全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (11) : 1581 - 1586
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 08 - 12; 修回日期 : 2008 - 10 - 13
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370999) ; 福建省自然科学基金项目 (C0410013)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: weichen909@1631com)
章希娟现工作单位为福建省农业科学院果树研究所。
龙眼胚胎 F3H基因的 cDNA克隆及序列分析
章希娟 1, 3 , 许鸿川 1, 2 , 游向荣 1, 2 , 李　燕 1, 2 , 陈清西 1, 3 , 陈　伟 1, 23
(1 福建农林大学蛋白质组学研究中心 , 福州 350002; 2 福建农林大学生命科学学院 , 福州 350002; 3 福建农林大学园
艺学院 , 福州 350002)
摘 　要 : 采用 IEF /SDS2PAGE双向电泳技术 , 对 ‘立冬本 ’龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分
离 , 通过 MALD I2TOF /TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮 - 3 -羟化酶 ( flavanone 32hydroxy2
lase, F3H)。以 ‘立冬本 ’龙眼胚胎 cDNA 为模板 , 采用 RT2PCR和 RACE技术 , 获得 F3H基因 cDNA
1 404 bp全长序列。序列分析表明 , F3H基因共编码 365个氨基酸 , 其 cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等
F3H基因的同源性均高达 80%以上 , 该基因在 GenBank中登录号为 EF468104。
关键词 : 龙眼 ; 胚胎 ; 黄烷酮 - 3 -羟化酶 ; 基因克隆 ; 序列分析
中图分类号 : S 66712　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1121581206
C lon ing and Sequence Ana lysis of F 3 H Gene cD NA from L ongan Em bryo
ZHANG Xi2juan1, 3 , XU Hong2chuan1, 2 , YOU Xiang2rong1, 2 , L I Yan1, 2 , CHEN Q ing2xi1, 3 , and
CHEN W ei1, 23
(1 Research Center for Proteom ics, Fujian A griculture and Forestry U niversity, Fuzhou 350002, Ch ina; 2 College of L ife Sciences,
Fujian A griculture and Forestry U niversity, Fuzhou 350002, Ch ina; 3 College of Horticu lture, Fujian A griculture and Forestry
U niversity, Fuzhou 350002, China)
Abstract: The p rotein of‘L idongben’longan zygotic embryos during different development stages were
separated and compared by IEF /SDS2PAGE technique. Flavanone 32hydroxylase was one of differential
p roteins identified by MALD I2TOF /TOF. Then F3H gene cDNA sequence was cloned from longan zygotic
embryos using RT2PCR and RACE technique. A 1 404 bp full2length cDNA sequence was obtained. Analysis
of F3H gene cDNA indicated that it encoded a pep tide containing 365 am ino acids. The nucleotide sequence
comparison with the F3H gene of C itrus sinensis, Gossypium h irsu tum and Pyrus comm uni showed that identity
was all higher than 80%. The sequence was accep ted and released by GenBank (Accession number:
EF468104).
Key words: longan; embryo; flavanone 32hydroxylase; gene cloning; sequence analysis
从分子生物学角度看 , 植物胚胎的分化发育过程是基因在机体内外因素协同作用下 , 在时间和空
间上顺序表达的过程。目前许多与胚胎发育相关的重要基因已被成功克隆分离。
L EC1 (L EA FY CO TYL EDON 1) 基因是子叶特化以及胚胎成熟所必需的。胚胎发生早期 , L EC1
是决定胚柄形成和子叶分化必须的。在胚胎发育后期 , L EC1是种子成熟中许多程序必需的 , 包括干
燥耐受性的获得和储藏物的积累 (Lotan et al. , 1998)。L EC2 (L EA FY CO TYL EDON 2) 编码一个含
B3区域 (植物特有的一种 DNA结合基序 ) 的转录调控因子 , 它控制胚发育的正确启动 , 在胚发育早
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期和后期均大量表达 ( Stone et al. , 2001)。STM (SHOO T M ER ISTEML ESS ) (Long et al. , 1996)、G
蛋白的 β - 亚基 ( Kaydamony et al. , 2000 )、 PGA6 ( Zuo et al. , 2002 )、热激蛋白基因 ( HSPS )
(Dong & Dunstan, 1996) 等和胚胎发育相关基因也已被分离克隆。龙眼的果核 (种子 ) 大小与胚胎
发育状况直接相关 , 胚胎早期或中途败育是小 (细 ) 核果形成的原因 (吕柳新 等 , 1985)。
在龙眼生产上 , 果核大是影响品质的一个重要因素 , 因此 , 培育胚胎中途败育的焦 (小 ) 核优
良品种 , 在生产上有重要价值。荔枝已有许多大面积种植的焦 (小 ) 核生产品种 , 而在龙眼中缺乏
具有焦核性状的生产品种 , 且传统的育种方法难以转移焦核性状 , 因此开展龙眼胚胎蛋白质组和基因
克隆的研究具有重要理论和生产意义。
‘立冬本 ’是福建晚熟良种 , 果大 , 果核发育正常 , 适合作为本研究的试材。本研究通过对 ‘立
冬本 ’胚胎不同发育时期蛋白质的分离 , 并克隆胚胎发育相关的差异蛋白基因 , 分析其功能与胚胎
发育的关系 , 从分子水平上揭示龙眼胚胎发育与分化的本质 , 为最终实现胚胎发育的基因调控奠定基
础。
1　材料与方法
111　材料
试验于 2006—2007年进行。试材龙眼 ‘立冬本 ’采自福建省农科院果树研究所。分别选取生长
发育结果正常、树龄一致、同时开花的植株各 3株 , 于谢花后 31 d和 38 d采集正常幼果 , 剥离胚胎 ,
用液氮速冻 , - 70 ℃保存备用。
112　双向凝胶电泳
龙眼胚胎总蛋白的提取、蛋白质含量测定及双向电泳参照李燕等 (2006) 和陈伟等 (2001) 的
方法。
113　总 RNA的提取和 cD NA的克隆
采用酚 —SDS法提取龙眼胚胎总 RNA, 按 Fermentas公司 RevertA idTM First Strand cDNA Synthesis
试剂盒的方法合成 cDNA第一链 , 并以此为模板 , 进行特异性扩增。
参照已发表的柑橘、苹果、梨等 F3H基因的 cDNA序列设计两条特异性引物 P1: 5′2CAAGACTG2
GCGTGAAATAGTGAC23′, P2: 5′2CTTTGCTCATCTTCCTCCTGTAC23′用于 RT2PCR扩增。
PCR扩增条件为 : 94 ℃ 5 m in; 94 ℃ 1 m in, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 40 s, 35个循环扩增 ; 4 ℃保存。
根据 RT2PCR扩增产物的测序结果设计 3′RACE顺式引物 F3H23R: 5′2CCATTATTTGAGCAACG2
GAAGG23′和 5′RACE反式引物 F3H25R: 5′2CTGGCTTGTCGGGCCACCTTGA23′。
参照 Clontech公司的 SMARTTM RACE cDNA Amp lification试剂盒进行。3′RACE的扩增条件为 :
94 ℃ 5 m in; 94 ℃ 45 s, 58 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 m in, 35个循环扩增 ; 4 ℃保存。5′RACE的扩增条件
为 : 94 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 m in, 5个循环 ; 94 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 m in, 5个循环 ; 94 ℃ 30 s,
68 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 m in, 25个循环 ; 4 ℃保存。
PCR扩增产物经 1%琼脂糖电泳后 , 回收纯化连接到 pGEM 2T vector, 转化 , 挑取阳性克隆子 ,
PCR检测后送至 Invitrogen公司测序。测序结果利用 BLAST进行碱基序列和氨基酸序列的同源性分
析。
114　RT2PCR分析
对龙眼胚胎花后 31 d和 38 d两个时期的总 RNA进行定量 , 用 cDNA第一链合成试剂盒进行逆转
录 , 合成 cDNA第一链。在等量 RNA ( cDNA ) 的条件下 , 用引物 P1、P2通过 RT2PCR进行龙眼胚胎
F3H基因不同发育时期的表达研究。PCR扩增条件为 : 94 ℃ 5 m in; 94 ℃ 1 m in, 55 ℃ 40 s, 72 ℃
40 s, 25个循环扩增。
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2　结果与分析
211　龙眼胚胎蛋白质的双向电泳分析
采用窄范围 pH 4～7的线性 IPG干胶条分离 ‘立冬本 ’龙眼胚胎发育不同时期的蛋白质 , 结果
表明其胚胎不同发育时期的蛋白质组存在差异 , 分离到胚胎发育相关蛋白 18个。
选择谢花后 38 d胚胎一个上调表达的蛋白 (如图 1所示 ) , 通过 MALD I2TOF2TOF2MS分析和
Mascot查询 , 确定该差异蛋白为 flavanone 32hydroxylase (黄烷酮 - 3 -羟化酶 , F3H)。
图 1　龙眼胚胎发育不同时期差异蛋白 F3H差异表达图谱
A: 花后 31 d; B: 花后 38 d。
F ig. 1　D ifferen tia lly expressed prote in F3H in longan em bryo dur ing d ifferen t developm en t stages
A: 31 days after anthesis; B: 38 days after anthesis.
212　龙眼胚胎 F 3H 基因 cD NA的 RT2PCR扩增
以 cDNA第一链为模板 , 利用一对特异性引物 P1、P2进行 PCR扩增 , 获得了一个大约 600 bp的
特异产物 (图 2)。
对该片段进行回收纯化 , 经连接、转化、筛选阳性克隆、重组质粒的 PCR鉴定、测序 , 得到一
个 616 bp的 cDNA序列。
经 BLAST分析 , 此序列为 F3H cDNA的同源片段。
图 2　龙眼胚胎 F3H 基因 cD NA保守区 RT2PCR扩增结果
M: TaKaRa DL 2000 marker; 1: F3H特异片段电泳检测结果。
F ig. 2　RT2PCR am plif ied product of F3H gene con served sequence in longan em bryo
M: TaKaRa DL 2000 marker; 1: Electrophoresis of F3H gene fragment.
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213　龙眼胚胎 F 3H 基因 cD NA 3′RACE和 5′RACE扩增
根据 RT2PCR的测序结果设计 3′RACE和 5′RACE的特异性引物 , 3′RACE试验与 5′RACE试验扩
增信号很强 , 均在首轮扩增便获得了清晰的特异性条带 , 大小也与预期的相符 (图 3)。
经连接、转化、筛选阳性克隆、重组质粒 PCR性鉴定、测序 , 3′RACE试验获得一个大小为 500
bp的 cDNA片段。
该片段有 202 bp与 RT2PCR的测序结果重叠 , 出现的第一个终止密码子为 TAG, 3′端包含一个
187 bp的 UTR结构和多聚腺苷 (polyA) 尾。
5′RACE试验得到一个大小 571 bp的 cDNA片段 , 在序列的 5′端包含一个 119 bp的 UTR结构。
图 3　龙眼胚胎 F3H 基因 3′RACE和 5′RACE的 PCR扩增产物
M: TaKaRa DL 2000 marker。
F ig. 3　3′RACE PCR and 5′RACE am plif ied product of F3H gene in longan em bryo
M: TaKaRa DL 2000 marker.
214　龙眼胚胎 F 3H 基因 cD NA全长序列分析
根据 RT2PCR与 RACE试验的结果 , 将所获得的 3个 cDNA片段拼接 , 得到龙眼胚胎 F3H cDNA
的全长序列。该序列全长 1 404 bp, 已登录 GenBank, 登录号为 : EF468104 ( GI: 134039063)。
利用 DNAman软件进行分析 , 该 cDNA序列包含一个完整开放阅读框 ( 120～1 217) , 编码 365
个氨基酸 , 在 3′poly (A ) +区之前 15 bp有一 AATAAA加尾信号 , 这些都符合有效翻译的基因全长
cDNA的特征。该基因含有 119 bp的 5′非编码区和 187 bp的 3′非编码区。
经 BLAST分析 , 龙眼胚胎 F3H基因 cDNA序列与许多植物的 F3H基因具有很高的同源性。与棉
花 F3H的同源性达 84% , 与柑橘 F3H的同源性达 82% , 与草莓 F3H的相似系数达 83% , 与梨的
F3H相似系数达 79% , 与苹果 F3H的同源性达 80% , 证实本试验所得到的 cDNA确实为龙眼胚胎的
F3H cDNA。
对其氨基酸序列进行分析发现 , 龙眼 F3H的氨基酸序列与棉花 F3H同源性最高 , 达 90176% ,
与葡萄、柑橘、草莓、梨和苹果的同源性分别为 89104%、88149%、86110%、83188%和 82183%
(图 4)。
215　龙眼胚胎 F 3H 基因在不同发育时期的表达
RT2PCR分析检测结果如图 5所示 , 龙眼胚胎 F3H基因在花后 31 d和 38 d两个时期都有表达 ,
龙眼胚胎 F3H基因在花后 38 d的表达量大于花后 31 d的表达量。这一结果和 F3H蛋白的上调表达是
一致的。
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3　讨论
黄烷酮 3 -羟化酶 (F3H) 是黄酮类化合物合成途径中的一个关键酶。它催化 4, 5, 7′-黄烷酮 C3
位的羟化 , 属于依赖 2 - 酮戊二酸的双加氧酶家族。1991年 , F3H 基因的 cDNA 首次被 Martin等
(1991) 从金鱼草中克隆出来。目前在拟南芥、矮牵牛、玉米、茄子、苜蓿、葡萄、苹果、柑橘、梨、
康乃馨、翠菊、日本牵牛等植物中也都克隆到 F3H基因。许多研究表明 F3H在植物花粉发育和花粉管
伸长中起重要作用 (Matthew et al. , 1996; Nathalie et al. , 2001; 张学英 等 , 2004) , 还有报道认为黄
酮类化合物参与信号传导过程 (邓晓军 等 , 2004)。但 F3H和植物胚胎发育的关系尚未见报道。本研
究结果提示的 F3H上调表达可能与龙眼花后 31 d之后的胚胎分化发育有关 , 其花后 31 d至 38 d的胚胎
急剧增加 , 促进了胚胎黄酮类化合物的合成。推测黄酮类化合物的积累可能和龙眼胚胎的育性、胚胎分
化发育进程中的信号传导有关 , 并且可能是正常的胚胎发育所必需的。本研究的后续工作将 F3H基因转
化拟南芥 , 验证其在植物胚胎中的生物学功能 , 为分子水平上进行龙眼品质改良奠定基础。
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