全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 29 - 34
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 04 - 01; 修回日期 : 2006 - 10 - 17
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30471196)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: chenxs@ sdau1edu1cn)
桃远缘杂种的获得及杂种胚抢救技术
刘　文 1 , 陈学森 13 , 刘冠军 2 , 吴　燕 1
(1 山东农业大学果树生物学实验室 , 山东泰安 271018; 2 山东农业大学食品科学与工程学院 , 山东泰安 271018)
摘 　要 : 以桃为母本 , 与经过处理的李、杏花粉进行远缘杂交 , 成功地对杂种幼胚进行了胚抢救 , 并
对部分杂种进行了分子鉴定。研究表明 , 在以 ‘雨花露 ’为母本的杂交组合中 , 杂种胚的败育发生于授粉
后第 7周 , 而以 ‘中华寿桃 ’为母本的杂交组合中 , 杂种胚的败育开始于授粉后第 8周 ; 以早熟桃品种
‘雨花露 ’为母本的杂种胚 PF (胚长 /种子长 ) 值为 015时幼胚萌发率仅为 617% , 而以晚熟品种 ‘中华寿
桃 ’为母本的杂种胚 PF值为 015时幼胚萌发率却大于 50% ; 适宜场强的静电场处理父本花粉后可显著提
高杂种胚培苗多丛芽诱导增殖效率 , 而父本花粉经过 60 Coγ射线照射后得到的胚培苗 , 多丛芽诱导效果较
差 , 组培苗长势较弱 ; 在胚抢救技术体系中 , 杂种胚最佳萌发及生长培养基为 1 /2MS + 62BA 4 mg·L - 1 +
IBA 015 mg·L - 1 , 胚萌发及分化率达 90% ; 最佳多丛芽诱导及增殖培养基为 MS + 62BA 110mg·L - 1 + IBA
110 mg·L - 1 , 最佳生根培养基为 MS + IAA 015 mg·L - 1 +NAA 012 mg·L - 1 ; SSR技术对杂种鉴定结果表
明 , 所获杂种为真杂种。
关键词 : 桃 ; 李 ; 杏 ; 远缘杂交 ; 胚抢救 ; SSR
中图分类号 : S 66211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120029206
In terspec if ic Hybr id iza tion of P runus persica w ith P. a rm en iaca and P.
sa lic ina Using Em bryo Rescue
L IU W en1 , CHEN Xue2sen13 , L IU Guan2jun2 , and WU Yan1
(1 Fru it B iology Labora tory, Shandong A gricultural U niversity, Taipian, Shandong 271018, Ch ina; 2 College of Food Science and
Engineering, Shandong A gricultural U niversity, Ta ipian, Shandong 271018, Ch ina)
Abstract: Some interspecific hybrids were obtained after hybridization of P runus persica with treated
pollens from P. arm eniaca and P. sa licina , then the hybrid embryoswere successfully rescued, and a molecu2
lar identification was made in part of the hybrids. The results showed that the hybrid embryo abortion started
from the 7 th or 8 th week after pollination in cross when used the Yuhualu or Zhonghua Shoutao as the female
parent. The cultivars with different durations for fruit development and the ages of hybrid embryos have great
effects on the rate of embryo germ ination and growth. A t the same age (when the PF value was around 015) ,
the late peach cultivar Zhonghua Shoutao acquired more than 50% of embryo germ ination rate, but the early
peach cultivar Yuhualu gave only 617% of it. Treatment of male parent pollen in the electrostatic field at an
app rop riate dosage imp roved the efficiency of bud inducement and multip lication, but treatment with 60 Coγ2
ray reduced the efficiency and p roduced weak buds. For rescuing the hybrid embryos, it is concluded that the
medium 1 /2MS + 62BA 4 mg·L - 1 + IBA 015 mg·L - 1 can increase the embryo germ ination rate up to
90% , the MS + 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 110 mg·L - 1 is the best medium for bud induction and multip li2
cation, and the MS + IAA 015 mg·L - 1 + NAA 012 mg·L - 1 is the best rooting medium. SSR identification
p roves that the hybrids obtained by the embryo rescuing system are true ones.
Key words: P runus persica L. ; P runus sa licina L indl. ; P runus arm eniaca Lam. ; Interspecific hybrid2
ization; Embryo rescue; SSR
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
在核果类果树中 , 桃 ( P runus persica L. ) 的品种全部为自交亲和的 , 而杏 ( P. arm eniaca Lam. )
和李 ( P. sa licina L indl. ) 绝大多数品种是自交不亲和的。为了探讨桃自交亲和基因的遗传 , 并培育
自交亲和的李、杏新种质 , 在已有研究工作的基础上 , 以桃为母本与用静电场和 60 Coγ射线照射等
方法处理过的李、杏花粉进行杂交 , 对杂种幼胚进行了胚抢救 , 研究并建立了桃胚抢救技术体系 , 并
对杂种胚培苗进行了分子鉴定。
1　材料与方法
111　杂交授粉
试验于 2003～2004年在山东农业大学果树生物学实验室、泰安市南许果园及山东农业大学泰安
横岭果树育种基地进行。母本为 ‘中华寿桃 ’及 ‘雨花露 ’桃 , 父本为 ‘新世纪 ’杏、‘莫尔特尼 ’
李和 ‘总统 ’李。根据父母本花期 , 分别进行温室催花或采集田间大蕾期的花粉 , 室温 ( 20℃) 条
件下阴干 , 置于干燥器中在 1～2℃冰箱中保存备用。父本花粉分别使用高压静电场、60 Coγ射线照射
处理 (图 1)。授粉前测定各父本花粉的离体萌芽率。授粉后 1～10周调查各杂交组合中杂种胚发育
情况 , 每周调查一次 , 以种胚的发育情况为指标 , 确定杂种胚败育及胚抢救的时期。
112　远缘杂种胚抢救技术体系的建立
以部分杂种桃幼胚为试材 , 以 MS、1 /2MS、Tukey为基本培养基 , 附加不同浓度的植物生长调节
剂 , 35 g·L - 1蔗糖 , 615 g·L - 1琼脂 , pH调至 518, 进行预备试验 , 筛选出适合胚萌发及生长的培
养基。将杂种果实在 70%酒精中浸泡 30 s, 再用 10%次氯酸钠灭菌 8～10 m in, 取出种胚接种于试管
中。光照 2 000 lx, 12 h·d - 1 , 温度 (25 ±2) ℃。将胚培新梢接种在 MS附加不同浓度的 62BA、 IAA
及 IBA的培养基上 , 进行胚培苗的多丛芽诱导与再增殖培养。将真叶数大于 5, 高度大于 2 cm的杂
种多丛芽新梢接种在 MS附加不同浓度 IAA及 NAA的培养基上 , 进行生根培养。
113　胚培养杂种幼苗的分子鉴定
采用 CTAB法提取胚培杂种幼苗和它们亲本的幼叶的基因组 DNA , 电泳法检测 DNA浓度和质量。
8对多态性理想的 SSR 引物均筛选自桃基因组和 BAC文库 ( Streiff et al. , 1998; Sosinski et al. ,
2000; D irlewanger et al. , 2002)。
2　结果与分析
211　静电场和 60 Coγ射线处理对父本花粉离体
萌芽率的影响
由图 1可知 , 与γ射线处理相比 , 多数强度
的电场处理可显著促进花粉萌芽率 , 其中以
333133和 434178 kV·m - 1处理效果明显 , 这表明
一定剂量的静电场处理可帮助克服受精前障碍。
但γ射线处理 , 尤其是处理强度高于 150 Gy剂量
的射线对父本花粉的离体萌芽未产生明显正效应。
212　杂种胚败育时期的确定
授粉后 1～3周杂交果大量脱落 , 表现为受精
前杂交不亲和 ; 授粉后 4～5周杂交果数目变化较
小且果个略有增大 , 但剥开后未见种胚 , 仅见受异
源花粉刺激而产生的膨大子房 ; 授粉后 6～10周杂
图 1　不同处理剂量下 ‘新世纪’花粉的离体萌芽率
F ig. 1　The pollen germ ina tion ra te in vitro of X in sh iji
apr icot trea ted w ith d ifferen t dosages
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　1期 刘 　文等 : 桃远缘杂种的获得及杂种胚抢救技术 　
交果又大量脱落 , 表现受精后杂交不亲和 , 切开后可见变褐且浆糊状的胚乳 , 而自然授粉得到的果实
中有正常发育的幼胚与乳白色的胚乳。在 ‘雨花露 ’为母本的杂交组合中 , 从第 7周开始出现胚乳
变褐以及幼胚退化现象 , 而 ‘中华寿桃 ’为母本的组合中 , 胚乳变褐及幼胚退化的时间开始于第 8
周。
213　母本品种及其胚龄对杂种胚萌发的影响
由表 1可以看出 , 胚龄越长 , PF值 (胚长 /
种子长 ) 越大 , 胚萌发及生长率越高。但 PF值
相同时 , 果实发育期不同的品种 , 其胚萌发及生
长率差异甚大。上述结果表明 , 果实发育期的长
短及其胚龄的大小对远缘杂种幼胚萌发及生长率
影响很大。
214　父本花粉处理对杂种胚培苗多丛芽诱导与增
殖的影响
杂种幼胚 (父本花粉经过不同处理 ) 经过萌
发生长培养后 , 接种在适宜植物生长调节剂浓度
的培养基上进行多丛芽诱导与增殖 , 连续培养 3
代 , 每世代取 20个芽记录增殖的多丛芽总数量 ,
计算其平均增殖效率。对 ‘中华寿桃 ’杂种的调
查结果见表 2, 花粉经过电场处理后得到的杂种
胚培苗 , 多丛芽诱导数明显多于对照和 60 Coγ射
线照射处理 , 且芽体长势好 , 其中以父本为新世
纪的杂种多丛芽诱导增殖效率最高 ; 而父本花粉
经过 60 Coγ射线照射后得到的杂种胚培苗 , 多丛
芽诱导及增殖情况较差 , 丛芽数少 , 生长畸形或
退化为愈伤组织 (图版 , 1～3)。
表 1　果实发育期不同的品种及其胚龄对杂种胚萌发及生长的影响
Table 1　Effect of peach cultivars with differen t durations for fru it
development and the embryo age on embryo germ ina tion and growth
母本
Female parents
胚龄
Embryo age (week)
PF 胚萌发率
Germination rate (% )
中华寿桃 5 0 　0
Zhonghua 6 0 　0
Shoutao 8 010～013 1515
10 013～015 5816
12 015～018 8612
13 ≥018 10010
雨花露 Yuhualu 5 0 　0
6 0 　0
7 010～013 　0
8 013～015 　617
9 015～018 52
10 018～110 80
表 2　三世代的平均增殖效率
Table 2　The average coeff ic ien t multiplica tion of three generations
处理 Treatments
父本 Female parents
‘新世纪’杏
Xinshiji
ap ricot
‘总统’李
President
p lum
‘莫尔特尼’李
Morettini
p lum
电场 716 510 613
Electrostatic field
60 Coγ 411 218 410
对照 Control 616 315 415
215　胚抢救技术的建立
21511　杂种胚萌发及生长 　基本培养基对杂种胚的萌发及生长影响很大 , 在 1 /2MS培养基上胚的萌
发率最高 (70112% ) , 且胚梢生长健壮 , 叶片数多 ; 在 MS培养基上萌发率为 5715% ; 而在 Tukey培
养基上萌发率仅为 3510% , 接种后 10 d才见胚膨大变绿 , 13 d后见真叶 , 胚梢长势较弱 , 部分叶片
卷曲 (图版 , 4～6)。由此可知 , 1 /2MS培养基是桃远缘杂种胚萌发及生长的适宜培养基。
由表 3可以看出 , 细胞分裂素 (62BA) 对桃远缘杂种幼胚萌发率影响很大 , 且 62BA浓度越大 ,
表 3　不同 62BA、 IBA和 IAA组合对远缘杂种胚萌发及生长的影响
Table 3　Effect of 62BA, IBA and IAA com b ina tion s on peach em bryo germ ina tion and growth
处理 Treatments(mg·L - 1 )
62BA IBA IAA 萌发率Germ ination rate ( % ) 真叶数Number of true leaves 苗高Average height ( cm)
1 015 0 50 513 1100
2 015 0 60 1714 1112
3 015 0 70 1211 1156
4 015 0 90 1610 1185
1 0 015 30 414 0189
2 0 015 60 615 1120
3 0 015 60 10 1174
4 0 015 80 12 1170
　　注 : 真叶数 =总真叶数 /接种总数。
Note: Number of true leaves = total number of true leaves/number of exp lants.
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杂种胚萌发率越高 , 当 62BA浓度为 4 mg·L - 1时 , 杂种胚萌发率最高 (90% ) , 而 62BA浓度对胚培
苗的生长状态 (真叶数及苗高 ) 影响不大。本试验筛选出 62BA 4 mg·L - 1和 IBA 015 mg·L - 1为桃远
缘杂种幼胚萌发及生长的最佳植物生长调节剂配比。
21512　杂种胚培苗多丛芽诱导与增殖培养 　由表 4可以看出 , 较低浓度的 62BA和生长素 , 对诱导多
丛芽的培养效果较差 , 增殖系数低 , 产生的多丛芽很少 , 芽体长势一般 ; 高浓度的 62BA和生长素 ,
对再生多丛芽的效果很好。本试验筛选出 62BA 1 mg·L - 1 + IBA 1 mg·L - 1组合进行多丛芽的诱导增
殖培养。
21513　杂种胚培苗的生根培养 　如表 5所示 , IAA 015 mg·L - 1 +NAA 012 mg·L - 1组合对桃远缘杂
种的生根效果最为理想 , 根形态好 , 侧根多 (图版 , 7)。而以 NAA单独诱导生根 , 仅生成基部膨大
粗短的寄生根 , 且根量少 , 无侧根。
表 4　不同 62BA、 IBA和 IAA配比对杂种胚培苗
多丛芽诱导及增殖的影响
Table 4　Effect of 62BA, IBA and IAA com b ina tion s on bud
inducem en t and m ultiplica tion in hybr ids
处理 Treatments(mg·L - 1 )
62BA IBA IAA 增殖系数Coefficient ofmultip lication 平均生长量Average height( cm)
015 1 0 415 1120
110 1 0 810 3155
115 1 0 612 2187
210 1 0 815 2150
015 0 1 319 1156
110 0 1 716 2198
115 0 1 512 2150
210 0 1 711 2160 表 5　 IAA、NAA对杂种苗生根的影响Table 5　Effect of IAA and NAA com b ina tion son shoot rooting of peach hybr id处理 Treatments (mg·L - 1 )IAA NAA 增殖系数Coefficient ofmultip lication 平均生长量Average height( cm)110 0 3 617115 0 5 7100 110 3 4150 115 2 213015 012 8 810015 015 5 716
216　杂种胚培苗的分子鉴定
对杂种胚培苗进行 SSR检测结果为 , 在 ‘中华寿桃 ’ ב新世纪 ’杏的杂交组合中 , 杂种拥有
母本的 5条特异带 , 同时拥有父本的 2条特异带 ; 在 ‘中华寿桃 ’ ב总统 ’李和 ‘中华寿桃 ’ ×
‘莫尔特尼’李的杂交组合中 , 杂种同样继承了父母的特异带 (图 2) , 由此可以确定杂种的真实性。
图 2　杂种胚培苗的 SSR分子鉴定
M. DL 2000; 1. ‘新世纪’杏 ; 2. ‘中华寿桃’ ב新世纪’杏 ; 3. ‘中华寿桃’; 4. ‘中华寿桃’ ב总统’李 ;
5. ‘总统’李 ; 6. ‘中华寿桃’ ב莫尔特尼’李 ; 7. ‘莫尔特尼’李。
F ig. 2　M olecular iden tif ica tion of hybr id peach shoots w ith SSR
M. DL2000; 1. Xinshiji ap ricot; 2. Zhonghua Shoutao peach ×Xinshiji ap ricot; 3. Zhonghua Shoutao peach;
4. Zhonghua Shoutao peach ×President p lum; 5. President p lum; 6. Zhonghua Shoutao peach ×Morettini p lum; 7. Morettini p lum.
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3　讨论
311　果实发育期及胚龄对胚萌发、生长的影响
核果类果树的早熟或极早熟品种 , 由于果实发育期短 , 胚发育不完全 , 常规层积播种很难成苗 ,
而胚培养或胚抢救技术的产生在育种中发挥了重要作用。
有研究表明 , 胚龄是影响胚培养成功的关键因素之一 (A lberto et al. , 1994)。Yang等 (2004)
研究结果表明 , 胚龄对李、杏远缘杂种胚培养影响较大 , 适当延长杂种胚抢救时间可有效提高杂种萌
芽率。
本试验发现 , 胚龄 ( PF值 ) 相同时 , 果实发育期不同的品种 , 其胚萌发及生长率差异甚大。此
外 , 在杂种胚的发育过程中 , 败育现象一直潜在 , 胚抢救的时期应在败育开始直到果实成熟 , 并尽量
将时间延后 ( PF > 015) , 这样可以在更大范围内以更高的成功率挽救杂种胚。
312　培养基及低温处理对杂种幼胚萌发及生长的影响
远缘杂种胚培养成功与否 , 与培养基及添加植物生长调节剂的种类、浓度有关 (H irsch et al. ,
2001; Roy et al. , 2004)。本试验中 , 杂种幼胚接种在 1 /2MS培养基上萌发生长表现较好 , 与前人试
验结论 (朱际君 等 , 1983; 陈学森 等 , 1996) 基本一致。
核果类果树的幼胚培养成功的另外一个关键因素就是胚的低温处理。研究表明 , 桃胚培养时需要
在 2～4℃低温下处理种胚 70 d才能打破休眠 (W ang et al. , 2004)。本试验中 , 桃远缘杂种在 2～4℃
低温下处理 30 d后将胚接种在萌发培养基上 , 附加了较高浓度 (4 mg·L - 1 ) 62BA促进幼胚萌发 ,
并得到了较高的萌发率 (90% ) , 这与杂种幼胚低温处理时间不够 ( < 70 d) , 未能彻底解除休眠有
很大关系。
313　父本花粉处理对杂种胚培苗多丛芽诱导增殖的影响
本试验中发现电场不仅可以提高花粉离体萌芽率 , 在一定程度上克服远缘杂交不亲和性 , 而且这
一效应也反应在受精后的胚性生长上。
有研究报道 , 用一定剂量的 60 Coγ射线处理水稻和小麦等农作物花粉 , 提高了杂交亲和性 (庞伯
良和万贤国 , 1998; 李桂英 等 , 2003)。但我们发现本试验所用的辐射剂量无论对花粉还是对杂种的
胚性生长都未产生促进作用 , 而且杂种胚培苗长势较弱 , 多丛芽诱导及增殖情况较对照差 , 因此电场
及辐射处理所引起的遗传、生理及分子机制有待进一步研究。
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Explana tion of pla tes: 1 - 31Effect of pollen treatment on bud inducement and multip lication; 4 - 61 The growth of hybrids on different medium;
71Rooting of hybrid shootsMS + IAA 015 mg·L - 1 +NAA 012 mg·L - 1 1
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