐 , 仍有绿色
或米黄色或乳白色的组织为存活。存活率 ( % ) =存活数 /接种块数 ×100, 增殖率 ( % ) =增殖芽
数 /接种丛芽数 ×100。
113 耐热系的筛选
直接筛选 : 将继代培养 1周左右处于增殖期的胚性愈伤组织和丛生芽块在 40℃胁迫下培养 20 h,
然后恢复到室温培养 21 d, 选取存活的愈伤组织和丛生芽块用同样的方法再筛选 2～3代。
HYP与温度胁迫结合筛选 : 将继代培养 1周左右处于增殖期的愈伤组织和丛生芽块接种到含有
30 mmol·L - 1 HYP的培养基上 , 室温培养 20 d。将能够恢复生长的材料转接到含有 20 mmol·L - 1
HYP的培养基室温培养 1周 , 然后在 40℃胁迫下培养 20 h, 再将能够恢复生长的材料转到含有 10
mmol·L - 1 HYP的培养基上恢复生长。21 d后将能够增殖的材料在 40℃ 20 h胁迫下再复筛 1～2代。
114 植株再生及移栽苗初步鉴定
将筛选存活下来的愈伤组织和丛生芽进行增殖和根的诱导 (于晓英 等 , 2004, 2005) , 使其形
成完整植株 , 并将入选系在 40℃ (24 h) 胁迫 , 进一步进行耐热性鉴定。
将入选系及其对照母株生长健壮一致的再生苗移栽到装有相同基质的花盆中 (各 60株 ) , 在相
同条件下进行栽培 , 30～40 d后检测气孔指数 (刘艳菊和李承森 , 2000) , 热害指数 (贾开志和陈贵
林 , 2005) , 叶片细胞电解质伤害性外漏率和丙二醛含量 (王惠群 等 , 1996) , 过氧化物酶 ( POD )
和超氧化物歧化酶 ( SOD) 活性 (陈立松和刘星辉 , 1997)。
2 结果与分析
211 选择压
21111 胁迫温度及胁迫时间 几个材料的愈伤组织和丛生芽块的生长在 30℃ 10～98 h 、35℃ 10 h
和 40℃ 8 h胁迫后受到的抑制作用很小 , 存活率均在 90%以上 , 35℃ 66 h和 40℃ 24 h胁迫后存活率
急骤下降 , 35℃ 94 h后 , 来自母株编号为 B1和 N2的材料存活率为 0; 40℃ 8～24 h胁迫 , 存活率随
着胁迫时间延长而快速下降。解除胁迫后 , 愈伤组织恢复能力明显低于丛生芽块 , 且热处理时间越
415
2期 于晓英等 : 瓜叶菊耐热无性系离体筛选初步研究
长 , 恢复能力越差 , 相对生长率越低 , 新芽分化越迟 , 数目越少。结果表明 , 40℃选择压力较大 , 使
材料到半致死的时间比较短 , 避免了因胁迫压低、培养时间长而出现的生理适应。认为 40℃ 16～20
h是瓜叶菊耐热变异无性系离体筛选的适宜温度和时间。
21112 HYP浓度 试验中几个材料的愈伤组织和丛生芽块在含有 10 mmol·L - 1和 20 mmol·L - 1 HYP
的培养基中培养 3周后仍有较高的存活率 , 相对生长率也比较高 ( 78% ) ; HYP 30 mmol·L - 1时存
活率 ≥4115% ; HYP 40 mmol·L - 1时大部分材料发生褐化 , 存活率仅为 1611% , 在 50 mmol·L - 1
HYP中培养 1周后 , 大量的材料出现褐化 , 3周后存活率均为 0。为了提高筛选的效率 , 又要维持一
定数量的选择群体 , 认为 HYP 30 mmol·L - 1是适宜的离体筛选浓度。
212 瓜叶菊耐热无性系的获得
21211 直接筛选获得 3个材料的愈伤组织和丛生芽经过 40℃ 20 h胁迫 3次筛选后 , 只有 Z1的丛生
芽块和愈伤组织各有 1个存活 , 分别编号为 Z12121、Z12122 , N1的愈伤组织有 1块存活 , 编号为 N12121。
21212 HYP与温度胁迫结合筛选获得 经过 HYP与温度胁迫结合进行第 3次筛选时 , 来自 B1母株
的材料已全部变褐死亡 , 来自 Z1的丛生芽和愈伤组织还有小部分存活。到第 4次筛选时 , Z1的愈伤
组织还有 1块存活 , 编号为 Z12221 , N1的愈伤组织有 2块存活 , 分别编号为 N12221、N12222。
21213 初选系植株再生及耐热性比较 将 Z12121、 Z12122、 Z12221、N12121、N12221、N12222按照于晓英等
(2004, 2005) 的方法进行增殖及芽的分化和根的诱导培养 , 在培养过程中 N12121、Z12122没有获得再生
植株。
将获得的 Z12121、Z12221、N12221、N12222再生植株进一步在 40℃温度下持续热胁迫 24 h, 然后恢复到
室温培养 20 d, 结果发现 Z12121的存活率高达 6313% , N12221的存活率可达 40% , 而 Z12221及 N12222和它们
的母株 Z1和 N1已全部受伤致死。初步确定 Z12121和 N12221为耐热入选系。
213 耐热无性系的初步鉴定
21311 性状比较 将长根后的试管苗移栽到花盆中 , 培养 30～60 d后 (2005年 8月 ) 发现 Z12121和
N12221能较好地忍耐当地 7～8月高温。
从表 1可以看出 , Z12121和其母株 Z1叶片大小没有差别 , 但叶基厚度、气孔指数、栅栏组织 /海绵
组织比值大于母株 , 其栅栏组织不仅比母株厚 , 而且排列也更整齐致密。正常栽培管理条件下 , 进入
花期后 , 无性系 Z12121和母株 Z1在花色、花径大小、开花时间方面没有差别。Z1母株进入盛花期时 ,
筒状花上有很多金黄色的花粉 , 结实率 85%以上。而 Z12121从始花到谢花期间 , 一直未看到有花粉散
出 , 但剥开花药后可看到有花粉 , 只是花粉的畸形率高达 40% (图 1) , 给 Z12121人工授予 Z1的花粉
后 , Z12121的结实率也仅 110%。对于这一变异的机制有待进一步的研究。
N12221和其母株 N1比较 , 除了气孔指数高于母株外 , 叶片大小 , 叶柄长度、叶基厚度、栅栏组织 /
海绵组织比值与母株没有差别 (表 1)。正常栽培管理条件下进入花期后 , N12221的花器官发育情况
(开花时间、花色、花径大小、花的育性 ) 和其母株基本一致。
表 1 耐热无性系再生苗适温下的性状表现 (移栽后 30 d )
Table 1 Character istics performance of hea t2toleran t clona l lines under optima l tem pera ture ( tran splan ted after 30 d)
材料编号
Materials
叶尖厚度
Thickness of
tip of leaf(mm)
叶基厚度
Thickness of
leaf base (mm)
叶片长度
Length of leaf( cm)
叶片宽度
W idth of leaf( cm)
栅栏组织 /海绵组织
Thickness of palisade tissue /
Thickness of spongy tissue
气孔指数
Stomata index
Z1 0131 ±0121 a 1147 ±0140 a 4147 ±0156 a 4137 ±0158 a 0124 ±0123 a 0110 ±0111 a
Z12121 0146 ±0125 b 1187 ±0154 b 4138 ±0148 a 4130 ±0153 a 0138 ±0127 b 0118 ±0115 b
N1 0125 ±0121 a 1117 ±0140 a 6102 ±0156 a 5199 ±0158 a 0127 ±0123 a 0108 ±0111 a
N12221 0125 ±0125 a 1119 ±0154 a 5190 ±0148 a 6100 ±0153 a 0128 ±0127 a 0113 ±0115 b
注 : 不同小写字母代表不同材料间存在 P = 0105显著性差异。下同。
Note: The different letters are significantly different at 5% level1 The same below.
515
园 艺 学 报 34卷
21312 耐热性比较 将正常培养 30 d的移栽苗进行 40℃ 24 h的胁迫处理 , 解除热胁迫 7 d后 , Z12121
和 N12221的热害指数、电解质伤害性外漏率和 MDA含量显著低于其母株 , 说明其耐热性有所提高 , 在
热胁迫后细胞膜过氧化程度较低 , 能保持较好的稳定性 ; 细胞保护酶 SOD、 POD活性也明显高于其
母株 (表 2) ; 植株几乎看不到明显的伤害症状 (图 2)。
表 2 40℃ 24 h胁迫后的热害指数、细胞膜稳定性和保护酶活性
Table 2 Hea t in jury index, hea t stab ility of m em brane and activ ity of POD and SOD after HS ( 40℃ 24 h)
材料编号
Materials
热害指数
Heat injury index
电解质伤害性外漏率
Electrolyte leakage ( % )
MDA
(μmol·g - 1 FM)
POD
(U·s - 1 ·g - 1 FM)
SOD
(U·g - 1 FM)
Z1 0182 ±0115 a 83171 ±2157 a 1122 ±0125 a 0163 ±0128 a 210130 ±4510 a
Z12121 0116 ±0110 b 52172 ±2116 b 0166 ±0117 b 1162 ±0122 b 378160 ±5110 b
N1 1100 ±0116 a 94150 ±2151 a 1162 ±0122 a 0153 ±0123 a 150110 ±3710 a
N12221 0133 ±0112 b 63180 ±2112 b 0189 ±0114 b 1132 ±0120 b 301150 ±4510 b
图 1 Z12121和 Z1 的花和花粉
F ig. 1 Flower and pollen of Z12121 and Z1 图 2 30 d移栽苗的耐热性比较F ig. 2 Com par ison of hea t tolerance am ong plan tletstran splan ted after 30 d ( 40℃ 24 h)
References
Chen L i2song, L iu Xing2hui. 1977. Kinds of identification index for p lant heat resistance. Agricultural Research in the A rid A reas, 15 (4) : 72
- 77. ( in Chinese)
陈立松 , 刘星辉. 1977. 植物抗热性鉴定指标的种类. 干旱地区农业研究 , 15 (4) : 72 - 77.
Jia Kai2zhi, Chen Gui2lin. 2005. Tolerance of different eggp lant varieties at seedling stage to high temperature stress. Chinese Journal of Ecology, 24
(1) : 398 - 401. ( in Chinese)
贾开志 , 陈贵林. 2005. 高温胁迫下不同茄子品种幼苗耐热性研究. 生态学杂志 , 24 (1) : 398 - 401.
L iu Yan2ju, L i Cheng2sen. 2000. On metaseguoia in eocene age from L iaoning p rovince of northeast China. Acta Botanica Sinica, 42 (8) : 873
- 878. ( in Chinese)
刘艳菊 , 李承森. 2000. 中国辽宁省始新世水杉的研究. 植物学报 , 42 (8) : 873 - 878.
W ang Hui2qun, Sun Fu2zeng, Peng Ke2qin, Sun Zhi2ying. 1996. Effects of submergence treatments on membrane lip id peroxidation and perme2
ablity of rice leaf. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) , 22 (3) : 222 - 224. ( in Chinese)
王惠群 , 孙福增 , 彭克勤 , 孙志英. 1996. 淹水处理对水稻叶片膜脂过氧化作用及细胞透性的影响. 湖南农业大学学报 , 22
(3) : 222 - 224.
Yu Xiao2ying, Lu Xiang2yang, Long Yue2lin , He Shao2bo, Ren Xiang2li, L i Xiang2ting. 2005. In vitro culture and p lant regeneration of pedi2
cel and recep tacle of Senecio ×hybridus. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) , 31 (4) : 399 - 401. ( in Chinese)
于晓英 , 卢向阳 , 龙岳林 , 何少波 , 任向丽 , 李向婷. 2005. 瓜叶菊花梗和花托愈伤组织的诱导与植株再生研究. 湖南农业大学
学 报 , 31 (4) : 399 - 401.
Yu Xiao2ying, Lu Xiang2yang, W u Tie2m ing, L i Xiang2ting, Ren Xiang2li, Cao2hui. 2004. In vitro culture and high frequency p ropagation of
Senecio ×hybridus. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) , 30 (5) : 429 - 433 . ( in Chinese)
于晓英 , 卢向阳 , 吴铁明 , 李向婷 , 任向丽 , 曹 辉. 瓜叶菊的离体培养与快速繁殖. 湖南农业大学学报 , 2004, 30 (5) : 429 - 433.
615