全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(9)：1373—1376
Aeta Horticulturae Sinica
． ． — —
东亚对开蕨离体快繁的研究
顾德峰 ，李东升。，王 蕾 ，齐广勋 ，赵和祥 ，董 然
( 吉林农业大学园艺学院，长春 1301 18； 德惠市农业开发总公司，吉林德惠 130300)
摘 要：利用东亚对开蕨 (Phylitisjaponica Kom．)孢子叶为外植体，进行了组培快繁的研究。结果表
明：不同接种方式、不同的培养方法对东亚对开蕨孢子萌发和原叶体生长均有明显影响，破碎孢子囊后的
孢子以及液体培养中的孢子萌发较快；原叶体在无植物生长调节剂的 Ms培养基中以5倍的速率增殖；喷
施0．1％ KH，PO 溶液的试管外培养更适于原叶体向孢子体植株的转化。
关键词：东亚对开蕨；孢子；原叶体；孢子体；离体快繁
中图分类号：S 682．35 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)09—1373-04
Studies on in Vitro Propagation of Endangered Plant P mtis japonia
GU De．feng ，LI Dong．sheng ，WANG Lei ，QI Guang．xun ，ZHAO He．xiang ，and DONG Ran
( College ofHorticulture，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China； Dehui Agricultural Development Corpora—
tion，Dehui，Jilin 130300，China)
Abstract：The sporophylary leaves of _y2litis japonica were used as explants to study the process of tis—
sue culture rapid reproduction．The results showed that different inoculation types and culture methods signifi-
candy affected the spores germination and prothallus growth of Phyllitis japonica．The spores which sporangia
were broken and cultured in liquid culture media germinated quickly．The prothallus propagated in MS culture
medium without the plant growth hormone at a speed rate of 5 times．Pot culture of spraying 0．1％ KH2 PO4
upon prothallus is more suitable to translated from prothallus to spore．
Key words：Phylitis japonica；spore；prothalus；sporophyte；rapid reproduction in vitro
东亚对开蕨 (Phfllitisjaponica Kom．)别名日本对开蕨、对开蕨，属于铁角蕨科 (Aspleniaceae)
对开蕨属 ( litis)，中国仅一属一种。东亚对开蕨分布范围十分狭窄，主要分布在中国长白山区、
日本及朝鲜北部，自然贮量极少，是世界稀有物种，中国二级珍稀濒危保护植物 (柏广新 等，
2003)。东亚对开蕨既具有观赏价值，又具有药用价值 (金洙哲 等，1996)。有关东亚对开蕨的研究
甚少 (谷安根和汪矛，1989；刘保东和时述武，1991；刘保东 等，1991，1996；宗占江 等，1997)，
组织培养离体快繁的研究至今未见报道。为保护濒危植物，进而开发利用，对东亚对开蕨进行了组织
培养的研究，探索出一套东亚对开蕨离体快繁组培技术。
1 材料与方法
材料来自吉林省白山市林区。取东亚对开蕨含有成熟孢子囊的孢子叶，在实验室中将孢子叶切成
1 cm大小，无菌条件下0．1％HgC1 溶液灭菌5 min，无菌水冲洗6次，滤纸吸干后接种。
接种分三种方式：一是孢子叶直接接种；二是在超净工作台解剖镜下将孢子叶中的孢子囊剥离出
后接种；三是解剖镜下将剥出的孢子囊放在经灭菌后 2 cm×2 cm大小的滤纸上，用手术刀小心压碎
收稿日期：2008—05—07；修回日期：2008—08—11
基金项目：吉林省科技厅青年基金项目 (20000556-2)；吉林省科技厅重大项目 (200504163)
E—mail：gu．df@ 163．corn
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园 艺 学 报 35卷
孢子囊，散出其内的孢子，连同小滤纸片一同接种。
孢子培养：采用 1／2MS+蔗糖20 g的固体培养和液体培养两种方法。
培养条件：100～200 lx散射光下，光照 12 h·d～。白天温度25～26 cC，夜晚20～22℃。
原叶体增殖：将孢子萌发后形成的原叶体团分切成约0．5 cm大小的小块，每小块约含原n-t~5～
lO片，分别接种到含有不同浓度植物生长调节剂的 MS培养基中 (表 1)，每瓶接种 8～10块。对原
叶体的增殖倍数采用新复极差测验进行差异显著性检验。
孢子体诱导：分试管内和试管外两种方法。试管内诱导方法及培养条件同原叶体增殖。试管外诱
导的方法是将培养60 d后约0．5～0．6 cm大小的原叶体分成 10片左右的小块，出瓶移栽至以草炭为
基质的花盆中，每盆20块。盆上覆盖塑料膜保湿，于温室内散射光下培养。30 d后喷施诱导液 (表
2)，60 d后观察孢子体形成状况。
2 结果与讨论
2．1 接种方式对孢子萌发的影响
不同接种方式对东亚对开蕨孢子萌发均有明显影响，孢子叶和孢子囊在固体培养基中 100 d左
右，孢子开始萌发，120 d时肉眼可见 (图版，1、5)，而破碎孢子囊后的孢子经50～60 d的培养即
达肉眼可见状态，而且萌发后的长势也明显好于前两种 (图版，2)。可见，东亚对开蕨离体培养中
去除孢子囊壳的孢子更利于其萌发。
2．2 固体培养与液体培养孢子萌发和原叶体生长
将孢子叶中的孢子囊剥离出后分别进行液体和固体培养。结果发现液体培养基中的孢子经 30 d
培养后开始萌发，约40 d出现明显可见的原叶体，其大小可达0．3～0．5 cm (图版，3)。原叶体再经
30 d培养后，可形成大量的原叶体团，大小达 1．5～2．0 cm (图版，4)。而此时固体培养的孢子才刚
处于萌发状态 (图版，5)。液体培养中的孢子萌发和原叶体生长速度明显快于固体培养。这说明液
体培养较固体培养更适合东亚对开蕨孢子萌发和原叶体的生长。
2．3 原叶体的继代与增殖
将孢子萌发后形成的原叶体团分别接种到含有不同浓度植物生长调节剂的MS培养基中，60 d后
观察原叶体增殖及生长情况 (表 1，图版，6、7)。
表1 不同培养基中东亚对开蕨原叶体的增殖状况
Table 1 The multiplication state of the prothalus of PhyUitis japonica in diferent culture medium
注：表中数据为5O瓶平均值。
Note：The result is the average of the 50 bottles
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9 期 顾德峰等 ： 东亚 对开蕨离体快繁 的研 究
从表 1 可知 ， 原叶体在供试 的几 种培养基 中均能以约 5 倍速率增殖 。 新复极差测验表明 ， 各培养
基 中的原 叶体增殖率无 显 著差 异 。 但是 ， 原叶体的生 长状 态却明显 不 同 ， 在无植物生 长调节剂和 K T
为 0． 2 m g ? L
一 的培养基 中 ， 原 叶体总 体状 态 表现 为生 长平 展 ， 较 宽大 。 随着生 长调 节 剂 浓度 的升
高 ， 原 叶体总体状 态表现 为狭窄 、 叶片不展 开 、 密实 ， 且 生长状态不佳 ， 这 一 类原叶体很难用于进 一
步增殖 和孢子体植株的诱 导 。 由此 可 见 ， 原 叶体增 殖 应 以 无 植 物生 长 调 节 剂 或少 量 K T 的培 养基 为
好 。
2． 4 孢子 体的诱导
能否实现 由原 叶体向孢 子体的转化 ， 是 东亚 对 开蕨离体快 繁 的 一 个关键环 节 。 在试 管 内诱 导 中 ，
原叶体在含有不 同浓度生长调节剂的 M S 培养基 (表 1 ) 中经 过 260 d 的 4 次诱 导培养 ， 均无 孢子体
植株产生 。
可 见 ， 在本试验条件下 ， 孢子体植株很难在试 管 内直接产生 。 而将原 叶体出瓶移栽进 行试 管外诱
导后 ， 出现 了孢子体的转化 (表 2 ， 图版 ， 8、 9 )。
图版说 明 ： 1 ． 孢 子 叶孢 子培养 120 d生 长状 态 ； 2 ． 破碎孢 子囊后 的孢子 培养 60 d生 长状 态 ； 3 ． 液体培养 4 0 d原 叶体生 长状 态 ； 4 ．
液体培 养 70 d原 叶体生 长状 态 ； 5 ． 固体培养孢 子 120 d生 长状 况 ； 6 ． 接种时原 叶体 ； 7 ． 培养 60 d后 的原 叶体 ； 8． 栽植 120 d后 的
孢 子体状况 ； 9 ． 分株后 的孢子体植株 。
E xplan ation ofplates ： 1 ． T he grow th condition ofsporophyll— spore after 120 days ；2 ． T he grow th condition ofspore ofbroken sporan gia after 60
days ； 3 ． Th e grow thcondition ofprothallus culturedin liquid m edium after 4 0 days ；4 ． T he grow thcondition 0 fprothallus cuhuredin liquidm edium
after 70 days ； 5 ． T he grow th condition ofsporangiospore cultured in solid m edium after 120 days ； 6 ． T he prothallus in inoculaling；7 ． T he prothal—
lus cultivated after 60 days ； 8． T he sporophyte after planted 120 days ： 9 ． T he sporophyte after ofshooted．
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从表2的结果可以看出，不同诱导液对孢子体的诱导率均有着明显的影响。在供试的几种诱导液
中，以0．1％ KH：PO 的效果最为显著，诱导率可高达42％。不同的诱导液为何产生如此大差异的诱导
效果，还有待于进一步研究。
表2 东亚对开蕨孢子体的试管外诱导状况
Table 2 The induction condition of the Phylitis japonica sporophte out of test tlIbe
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