全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 75 - 80
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 07 - 06; 修回日期 : 2006 - 11 - 21
基金项目 : 重庆市自然科学基金项目 (8573) ; 重庆市教育委员会科学技术研究项目 ( KJ060313)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: L ianggl@ swau1cq1cn)
45S rDNA在不同倍性沙田柚染色体上的荧光原位
杂交分析
向素琼 1, 2 , 汪卫星 1 , 梁国鲁 13
(1 西南大学园艺园林学院 , 重庆 400716; 2 中国农业科学院柑橘研究所 , 重庆 400712)
摘 　要 : 应用荧光原位杂交技术进行 45S rDNA在不同倍性沙田柚中期染色体上的定位研究。结果表
明 : 不同材料的 NOR位点表现出明显的多态性和杂合性 , 即二倍体具 4个 45S rDNA位点 , 四倍体单株 t1
和 t2 则分别具有 10个和 8个位点。位点在染色体上的位置包括短臂末端、着丝粒区域、着丝粒至短臂区
域、着丝粒至长臂区域、长臂末端共 5种不同类型。不同材料中包含的位置类型不完全相同。不同位置类
型的位点数也不相同 , 以着丝粒及着丝粒至短臂区域的类型位点数最多 , 其次是短臂末端。同源四倍体和
相应的二倍体相比 , 出现了 DNA水平的变异。对用于荧光原位杂交的柑橘染色体制片方法和 rDNA在染色
体上的分布位置、同源四倍体和相应二倍体的遗传差异分析、重复序列的染色体原位杂交用于染色体识别
和物种演化研究等进行了讨论。
关键词 : 沙田柚 ; 染色体 ; 倍性 ; 荧光原位杂交 ( F ISH)
中图分类号 : S 666　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120075206
Chrom osom e L oca liza tion of 45S rD NA in D ifferen t Plo idy C itrus grandis by
Fluorescence in situ Hybr id iza tion
X IANG Su2qiong1, 2 , WANG W ei2xing1 , and L IANG Guo2lu13
(1 Horticu lture and Landscape College, Sou thw est U niversity, Chongqing 400716, China; 2 C itrus R esearch Institu te, Chinese
A cadem y of A gricultural Sciences, Chongqing 400712, China)
Abstract: Chromosome localization of 45S rDNA was studied by means of fluorescence in situ hybridiza2
tion ( F ISH) on metaphase chromosomes of different p loidy C itrus grand is. NOR loci of different materials
showed obvious polymorphism and heterozygosity. There were four 45S rDNA loci in dip loid, while there were
ten loci in tetrap loid t1 and eight loci in tetrap loid t2. Chromosomal location of rDNA loci included five types,
i1e. the telomeric region of the short arm, centromere to the short arm region, the centromeric region, centro2
mere to the long arm region, the telomeric region of the long arm. D ifferent materials had incomp lete same
rDNA loci types. The number of loci was not the same in different situations, the most were types of centro2
mere to short arm region and centromeric region, next was the telomeric region of the short arm. There was a
variation in DNA among the homologous tetrap loids with the corresponding dip loid. Meanwhile, the citrus
chromosome slides used for F ISH and rDNA loci situation on chromosome, genetic variation analysis among the
homologous tetrap loids and dip loids, repeated sequence of chromosome in situ hybridization (C ISH) for chro2
mosome identification and species evolvement were discussed.
Key words: C itrus grand is; Chromosome; Ploidy; Fluorescence in situ hybridization ( F ISH)
沙田柚 (C itrus grand is O sbeck. ‘Shatianyou’) 是我国柚类中的名优品种 , 但由于其种子多 , 影
响了在国内外市场上的竞争力。国内许多学者开展了无核沙田柚培育研究 , 但由于产量与品质等原
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因 , 至今仍未见大面积无核沙田柚商业化生产。鉴于此 , 作者通过秋水仙碱离体诱导获得多个沙田柚
同源四倍体单株 (向素琼 等 , 2004) , 这些四倍体新种质的获得为今后培育三倍体无核品种提供了
亲本材料 , 而了解这些材料的遗传背景和遗传差异就显得极为重要。
近年来 , 在植物多倍体基因组的起源和多倍化的分子和遗传学效应等方面进行了较多探讨 (杨
继 , 2001) , 但目前主要是针对自然形成的多倍体的进化动态进行研究 , 对人工加倍后获得的柑橘同
源四倍体遗传变异方面研究主要集中在形态学变异和细胞水平变异 , 分子水平的研究则少有报道。高
等植物中 , 核糖体是合成蛋白质的场所 , 构成核糖体的主要成分是 rRNA和蛋白质的复合物。编码
rRNA的基因有两种 , 即 45S rDNA 和 5S rDNA。而荧光原位杂交 ( fluorescence in situ hybridization,
F ISH) 技术是确定 rDNA在基因组中分布的一种有效方法 , 目前 rDNA己被成功定位到许多动植物染
色体上。
应用荧光原位杂交技术 , 分析 45S rDNA在沙田柚二倍体和四倍体染色体上的位点数和分布位置
等特点 , 比较诱导获得的同源四倍体单株间及它们与二倍体品种在遗传成分上的差异 , 是本研究的一
个主要目的。同时 , 该研究有利于对重复序列在基因组中的分布以及与染色体进化关系的进一步理
解 , 对染色体识别也有帮助 , 并且其荧光原位杂交技术流程的建立也可为柑橘基因的物理定位提供技
术基础。
1　材料与方法
111　材料来源与染色体制备
二倍体沙田柚 (2n = 2x = 18) 为栽培品种长寿沙田柚 , 来自国家果树种质重庆柑橘圃。四倍体植
株 (2n = 4x = 36) 为作者对二倍体长寿沙田柚进行秋水仙碱诱导获得的不同株系。本试验取其中两
个单株 ( t1 与 t2 ) 为试材。
取茎尖或嫩叶分生组织 , 采用去壁低渗火焰干燥法制片 (陈瑞阳等 , 1979) , 其中省去前低渗步
骤。5% Giem sa染液染色 5～10 m in, 冲洗晾干 , 镜检后储存于 - 20℃备用。
rDNA 片段来自番茄 (L ycopersicon pennellii‘LA716’) , 长 911 kb, 包含 18S - 518S - 28S编码区
和非转录间隔序列 (即 45S rDNA )。含有 45S rDNA基因的质粒由南开大学陈瑞阳教授惠赠 , 采用随
机引物法 , 用 D IG (D ig2H igh Prime, Roche) 标记作为探针。
112　荧光原位杂交流程
将制备好的染色体标本于 60℃烘箱中干燥 6 h。用 100μg/mL的 RNase A 37℃消化 1 h, 2 ×SSC
漂去盖片 , 2 ×SSC洗涤 3次 , 每次 5 m in, 70%、90%、100%乙醇依次脱水 , 每级 3 m in; 0101%
Pep sin 37℃处理 10 m in, 1 ×PBS洗涤 2次 , 每次 5 m in; 1%甲醛 (50 mmol/L MgCl2 , 1 ×PBS配制 )
于室温下固定 5 m in, 2 ×SSC漂洗 3次 , 每次 5 m in。
染色体标本于 70%去离子甲酰胺 (2 ×SSC稀释 ) 68℃变性 2 m in, 立即通过预冷的梯度乙醇脱水
(70%、90%、100% ) , 用于杂交。每张制片 20μL杂交液 , 其中含 50%去离子甲酰胺、10%硫酸葡聚
糖、2 ×SSC、2 ng/μL探针、011% SDS、015μg ssDNA。涡流混匀 , 在 PCR仪上 97℃变性 10 m in后立
即于冰浴中放置 10 m in; 将杂交液加于染色体标本上 , 加盖玻片 , 密封 , 37℃水浴杂交 10～14 h。
2 ×SSC漂去盖片 , 011% SDS (2 ×SSC配制 ) 42℃漂洗 3次 , 每次 5 m in, 011% SDS (012 ×SSC
配制 ) 42℃漂洗 3次 , 每次 5 m in, 2 ×SSC室温下冲洗 2次 ; 加 100μL /片封阻试剂 , 加盖片 , 37℃
封阻 30 m in; 去封阻液、加 200 ng anti2D IG2F ITC 37℃温育 1 h; 1 ×PBS/Tween 20 (012% ) 37℃漂洗
3次 , 每次 5 m in, P I衬染 10 m in; 1 ×PBS/Tween 20 (012% ) 漂洗 3次 , 每次 5 m in, 去衬染剂 , 加
抗荧光衰减剂 (Vectashied) , 封片。O lympus BX60荧光显微镜观察杂交信号 , Spot Cooled CCD装置
捕获图像 , 利用 Spot和 Photoshop软件进行图像处理。
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　1期 向素琼等 : 45S rDNA在不同倍性沙田柚染色体上的荧光原位杂交分析 　
2　结果与分析
211　不同倍性沙田柚 45S rD NA的染色体原位杂交
不同倍性长寿沙田柚中期染色体与 45S rDNA 的荧光原位杂交结果如图 1。3个材料的 NOR位点
表现出明显的多态性和杂合性 , 即二倍体具 4个位点 , 四倍体单株 t1 和 t2 分别具有 10个和 8个 45S
rDNA位点 , 说明在不同倍性沙田柚中随倍性增加 , rDNA 位点数有增加之趋势。3个材料中均未见单
条染色体上具多个 45S rDNA位点的现象 , 45S rDNA位点在染色体上的位置包括短臂末端、着丝粒区
域、着丝粒至短臂区域、着丝粒至长臂区域、长臂末端 5种不同类型。不同材料中包含的位点位置类
型不完全相同 , 不同位置类型的位点数也不相同 ; 以着丝粒及着丝粒至短臂区域的类型最多 , 其次是
短臂末端。不同位置信号的强度、大小和相同位置信号的强度、大小都不同 , 这不仅表现在不同倍性
间 , 也表现在诱导获得的不同四倍体单株间 , 这种杂合性差异可能是拷贝数和基因的扩增、缺失及同
源和非同源染色体的不等交换等原因所致 (A rnheim et al. , 1980)。
图 1　45S rD NA在不同倍性沙田柚中期染色体上的荧光原位杂交结果
A. 二倍体 ; B. 四倍体单株 t1 ; C. 四倍体单株 t2 ; 箭头所示为杂交信号 , 标尺为 10μm。
F ig. 1　F ISH w ith 45S rD NA on m etapha se chrom osom es of d ifferen t plo idy C itrus grandis
A. D ip loid; B. Tetrap loid ( t1 ) ; C. Tetrap loid ( t2 ) ; A rrows indicate hybridization signals, bar indicates 10μm.
212　沙田柚染色体 P I衬染适宜浓度
在染色体原位杂交中 , 真正的杂交信号是由特异杂交的探针产生 , 简称为信号 , 背景信号是由探
针或检测试剂非特异结合产生 , 简称为噪音 , 二者的比值称为信噪比。杂交过程中最重要的就是采取
措施使杂交信号强度增至最大 , 而把背景信号强度减至最小 , 只有这样才能得出关于序列同源性有意
义的结论。
本试验发现 , 染色体衬染浓度是否适宜直接关系到杂交的信噪比。试验中共采取了 7种 P I浓度 :
011、1、2、4、6、8、10μg/mL。结果表明 , 浓度过高会影响杂交信号的观测与真实杂交效果的拍
摄 , 当达到 10μg/mL时 , 荧光镜下本应为绿色的信号被覆盖成粉红色 , 形成严重的背景噪音 ; 浓度
过低时染色体形态不够清晰 , 亮度不够 , 也影响观察 , 经多次试验认为以 1～2μg /mL P I衬染为宜。
3　讨论
311　柑橘原位杂交染色体制片
获得染色体形态清晰、干净的制片是观察研究柑橘染色体原位杂交的关键 , 适宜的染色体分散程
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
度和背景干净是杂交得以充分进行和增大信噪比的重要基础。一般来说 , 凡是正在进行细胞分裂的分
生组织都可以作为染色体制片的材料。幼嫩根尖是很好的材料 , 但由于柑橘中存在单胚材料 , 其根不
一定能代表原材料的固有特性 , 也不能采收其种子发根制片 , 同时部分无核种也无法收获种子 , 故地
上部茎尖或幼叶是较好的材料。柑橘染色体小 , 压片时不易分散 , 且会有浓厚的细胞质包裹染色体 ,
影响探针杂交渗入或杂交后背景太浓影响信号的准确观察。而去壁低渗火焰干燥法是利用酶去除细胞
壁 , 再利用表面张力涂片使染色体分散铺展在载玻片上 , 染色体无细胞质和细胞壁的覆盖。柑橘嫩叶
表面无绒毛 , 取茎尖和未展开嫩叶并切成适当大小 , 利用去壁低渗 —火焰干燥法制片 , 可获得分散适
度、清晰干净的染色体标本 , 适于染色体原位杂交。
312　45S rD NA在染色体上的位置分布
45S rDNA为高度串接重复序列 , 在基因组中有 1对或几对染色体具此位点 , 由它构成的核仁组
织区 (Nucleolar O rganizer Region, NOR) 在形态上一般表现为染色体的次缢痕 , 与随体相连。因此 ,
rRNA基因一般位于染色体的次缢痕上 , 但多种植物 rDNA的物理定位发现该基因除了在次缢痕及随
体位置外 , 在其它染色体上还有数目不等的位点分布 , 其起源尚不清楚 ( Taketa et al. , 1999)。荧光
原位杂交也揭示出许多特例 , 如 Zhang和 Sang (1999) 对芍药属 ( Peon ia) 研究表明 , rRNA基因位
于染色体的端部 , 并且存在易位现象 , 同源染色体之一具两个在不同染色体臂的位点 , 而另一个没有
位点。Tagashira和 Kondo (2001) 的研究表明 , rRNA基因不仅存在于染色体的短臂上 , 有更多的存
在于着丝粒区。本试验中也是以着丝粒及着丝粒至短臂区域的类型为最多。在柑橘上 , 有不少学者
(Matsuyama et al. , 1996; Stace et al. , 1993; Roose et al. , 1998; Pedrosa et al. , 2000; Carvalho et al. ,
2005) 对甜橙 ( C. sinensis)、枳 ( Poncirus)、枳橙 ( C. sinensis ×Poncirus)、来檬 ( C. auran tifo2
lia)、柠檬 (C. lim on)、枸橼 (C. m ed ica) 的 rDNA进行了染色体定位 , 所报道的位置与数目也不
尽相同。而对于柚 (C. g rand is) 及在分类学上占重要地位的红河大翼橙 ( C. hongheensis)、宜昌橙
(C. ichangensis) 和宽皮柑橘 (C. reticu la ta) 等未见报道。一般来说 , 45S rDNA位于长臂的情况较
为少见 , 但本研究中出现了位于长臂末端和着丝粒至长臂区域的情况。Carvalho等 ( 2005) 对 45S
rDNA和 5S rDNA在柠檬、来檬、枸橼染色体上的定位研究也发现有位于长臂中部和末端的情况。
L im等 (2001) 认为 , rDNA位点在染色体上的位置特点可能与其功能有关 , 是某种分子或物理上的
制约作用使染色体臂可以与核仁相联。本文中沙田柚二倍体的 45S rDNA位点数与梁国鲁等 (1990,
1994) 报道的柚的随体数目一致 , 但其位置并不位于随体染色体上。由于柑橘染色体小 , 并且其核
型未标准化 , 现在还难以准确确定位点具体在第几号染色体上。目前 , 利用染色体原位杂交技术在木
本植物 , 尤其是果树染色体上进行研究的报道不是很多 , 仅有桃 ( Yamamoto et al. , 1999)、苹果
( Schuster et al. , 1997) 以及香蕉 (Dolezelova et al. , 1998; DpiHont, 2005) 等的 rDNA染色体原位杂交
分析有报道。
313　同源四倍体和相应二倍体的遗传差异分析
对人工诱导的同源多倍体在 DNA水平上的遗传变异 , 曾有人在桑树、西瓜、水稻、金鱼草等植
物上作过研究。焦锋等 (2001) 利用 RAPD分析发现桑二倍体和四倍体在 DNA水平上没有明显差
异 ; 张有做等 (1998) 同样应用 RAPD分析却发现有不同的差异片段存在 ; 王卓伟等 (2002) 利用
AFLP分子标记技术对二倍体桑与经秋水仙素诱变得到的同源四倍体桑的多态性及遗传距离进行了分
析 , 发现遗传差异不仅存在于二倍体及其同源四倍体材料间 , 在四倍体材料个体间也存在差异 , 认为
秋水仙素对染色体结构或 DNA分子结构产生较大的影响。刘文革等 (2004) 对不同倍性的西瓜进行
AFLP分析时发现 , 同源四倍体和相应的二倍体相比有特异性片段的消失和增加 , 推测可能发生了基
因组 DNA的核苷酸碱基序列改变 , 形成可与引物杂交的新位点 , 或是同源四倍体的等位基因发生了
漂移 , 从而表现出基因组 DNA多态性。赵卫国等 (2005) 应用 ISSR对桑树 6份二倍体品种和经秋水
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　1期 向素琼等 : 45S rDNA在不同倍性沙田柚染色体上的荧光原位杂交分析 　
仙碱诱变得到的同源四倍体的分析表明 , 经秋水仙碱虞变后产生的遗传差异较大。栾丽等 ( 2004)
在利用 SSR对其选育的同源四倍体水稻和相应的二倍体进行分析时也发现 , 二者在少数引物扩增产
物中出现差异 , 对应四倍体扩增片段大于惑小于二倍体的片段 , 认为可能是加倍过程中四倍体其拷贝
数在该位点发生重复、插入、缺失等突变 , 或者是在自交回交时发生不等交换饵形成差异。吴梗川等
(2005) 运用 RAPD研究表明四倍体金鱼草在诱导过程中除了染色体数目加倍外 , 基因组 DNA的核
苷酸碱基喧列也可能改变。本研究结果也表明 , 诱导惑得的沙田柚同源四倍体较对应的二倍体 , 其
45S rDNA位点不仅是简单的数目随倍性增加而增加 , 四倍体单株 t2 有 10个位点 , 比简单加倍 8个位
点 (如 t1 ) 多出了 2个 , 同时位点的位置与拷贝数在不同倍性间及四倍体不同单株间均存在差异 , 也
表明在诱变后出现了 DNA水平的变异。这些均说明在利用诱变剂进行加倍获得的同源四倍体中 , 除
有简单的染色体组加倍外 , 也存在发生了 DNA水平变异的类型 , 可为培育植物新品种提供丰富的育
种资源。
314　重复序列的染色体原位杂交用于染色体识别和物种形成与分化研究
利用 DNA重复序列探针的原位杂交是识别染色体的一项有效技术。而在柑橘属植物上 , 由于染
色体小 , 其核型一直未标准化 , 即使是荧光带也仍然不能区分出每对染色体 ( Guerra, 1993; Carvalho
et al. , 2005)。因此 , 今后可以考虑利用重复序列在染色体上的位置作为标记来识别染色体 , 对柑橘
属染色体有一个标准的排序。
rDNA为高度串接重复序列 , 其编码区的保守性和非编码区的多态性是研究动植物系统发育与进化
的一个有用标记。 rDNA在染色体上分布的数目和具体定位可作为标记来识别染色体以及分析多倍体物
种的进化过程 (J iang & Gill, 1994) , 同时 rDNA在染色体上的定位可以对传统核型的分析进行校正 , 尤
其对于染色体较小且形态特征不明显的材料 , 可以提高同源染色体配对的准确性。因此在柑橘上 , 利用
重复序列的染色体原位杂交并结合基因组原位杂交可以进行基因组的比较分析和物种演化研究。
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