全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (1) : 97～100
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 06 - 08; 修回日期 : 2004 - 07 - 16
基金项目 : 北京市自然科学基金项目 (5032006)3 通讯作者 Author for correspondence
甜樱桃 SFB 4与 SFB 4’基因的鉴别
朱　墨 1, 2 　张开春 13 　姜立杰 1 　张晓明 1
(1 北京市农林科学院林业果树研究所 , 北京 100093; 2 首都师范大学生命科学学院 , 北京 100037)
摘 　要 : 本研究以最近发现的李属花粉决定子候选基因 “S单元型特异 F2box蛋白基因 (SFB ) ”为基
础 , 根据甜樱桃 SFB 4基因设计引物 , 从自交不亲和 ‘雷尼 ’和 ‘佳红 ’以及自交亲和的 ‘斯坦拉 ’总
DNA中分别扩增出 SFB 4和 SFB 4’基因的部分序列。经测序结果发现 : SFB 4’基因比 SFB 4基因缺失了 4
个碱基 TAAA。根据这个缺失差异 , 设计了一对引物 BFP200和 BFP201, 这对引物只能扩增 SFB 4’基因 ,
而不能扩增 SFB 4基因 , 从而利用 SFB 基因区分开了甜樱桃自交不亲和的 S4和自交亲和的 S4’单元型。
关键词 : 李属 ; S单元型特异 F2box蛋白基因 (SFB ) ; 单元型
中图分类号 : S 66215　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0120097204
D istingu ish SFB 4’Gene from SFB 4 Gene of Sweet Cherry ( P runus avium )
Zhu Mo1, 2 , Zhang Kaichun13 , J iang L ijie1 , and Zhang Xiaom ing1
( 1 Institu te of Forestry and Pom ology, B eijing A cadem y of A gricultural and Forestry Sciences, B eijing 100093, Ch ina; 2 Institu te of
L ife and Science, Capita l N orm al U niversity, B eijing 100037, China)
Abstract: Correct identification of self2compatibility genotype in sweet cherry is important to the breeding.
By far, there have been no molecular methods to differentiate between self2incompatible S4 hap lotype and self2
compatible S4’hap lotype. In this report , on the basis of the sequence of the S4 hap lotype2specific F2box p ro2
tein gene (SFB 4) of sweet cherry in GenBank, a pair of p rimers were designed, by which PCR was performed
to amp lify the SFB 4 gene from total DNA of self2incompatible varieties‘Rainier’ and ‘J iahong’and the
SFB 4’gene from self2compatible variety‘Stella’. The PCR p roductswere sequenced and a difference between
SFB 4 and SFB 4’genes was found. Compared with the SFB 4 gene , there was a deletion of four nucleotides
‘TAAA’ in the SFB 4’gene. The p rimersBFP 200 and BFP 201 were designed on the ground of the difference
between the SFB 4 and SFB 4’genes, which only amp lify the SFB 4’gene. Therefore, using the p rimers BFP
200 and BFP 201, the difference between the SFB 4 and SFB 4’genes of sweet cherry was disp layed, the self2
incompatible S4 hap lotype and the self2compatible S4’hap lotype were distinguished successfully.
Key words: Prunus avium ; S hap lotype2specific F2box p rotein gene (SFB ) ; Hap lotype
1　目的、材料与方法
李属植物属于配子体自交不亲和 , 其反应的特异性由 1个高度多态的基因座控制 , 叫 S - 基因座
(S 2locus)。这是 1个多基因的复合体 , 因此用 “单元型 ” ( hap lotype) 指代基因座的变体〔1〕。人们推
测 S -基因座应至少包括两个基因 , 即雌蕊决定子基因和花粉决定子基因。李属植物雌蕊决定子基因
是 S 2RN ase基因〔2〕。最近 , 研究表明李属中的 4种植物即杏、甜樱桃、酸樱桃和梅中的 “S单元型特
异 F2box蛋白基因 ” (S hap lotype2specific F2box p rotein gene, SFB ) 可能就是花粉决定子基因〔3～5〕。
培育甜樱桃自交亲和品种是樱桃育种的重要目标 , 目前鉴定甜樱桃基因型的手段主要有授粉试验、
花柱离体培养、花柱 S糖蛋白电泳以及 S基因特异 PCR鉴定技术。其中前 3种方法必须在果树开花结实
后才能进行 , 并受到季节的限制。而 S基因特异 PCR鉴定技术一般使用 S 2RN ase基因进行鉴定〔6〕。
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
通过花粉辐射得到的甜樱桃 S4’单元型是 S4单元型的自交亲和型突变〔7〕。虽然二者的自交不亲
和反应不同 , 但截止到目前尚无法用分子方法区分 S42RN ase与 S4’2RN ase基因〔7, 8〕。人们怀疑 S4’
单元型这种花粉部分突变的突变型可能是花粉决定子基因发生了突变 , 但直到最近人们才发现配子体
自交不亲和的花粉决定子候选基因 S FB。本研究目的就是鉴别 SFB 4与 SFB 4’基因 , 从而区分 S4单
元型和 S4’单元型 , 为甜樱桃自交亲和育种提供分子标记辅助选择手段。
试材采自北京市农林科学院林业果树研究所 , 以斯坦拉 (S3S4’)、斯坦拉自交后代 (S4’S4’)、
雷尼 (S1S4)、佳红 (S4S6)、先锋 ( S1S3) 和 627 ( S3S6) 幼嫩叶片为材料 , 采用 CTAB法〔9〕提取
基因组 DNA。根据 GenBank中甜樱桃 SFB 4 (AB111521) 基因的序列 , 设计引物 BFP 180 ( 5’GA2
CATCCTAGCAAGACTACCA3’) 和 BFP 184 ( 5’CCATATTTGATGGTGGCCAAG 3’)。用引物 BFP
180 /BFP 184扩增试材总 DNA, 并将 PCR扩增产物进行测序 , 分别从 PCR产物的两端各测序 1次
(北京鼎国生物技术公司进行 )。根据 SFB 4和 SFB 4’的测序结果 , 设计 1对引物 BFP 200 ( 5’TA2
ATGAGAAGGATAAAAG3’) 和 BFP 201 (5’TTATATTGCTCTCCAG 3’)。用以对斯坦拉、斯坦拉自
交后代、雷尼、佳红、先锋和 627总 DNA进行扩增。
引物 BFP 180 /BFP 184的 PCR反应体系为 15μL体积 : 10 mmol/L Tris2HCl (pH 813) , 50 mmol/
L KCl, 012 mmol/L dNTPs, 2 mmol/L MgCl2 , 115 U Pfu DNA聚合酶 , 01167μmol/L引物 , 约 20 ng
DNA。反应程序 : 94℃ 3 m in; 94℃ 45 s, 64℃ 1 m in, 72℃ 1 m in, 35个循环 ; 72℃延伸 10 m in。
引物 BFP 200 /201的 PCR反应体系为 15μL体积 : 10 mmol/L Tris2HCl ( pH 813) , 50 mmol/L
KCl, 012 mmol/L dNTPs, 115 mmol/L MgCl2 , 115 U Taq DNA聚合酶 , 01167μmol/L引物 , 约 20 ng
DNA。反应程序为 : 94℃ 3 m in; 94℃ 45 s, 52℃ 1 m in, 72℃ 1 m in, 35个循环 ; 72℃延伸 10 m in。
PCR产物在 2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
2　结果与分析
211　SFB 4与 SFB 4’基因的 PCR扩增与序列分析
引物 BFP 180 /BFP 184对斯坦拉、雷尼、佳红、
先锋和 627总 DNA的扩增结果表明 : 只在有 S4’或
S4单元型的斯坦拉、雷尼、佳红中有扩增 , 而在无
S4’或 S4单元型的先锋和 627中无扩增 ; 在斯坦拉、
雷尼、佳红中只扩增一条带 , 且带的大小相同 , 都
介于 947 bp和 1375 bp之间 , 比较接近 947 bp的位
置。根据引物 BFP 180 /BFP 184 与甜樱桃 SFB 4
(AB111521) 的同源性 , 计算出扩增的片段大小应为
1028 bp。与实际扩增相符合 (图 1)。
将上述斯坦拉、雷尼、佳红的 PCR产物直接
测序。斯坦拉共测序 3次 , 雷尼和佳红各测序 2
次。使用 B last程序分别将斯坦拉、雷尼、佳红的
测序结果与 GenBank中的基因进行比较 , 结果发
图 1　引物 BFP 180 /BFP 184对甜樱桃总 D NA的扩增结果
M. Marker; 1. 斯坦拉 ; 2. 雷尼 ; 3. 佳红 ; 4. 先锋 ; 5. 627。
F ig. 1　PCR wa s perform ed w ith the pr im ers BFP 180 and
BFP 184 to am plify the SFB 4’gene and the SFB 4
gene from tota l D NA of sweet cherry
M. Marker; 1. Stella; 2. Rainier; 3. J iahong; 4. Van; 5. 627.
现斯坦拉、雷尼和佳红中的扩增片断与甜樱桃 S FB 基因的同源性最高。与甜樱桃的 S FB 基因相比较 ,
斯坦拉与 SFB 4 (AB111521) 的平均同源性为 98% , 与 SFB 3 (AB096857) 的平均同源性为 85% ; 雷
尼与 SFB 4 (AB111521) 和 SFB 1 (AB111518) 的平均同源性分别为 9715%和 88% ; 佳红与 S FB 4
(AB111521) 和 SFB 6 (AB096858) 的平均同源性则分别为 96167%和 86133%。这证明引物 BFP
180 /BFP 184在斯坦拉总 DNA中扩增的片断是 SFB 4’, 而不是 SFB 3; 在雷尼总 DNA中所扩增的片断
为 SFB 4, 而不是 S FB 1; 在佳红总 DNA中所扩增的片断为 SFB 4, 而不是 S FB 6。
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　1期 朱 　墨等 : 甜樱桃 SFB 4与 SFB 4’基因的鉴别 　
比较测序结果发现 , 斯坦拉中的 SFB 4’基因比雷尼、佳红的 SFB 4 和 Gen Bank中的 S FB 4
(AB111521) 缺少了 4个碱基 “TAAA” (图 2)。
图 2　比较引物 BFP 180 /BFP 184扩增产物测序后的结果
F ig. 2　The sequences am plif ied by the pr im ers BFP 180 /BFP 184
212　SFB 4’基因的特异 PCR扩增
根据测序结果 , 设计了引物对 BFP 200 /BFP
201, 引物 BFP 200是 SFB 4’基因的特异引物 ,
也不包括 TAAA这四个碱基 (图 2) , 而引物 BFP
201为 SFB 4和 SFB 4’基因的共有序列。因此从
理论上讲 , BFP 200 /BFP 201 应只扩增 SFB 4’,
不扩增 SFB 4 及其它 SFB 基因。根据引物 BFP
200 /BFP 201与本次研究所测斯坦拉 SFB 4’序列
的同源性 , 计算出应扩增片段的大小为 453 bp。
从图 3中可看出 BFP 200 /BFP 201只扩增斯坦拉
和斯坦拉自交后代总 DNA中的 SFB 4’基因 , 而
不扩增雷尼和佳红总 DNA中的 SFB 4基因 , 也不
扩增先锋和 627总 DNA中的其它 SFB 基因。而且
BFP 200 /BFP 201在斯坦拉及斯坦拉自交后代中
只扩增 1条带 , 大小介于 501 bp与 404 bp之间 ,
这与预期的 453 bp相符合。
图 3　引物 BFP 200 /BFP 201对甜樱桃总 D NA的扩增结果
M. Marker; 1, 2. 斯坦拉 ; 3. 斯坦拉自交后代 ; 4. 雷尼 ;
5. 佳红 ; 6. 先锋 , 7. 627。
F ig. 3　PCR wa s perform ed w ith pr im ers BFP 200 and BFP 201
to am plify the SFB 4’gene from the tota l D NA of sweet cherry
M. Marker; 1, 2. Stella; 3. the p rogeny of Stella; 4. Rainier;
5. J iahong; 6. Van; 7. 627.
　　以先锋和 627作为对照是由于存在雷尼、佳红和斯坦拉中的 S1, S6和 S3单元型 , 当 B FP 200 /B FP 201
不扩增先锋和 627中的 3种单元型时 , 就排除了 B FP 200 /B FP 201在斯坦拉、雷尼和佳红总 DNA中扩增这
3种单元型的可能性。当 B FP 200 /B FP 201只在斯坦拉及斯坦拉自交后代总 DNA中有扩增时 , 则扩增出的
这条带应该是 SFB 4’基因 , 而不是 SFB 3基因。而且引物 B FP 180 /B FP 184和 B FP 200 /B FP 201扩增所使
用的 DNA模板相同 , 雷尼、佳红的总 DNA可被引物 B FP 180 /B FP 184扩增 , 但不能被引物 B FP 200 /B FP
201扩增; 而引物 B FP 180 /B FP 184和 B FP 200 /B FP 201在斯坦拉总 DNA中都能扩增 , 这说明是由于
SFB 4’基因缺失了 TAAA这 4个碱基的缘故 , 使得引物 B FP 200 /B FP 201不能扩增 SFB 4基因。以上结果
证明 B FP 200 /B FP 201在斯坦拉及斯坦拉后代中所扩增的带是预期的条带。因此 , 利用引物 B FP 200 /B FP
201区别开自交不亲和的 S4单元型和自交亲和的 S4’单元型。
本研究以花粉决定子基因 SFB 为基础鉴别开了 S4和 S4’单元型 , 这样可以在育种中进行早期分
子标记辅助选择 , 鉴定出具 S4’单元型的自交亲和后代 , 从而大大减少育种的工作量和时间。
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收稿日期 : 2004 - 05 - 04; 修回日期 : 2004 - 11 - 04
基金项目 : 国家 “十五”科技攻关重大专项课题 (2004BA516A09)
辣椒对莴苣的化感作用及其成分分析
程智慧 　耿广东 　张素勤 　孟焕文　 (西北农林科技大学园艺学院 , 杨凌 712100)
A llelopa thy to L ettuce and Rela ted Chem ica ls of Hot Pepper
Cheng Zhihui, Geng Guangdong, Zhang Suqin, and Meng Huanwen ( College of Horticu lture, N orthw est Sci2Tech
U niversity of A gricu lture and Forestry, Yang ling 712100, China)
关键词 : 辣椒 ; 化感作用 ; 化学物质 ; 莴苣
中图分类号 : S 63612; S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0120100201
将粉碎好的线辣椒 (8819) 植株 20 g加 500 mL蒸馏水在常温下浸提 48 h, 此液为 0104 g/mL水浸液 , 过滤后配
成 0101、0102、0103、0104 g/mL的浓度 , 用于莴苣发芽和生长试验 , 4次重复 , 测定发芽率、发芽指数、地上部长
和根长 , 分析水浸液对莴苣的化感作用。
将 40 g粉碎的线辣椒植株加 1000 mL蒸馏水浸提 48 h, 过滤并经 3000 r/min离心 , 上清液转移到长 40 cm、直径 2 cm的
XAD24吸附树脂柱上 , 分别用乙醚、50%乙醚 +50%乙酸乙酯、乙酸乙酯、50%乙酸乙酯 + 50%甲醇、甲醇、蒸馏水各 200
mL洗脱 (各洗脱液依次简称为 L1, L2, L3, L4, L5, L6) , 收集洗脱液并减压浓缩至干 , 再用 8 mL甲醇溶解 , 检测各部分的
生物活性 , 利用综合隶属函数值推断水浸液各组分的化感作用。综合隶属函数值越大 , 表明化感作用越小。
取化感作用强的组分 (L1) , 转移到 XAD24吸附树脂柱上 , 使甲醇自然挥发 , 然后分别用 60%乙醚 + 40%乙酸乙
酯、40%乙醚 + 60%乙酸乙酯和 20%乙醚 + 80%乙酸乙酯各 200 mL洗脱 (各洗脱液依次简称为 L121, L122, L123) ,
再按上述方法浓缩至干 , 并再溶解 , 检测其生物活性和化感作用。对活性较强的组分用 GC2MS测定化感物质。
结果表明 , 辣椒植株水浸液对莴苣的化感作用表现为高抑低促的浓度双重效应 , 并且对根部生长的抑制作用大于
地上部。辣椒植株水浸液浓度为 0、0101、0102、0103和 0104 g/mL, 莴苣地上部长依次为 1518、1717、1616、1512
和 1311 cm, 根长依次为 3414、2819、1612、1118和 710 cm; 莴苣发芽率和发芽势也表现相同的趋势。
用辣椒植株水浸液各有机溶剂的洗脱组分进行莴苣发芽试验 , 根据莴苣发芽率、发芽指数、地上部长和根长进行
分析 , 计算各指标的隶属函数值和综合隶属函数值 , 从而确定化感作用的大小。各组分的综合隶属函数值大小顺序为
L6 > CK >L5 >L2 >L3 >L4 >L1, 其综合隶属函数值依次为 01867、01860、01721、01655、01542、01461和 01041, 因
此认为化感作用最强的组分为 L1, 最弱的为 L6。
用辣椒植株水浸液的 L1组分分离的 L121、L122和 L123组分进行莴苣发芽试验 , 根据 3个组分的发芽率、发芽指
数、地上部长和根长的统计结果 , 计算其综合隶属函数值依次为 0、01506和 01755, 以 L121的最小。由此认为辣椒
植株水浸液的 L1组分各分离成分对莴苣化感作用最强的为 L121组分。
对 L121组分进行气相色谱 -质谱联仪 ( GC2MS) 分析 , 根据标准样品图谱认定辣椒化感作用中起主要作用的化
学物质有 : 邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二丁酯、苯萘胺、4, 4 - 二叔丁基苯酚、叶绿醇、二苯胺、2, 3 - 丁二醇、丁
酸、2 -叔丁基苯酚、戊二酸二丁酯、2, 4 -二叔丁基苯酚。
本试验是通过辣椒植株水浸液获得的化学物质 , 如要鉴定这些物质中哪种是化感物质 , 必须把这些物质与根系分
泌的化学物质综合起来分析、比较 , 最后可确定辣椒的主要化感物质。
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