全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1275～1280
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 04 - 10; 修回日期 : 2006 - 06 - 14
基金项目 : 广东省科技计划项目 (2002A2070402)3 通讯作者 Author for correspondence
高羊茅抗真菌病基因转化的研究
马生健 1, 2 　徐碧玉 3 　曾富华 13 　卢向阳 2
(1 湛江师范学院生物系 , 广东湛江 524048; 2 湖南农业大学生物技术系 , 湖南长沙 410128; 3 中国热带农业科学院热
带作物国家重点实验室 , 海南海口 571101)
摘 　要 : 通过农杆菌介导法将双价载体 (含抗真菌病的几丁质酶基因 Chi和β - 1, 3 - 葡聚糖酶基因
Glu) 导入高羊茅愈伤组织细胞内 , 建立了高羊茅的农杆菌转化体系 , 获得了抗真菌病的转基因高羊茅植
株。在转化过程中 , 确定了卡那霉素 ( Kan) 筛选剂的浓度以 200～300 mg/L为宜 , 联合运用羧苄青霉素
(Carb) 与头孢霉素 (Cef) 作为抗菌素能得到好的脱菌效果 ; 农杆菌的几种共培养方式对转化频率的影响
表明 , 共培养基上垫一层滤纸 , 愈伤周围滴加浸染液 , 恢复培养 1周后用甘露醇和抗生素液洗涤 , 是一种
好的转化方式。对转化植株进行 PCR分析和分子杂交及禾谷镰刀菌挑战接种 , 发现转化植株有高阳性率及
抗真菌能力。
关键词 : 高羊茅 ; 草坪草 ; 农杆菌 ; 转化 ; 真菌
中图分类号 : S 68814　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621275206
Stud ies on Genetic Tran sforma tion w ith Resistance to Fung i D isea se of Ta ll
Fescue
Ma Shengjian1, 2 , Xu B iyu3 , Zeng Fuhua13 , and Lu Xiangyang2
(1D epartm ent of B iology, Zhanjiang N orm al College, Zhanjiang, Guangdong 524048, Ch ina; 2D epartm ent of B iotechnology,
Hunan A gricultural U niversity, Changsha, Hunan 410128, China; 3 The S ta te Key Labora tory of Tropica l C rops B iotechnology,
Chinese A cadem y of Tropical A gricu ltural Sciences, Haikou, Hainan 571101, Ch ina)
Abstract: Lawn is p laying a more and more important role in humanpis life, but its fungi disease is a im2
portant p roblem which should be solved urgently in the maintenance of lawn. In the paper, the binary vector
harboring Glu and Chi gene was transformed into calli of tall fescue mediated by Ag robacterium tum efacien, and
the suitable transformation p rotocol of A g robacterium of tall fescue was established. In the transformation, we
confirmed that, the op timum concentration of selective agent kanamycin was 200 - 300 mg/L , the combination
of carbercillin and cefotaxine as inhibitive agents had good inhibitive effect to A grobacterium ; The results of
several cocultivation methods of Ag robacterium showed that, putting some filter paper on cocultivation medium,
and dripp ing infection solution of A g robacterium around the calli, and using mannitol and antibiotic solution to
washing calli 1 week after resum ing cultivation, was the best way of transformation. The results of molecular
detection of PCR and Southern2blotting and challenge inoculation experiment with F. gram inearum Schwabe
showed that, transformed p lants had higher positive frequency and resistance to fungi disease than the control
respectively.
Key words: Tall fescue; Turfgrass; A grobacterium tum efacien; Transformation; Fungi
在草坪的建植与养护过程中 , 真菌病害是值得重视的问题。抗真菌性病害基因中最为常用的是几
丁质酶基因 (Ch i) 和β - 1, 3 - 葡聚糖酶基因 ( Glu) , 分别编码几丁质酶和β - 1, 3 - 葡聚糖酶 ,
催化病原真菌的细胞外壁主要成分几丁质与β - 1, 3 -葡聚糖的水解。此类基因已被转入小麦〔1〕、番
茄〔2〕等作物。目前关于草坪草的转基因研究报道不多 , 第 1个被报道的转基因草坪草是 Ha等〔3〕用基
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因枪将含 hph的嵌合基因转化得到的高羊茅。接着 , 转基因匍匐剪股颖〔4〕、多年生黑麦草〔5〕等也被
报道。但其中关于农杆菌转化抗真菌病害基因的研究不多。本研究建立了一个高羊茅高效优化的农杆
菌转化系统 , 获得了抗真菌病害的转化植株。
1　材料与方法
111　材料、菌种、质粒及培养基
植物材料 : 高羊茅 ( Festuca arund inacea Schreb. ) FirewarⅡ。农杆菌 : LBA4404。pCG2Ⅱ质粒〔2〕
含有几丁质酶基因 (Chi) 和β21, 3 -葡聚糖酶基因 (Glu ) 及筛选标记基因 N PTⅡ, 由华南热带农
业大学海口生物技术国家重点实验室李继红构建并提供。
农杆菌培养基为 YEP培养基 : 蛋白胨 (10 g/L ) +酵母提取物 (10 g/L ) +NaCl (5 g/L ) , pH
712。转化用培养基为 M1～M5。
M1 (共培养基 ) : N6 + 62BA 011 mg/L + 2, 42D 410 mg/L + 100μmol/L乙酰丁香酮 (AS) + 1%
甘露醇 ;
M2 (恢复培养基 ) : N6 + 62BA 011 mg/L + 2, 42D 410 mg/L + 1%甘露醇 +头孢霉素 (Cef) 100
mg/L +羧苄青霉素 (Carb) 200 mg/L;
M3 (继代扩增筛选培养基 ) : N6 + 62BA 011 mg/L + 2, 42D 410 mg/L + 1%甘露醇 + Cef 100 mg/L
+ Carb 200 mg/L +卡那霉素 ( Kan) 200 mg/L ;
M4 (分化长芽筛选培养基 ) : MS + 62BA 210 mg/L + NAA 110 mg/L + CoCl2 510 mg/L + TDZ 015
mg/L + Cef 100 mg/L + Carb 200 mg/L + Kan 250 mg/L;
M5 (生根壮苗筛选培养基 ) : 1 /2MS +NAA 110 mg/L + IAA 015 mg/L +多效唑 210 mg/L + 011%
活性炭 + Kan 200 mg/L。
以上除 M5添加 215%蔗糖和 012% Phytagel外 , 其它均添加 3%蔗糖和 013% Phytagel, 所有的培
养基 pH均为 518。
112　抗生素对愈伤组织的预筛选
称取一定量的继代 2个月左右 , 黄色致密状的未经转化处理的高羊茅离体成熟胚诱导出的愈伤组
织 (W0 ) , 分别接种到含 Carb 100、300、500 mg/L、Cef 100、400、500 mg/L和 Kan 50、100、200、
300、400 mg/L的诱导培养基 (以上抗生素均采用过滤除菌 ) , 培养 4周 , 再称其鲜样质量 (W t ) ,
计算相对质量增长率。每处理 3次重复 , 取平均值。质量增长率 r = (W t - W0 ) /W0 , 相对质量增长
率 R = r/ ro ×100% ( ro 为不加筛选剂培养的愈伤组织质量增长率 )。
113　农杆菌的转化
农杆菌感受态细胞的制备与转化参照王关林等〔6〕的方法。选取 1～2 mm黄白色致密的愈伤组织
用作转化。将制备的根癌土壤农杆菌 LBA4404 /pCG2Ⅱ的单菌落接种到 20 mL YEP液体培养基 (含相
应抗生素 ) 上 , 28℃, 200 rpm振荡培养至对数值 , OD600约 015; 3 000 rpm离心 10 m in后取沉淀 ,
用等体积的 N6 + 2, 42D 110 mg/L + 100μmol/L AS培养基悬浮。将愈伤组织浸入菌液 20 m in, 用滤
纸吸干转移到共培养基 (M1) 上 , 25℃黑暗条件下共培养至刚有菌落出现 ; 用 011 mol/L甘露醇无
菌液振荡清洗 2～3次 , 再用氨苄青霉素 (Amp) 250 mg/L和 Cef 100 mg/L混合无菌水浸洗 2～3次 ,
每次 10 m in, 至完全清洁为止。取出愈伤组织用无菌滤纸吸干后转至恢复培养基 (M2) 上 1周 , 再
转入筛选培养基 (M3) 上筛选培养 , 每 10 d继代 1次。
114　PCR检测和分子杂交分析
转化植株叶片的总 DNA提取采用王关林等〔6〕的 SDS法加以改进 , 即在 DNA提取缓冲液中加 6%
PVP, 用以去除样品中的酚类与色素。 PCR检测反应按常规方法进行。Glu特异引物 : S1 ( 5pi2ATG
GCT GCT ATC ACA CTC CTA23pi) , S2 (5pi2CCC AAA GTT GAT ATT ATA TTT23pi) ; Chi特异引物 : S1pi
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　6期 马生健等 : 高羊茅抗真菌病基因转化的研究 　
(5pi2ATG AGG CTT TGT AAA TTC AC23pi) , S2pi (5pi2ATT TCC AAA AGA CCT CTG GT23pi)。94℃预变性 2
m in; 94℃变性 1 m in, 55℃退火 1 m in, 72℃延伸 115 m in, 30～35个循环 ; 72℃延伸 5 m in。扩增产
物用 112% 琼脂糖凝胶电泳检测。B am HⅠ酶切 pCG2Ⅱ, 分别电泳回收 Glu和 Chi基因 , 用地高辛标
记作探针。总 DNA点杂交 : 先将上述提取的总 DNA经电泳检测提取效果 , 将提取效果好的转化株总
DNA依次点在 Hybond2N +尼龙膜上。Southern blot: 先用 B am HⅠ酶切转化植株总 DNA, 电泳分离酶
切产物后将其转至 Hybond2N +尼龙膜上。上述二者的杂交按 Sambrook等〔7〕的方法 , 参照试剂盒 D IG
DNA Labeling and Detection Kit (Roche Cat. No. 1093657) 说明书进行。
115　转化植株的真菌抗性鉴定
用配制好的禾谷镰刀菌 ( F. gram inearum Schwabe) 孢悬液 (孢子浓度 2 ×104 ～4 ×104 个 /mL )
对随机挑选的转 pCG2Ⅱ高羊茅叶片进行涂布挑战接种 , 人工气候箱中培养 (光强 8 000 lx, 12 /24 h,
温度 28℃ /23℃, RH 90% )。设非转化组培苗作对照。
2　结果与分析
211　抗生素对愈伤组织的预筛选
表 1显示 , 3种抗生素均对高羊茅愈伤组织
的生长产生抑制作用 (相对质量增长率均小于
100% ) , 浓度越高 , 抑制作用越明显 , 且愈伤组
织易褐变死亡。在对愈伤组织筛选时选用 Kan
200 mg/L, 因为此浓度下愈伤组织已易变白变褐 ,
相对质量增长率也只有 30% , 完全能起到初步筛
选非转化体的作用。在选用抑制农杆菌生长的抗
生素浓度时 , 考虑到 Cef比 Carb对愈伤组织的抑
制作用更明显 , 故选用 Cef的低浓度 (100 mg/L)
和 Carb的较低浓度 (200 mg/L) 的组合 , 以期望
取得更好的抑菌效果。
表 1　不同抗生素对高羊茅愈伤组织筛选的影响
Table 1　Effects of d ifferen t k inds of an tib iotics
on ta ll fescue ca lli selection
抗生素
Antibiotic (mg/L)
愈伤组织相对质量增长率
Relative mass increase
rate of calli( % )
Kan 50 75
100 64
200 30
300 10
400 6
Cef 100 70
400 21
500 8
Carb 100 83
300 37
500 20
212　不同转化方式对农杆菌转化效果的影响
挑取黄色致密结节状高羊茅愈伤组织块 , 剥成直径 2 mm的颗粒 , 用活化的 LBA4404 /pCGⅡ进行
不同转化处理 (表 2, A～ I)。
表 2　不同农杆菌转化方式对高羊茅转化效果的影响
Table 2　Effects of cocultiva tion m ethods w ith agrobactium on ta ll fescue tran sforma tion
处理
Treatment
浸染
Infection
固体培养基
Solid
medium
滤纸
Filter
paper
液体培养
基 L iquid
medium
后浸洗
Post
solution
恢复培养时间
Time of refresh
culture (W )
污染情况
Contam ination
再生率
Regeneration
rate ( % )
绿芽率
Green shoot
rate ( % )
A - + - - - 1 - 40 0
B + + - - - 持续 Continue - 45 45
C + + + - - 持续 Continue - 60 60
D + + + - - 3 - 55 50
E + + + - - 1 - 70 3
F + + + - + 1 - 50 3
G + + + + - 1 - 30 5
H + + + + + 1 - 60 10
I + + - - + 1 + - -
　　注 : “ + ”代表有 , “ - ”代表无 , 固液培养基中均加有 100μmol /L AS。
Note: “ + ” indicates yes, “ - ” indicates no, both solid and liquid medium are containing 100μmol /L AS.
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从表 2可知 , A处理 (阴性对照 ) , 即未经转化的愈伤组织在 Kan上筛选 , 长绿芽数为 0, 这说
明 Kan作为筛选剂非常有效。B和 C比较发现 , 培养基上垫上一层滤纸有利于提高愈伤组织分化长
芽。C、D、E比较则发现 , 随着恢复时间的延长分化绿芽率依次降低 , 这说明恢复时间长对后期筛
选剂的抵抗力增强 , 导致假阳性比率的提高 , 后期分子检测困难。F、G、H比较发现 , 在共培养过
程中 , 愈伤组织周围滴加含转化菌体的液体培养基能使分化绿芽率从 5%提高到 10% , 另外培养基上
垫加滤纸也能在一定程度上抑制农杆菌的生长。后期用甘露醇和抗生素液洗涤时 , 一方面甘露醇可以
使愈伤组织处于高渗环境中使细胞脱水 , 胞质变浓 , 有利于后期生长 , 另一方面抗生素液对其有伤
害 , 不利于后期生长。 I处理虽然抗生素能在一定程度上抑制农杆菌 , 但由于清洗步骤繁琐 , 浸染后
固体培养表面也没有垫加滤纸 , 造成愈伤组织表面潮湿 , 易污染 , 因而操作时必须加倍小心。
213　转化系统的建立
采用 LBA4404 /pCG2Ⅱ对高羊茅愈伤组织进行了浸染及共培养 (M1) 转化处理后 , 在 M2上恢复
一定时间 , 然后放入含高浓度 Kan的继代扩增筛选培养基 (M3) 上筛选培养 , 经一段时间后发现非
转化对照瓶的所有愈伤组织出现轻度褐化 , 少数长出白化小芽 , 而转化瓶中大多愈伤组织状态良好 ,
少数分化出绿芽 (图版 , 1)。
两个月后更换到含更高浓度 Kan的分化长芽筛选培养基 (M4) 上 , 经一段时间后 , 发现转化瓶
中部分愈伤组织分化长出了绿芽 , 其它部分则受筛选剂的影响长出白化芽 , 而对照瓶则都为白化芽
(图版 , 2)。
绿色芽在生根壮苗培养基 (M5) 上诱导长出 1～2 cm长的根系后 , 经炼苗移栽入土壤 (图版 ,
3)。
214　转化植株的 PCR检测与分子杂交检测
采用 Glu的一对引物对随机选取的转化植株总 DNA进行 PCR扩增 , 被检测的 8个转化植株在
Lane 3～10均出现如 Lane 2阳性对照 (pCG2Ⅱ的 Glu引物 PCR产物 ) 一样的 110 kb特异性条带 (图
1, 左 )。
Glu检测成阳性的植株再采用 Chi的一对引物对其总 DNA进行 PCR扩增 , 结果被检测的 8个转
化植株在 Lane 3～10均出现如 Lane 2阳性对照 (pCG2Ⅱ的 Chi引物 PCR产物 ) 一样的 019 kb特异性
条带 (图 1, 右 )。
图 1　转化 pCG2Ⅱ高羊茅植株的 G lu基因 (左 ) 和 Ch i基因 (右 ) 的 PCR分析
M: λDNA /EcoRⅠ + H indⅢ; 1: 阴性对照 ; 2: 阳性对照 ; 3～10: 转化植株。
F ig. 1　G lu gene ( left) and Ch i gene ( r ight) PCR ana lysis of ta ll fescue tran sform ed pCG2Ⅱ
M: λDNA /EcoRⅠ + H indⅢ; 1: Negative control; 2: Positive control; 3 - 10: Transformed p lants.
采用 Glu探针的总 DNA点杂交结果如图 2。随机选取的 10株转化植株只有 1株 (B6) 成阴性 ,
其余 9株 (A3～B5) 都有如 pCG2Ⅱ阳性对照 (A1) 一样的较强杂交信号 , 阳性率为 90% , 说明 Glu
基因确实整合到了大多数转化的植株基因组中。
用 Chi探针对 Glu检测成阳性植株进行 Southern blot, 结果如图 3。5株 (Lane3～7) 都有 1条
210 kb左右的杂交带 , 与阳性对照 pCG2Ⅱ酶切产物 (Lane1) 位置相同 , 这是 Chi完整片段 (含启动
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　6期 马生健等 : 高羊茅抗真菌病基因转化的研究 　
子与终止子 ) , 说明 Chi确实整合到了转化植株的基因组。
酶切转化植株总 DNA采用的 B am HⅠ的切点位于 pCG2Ⅱ中 Chi基因两端 , 无论是 Chi单一位点
单拷贝还是多位点多拷贝插入基因组 DNA , 杂交结果阳性植株通常只可能出现 1条特异性条带。
图 2　G lu探针对转化 pCG2Ⅱ高羊茅植株的 D NA点杂交
A1: 阳性对照 ; A2: 阴性对照 ; A3～B6: 转化植株。
F ig. 2　D NA dot blot ana lysis of ta ll fescue tran sform ed
pCG2Ⅱw ith G lu probe
A1: Postive control; A2: Negative control;
A3 - B6: Transformed p lants.
图 3　Ch i探针对转化 pCG2Ⅱ高羊茅植株 Southern blot
M: λDNA /HindⅢ; 1: 阳性对照 ; 2: 阴性对照 ; 3～7: 转化植株。
F ig. 3　Southern blot ana lysis of ta ll fescue tran sform ed
pCG2Ⅱw ith Ch i probe
M: λDNA / H indⅢ; 1: Positive control; 2: Negative control;
3 - 7: Transformed p lants.
215　转化植株的抗真菌病检测
接种真菌 7 d后 , 高羊茅非转化对照植株叶片出现很明显的芝麻大小病斑 , 而且中尖部发病较严
重 , 而转化植株则表现出很好的抗性 , 未发现病斑 (图版 , 4)。
3　讨论
本研究建立了高羊茅的农杆菌转化系统。
首先 , 此系统是建立在高效组织培养与植株再生体系〔8〕基础上的 ;
第二 , 选用了烟草来源的经修饰的 Chi和 Glu的抗真菌二价体〔9〕, 它们表达的酶能出现在细胞的
间隙中 , 并具有抗真菌的协同性 , 能为最终获得的转化植株具有很好的抗真菌表型打下基础 , 所选农
杆菌菌株 LBA4404也是目前许多基因工程研究常用的 ;
第三 , 研究了高渗预处理与恢复培养对转化率的影响 , 预筛选确定了筛选剂 Kan浓度在 200～
300 mg/L是可行有效的 , 在筛选过程中使浓度先低后高再低 , 有利于愈伤组织平稳度过高压筛选期 ;
第四 , 抗菌素中 Carb和 Cef都是具有很好抑菌效果的抗生素〔10〕, 我们选用了二者的组合并用 ,
并且浓度也在预筛选试验中得到了有效的确定 ;
第五 , 确定了最佳的农杆菌共培养方式 , 农杆菌的共培养方式是影响最终转化频率的一个重要因
素。
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图版说明 : 1. 转 pCG2Ⅱ高羊茅愈伤组织在筛选培养基上初筛 (右 : 转化瓶 ; 左 : 对照瓶 ) ; 2. 分化长芽 (右 : 转化瓶 ; 左 : 对照
瓶 ) ; 3. 移栽成活的转 pCG2Ⅱ高羊茅 ; 4. 抗真菌病检测 (上 : 对照 ; 下 : 转化株 )。
Explana tion of pla tes: 1. Primary selection of tall fescue transformed pCG2Ⅱon selectable medium (R ight: Transformed flask; Left: Control ) ;
2. Shoot differentiation of tall fescue transformed pCG2Ⅱon differentiation medium ( R ight: Transformed flask; Left: Control) ; 3. Tall fescue
transformed pCG2Ⅱ grown in soil; 4. Fungi resistance analysis (Above: Control; Below: Transgenic p lants) .
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