全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：1053—1058
Acta Horticuhurae Sinica
应用基因芯片检测中国野生葡萄抗白粉病基因表达
张军科，桑春果 ，王跃进一 ，张朝红，史江莉，粟 霞，罗世杏
(西北农林科技大学园艺学院，农业部西北园艺植物种质资源与遗传改良重点开放实验室，陕西杨凌 712100)
摘 要：研究了利用 Aflymetrix的欧洲葡萄基因表达芯片检测中国野生葡萄基因表达的可行性，并检
测了葡萄白粉病菌 (Uncinular necator)人工接种诱导48 h后的基因表达情况。结果表明：该芯片可以在感
病材料中检测出表达的基因11 906个，抗病材料中检测到表达的基因 11 839个，在二者中同时检出表达的
基因 11 839个，能够检出的基因数占该芯片基因探针组总数的71．3％，因此用欧洲葡萄基因芯片检测中国
野生葡萄中基因表达水平是可行的；利用此芯片检测出在人工接种诱导后 ，抗病材料中和感病材料相比表
达上调的基因共 1 920个，占检测出基因总数的 l6．2l％；表达下调的基因数 1 760个，占检测出基因总数
的 14．87％；表达上调和下调的幅度 (signal log ratio)都在 1—7倍之间。
关键词：葡萄；基因芯片；抗病基因；基因表达
中图分类号：S 663．1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2008)07—1053-06
Expression of Powdery M ildew Resistant Genes of Chinese W ild Vitis by
M icroarray Analysis
ZHANG Jun-ke，SANG Chun-guo ，WANG Yue-jin ，ZHANG Chao-hong，SHI Jiang—li，SU Xia，and
LU0 Shi-xing
(College ofHorticulture，Northwest A&F University，Key Laboratory ofNorthwest Horticultural Plant Germplasm and Genet~
Improvemem ofMin~try ofAgriculture，Yangling，Shaanxi 712100，China)
Abstract：The feasibility of using Afymetrix Vitis vinifera gene expression mieroarray to detect the gene
expression of Chinese wild grape was studied，and the gene expression after 48 h artificial inoculation with
Uncinular necator was detected．The results showed that the mieroarray can detect the expression of 1 1 906
genes in susceptible material(S)，while 1 1 839 genes in resistant individual(R)and 1 1 839 genes in both R
and S．The detected genes accounted for 71．3％ of the total 16 602 probe groups．That means Affymetrix
vinifera mieroaray can be eficiently used for gene expresion analysis of Chinese wild grapes．Compared to the
S plant， 1 920 up-regulated and 1 760 down-regulated genes were detected in R plant， accounting for
l6．2l％ and 14．87％ of total detected genes respectively，up-and down-regulated rate(signal log ratio)are
among 1 to 7．
Key words：grapevine；gene microarray；disease resistance gene；gene expression
目前世界上主要的酿酒葡萄和鲜食葡萄品种都属欧亚种 (Vitis vinifera L．)，对葡萄白粉病、霜霉
病等真菌性病害缺乏抗性。
中国葡萄属的一些野生种是世界上已知的葡萄抗病基因资源，如华东葡萄 ( pseudoreticulata)
对葡萄真菌病害有良好抗性 (贺普超 等，1991)，染色体组 (2n=38)与栽培葡萄相等 (孙马和王
收稿日期：2007—12—21；修回日期：2008—05—12
基金项目：国家转基因植物研究和产业化专项 (JY03一A一19-02)；国家自然科学基金项 目 (30571280)
与第一作者有同等贡献
}}通讯作者Author for correspondence(E—mail：wangyuejin@nwsuaf．edu．cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
l054 园 艺 学 报
跃进，2006)，通过杂交育种利用其抗病性较为容易，具有良好的潜在利用价值。
要从大量的表达基因中筛选出中国葡萄抗白粉病相关基因，应用基因芯片无疑是最好的途径。目
前世界上应用于葡萄基因表达研究的芯片主要是各个实验室的自点样芯片 (Pacey—Miler et a1．，2003；
Terier et a1．，2005；Waters et a1．，2005；Fernandez et a1．，2006)，唯一商业化生产的是 Afymetrix
(California，USA)生产的葡萄基因表达检测芯片。该芯片可检测 16 602个表达序列，其中包含了 l2
个质量控制基因，14 000个欧洲葡萄 EST序列，1 700个来源于其他葡萄种的EST序列。每个序列共
设计了匹配探针 (perfect match probe，PM)和错配探针 (mis—match proble，MM)2组各 l6个探针，
代表 1个基因 (htp：／／www．afymetrix．com／products／arays／specifc／vitis．afx)。本研究中首次探索了
欧洲葡萄表达芯片能否用于中国野生葡萄基因的表达检测，并检测了白粉菌接种诱导48 h后的叶片
中基因的表达水平。
1 材料与方法
植物材料为华东葡萄 ‘白河 一35—1’ ( pseudoreticulata‘Baihe．35．1’)；欧洲葡萄 ‘佳丽酿’
( viniferU‘Cafignane’)；及其二者杂交获得的杂交一代感病植株 S(Baihe．35．1×Cadgnane，6．12．2)
和抗病植株 R(Baihe一35—1×Carignane，6．124)。
白粉病菌接种处理采用人工压片接种法，于2006年7月 10 13上午 8：oo—l0：00进行。在田间
同一株白粉病发病葡萄植株上采集叶片，用自来水喷湿将要接种的叶片表面，然后将病叶压在待接种
的叶片上 10 S，接种后套袋保湿 48 h。在接种 48 h后采集接种叶上部节位的叶片，检测基因表达情
况。
RNA提取参考张今今等 (2003)的方法，mRNA纯化采用 QIAGEN的 Micro Kit试剂盒纯化，具
体步骤按照使用说明书，cDNA合成使用Afymetrix one．cycle cDNA Synthesis Kit，cDNA标记使用 Mfy．
metrix GeneChip IVT Labeling Kit，cDNA标记产物纯化使用 Afymetrix Genechip Sample Cleanup Module；
具体操作参照各试剂盒说明书，芯片杂交由基因公司上海分公司完成，具体杂交过程按照芯片杂交要
求完成。
芯片杂交数据采用 GeneAray TM scanner 3000扫描仪上扫描芯片获得，应用 GCOS软件进行数据
分析。数据标准化时将芯片所有探针组的信号从小到大排序，去掉最大的2％和最小的2％后，将剩
下探针组的平均信号值调整到500。
2 结果与分析
2．1 基因芯片检测的有效性分析
Afymetrix的欧洲葡萄芯片可以定量检测 16 602个基因的表达水平。本次在人工接种白粉病菌诱
导48 h后的感病材料 S中检测出表达的基因 11 906个，抗病材料 R中检测到表达的基因 11 839个，
在二者中同时检出基因11 839个，二者中同时能够检出的基因数占该芯片探针总数的71．3％，远远
高于 45％的最低有效水平，所以用 vinifera基因芯片检测中国野生葡萄中基因表达水平是完全可行
的。
2．2 接种诱导后抗病和感病材料基因表达差异比较
以感病植株 S为对照，抗病植株 R相对于对照表达水平上调 1倍以上的基因数共 1 920个，占检
测出基因总数的l6．2l％；表达下调 1倍以上的基因数共 1 760个，占检测出基因总数的14．87％；在
感抗材料上无表达差异的基因8 248个，占检测出基因总数的69．6％。同时芯片上有 4 583个基因探
针未检测到中国野生葡萄上该基因的表达，说明在中国野生葡萄中，这些基因可能在葡萄白粉菌人工
接种诱导后没有表达或者本身就不存在这些基因。
维普资讯 http://www.cqvip.com
7期 张军科等：应用基因芯片检测中国野生葡萄抗白粉病基因表达 1055
在接种诱导48 h后，抗病材料中比感病材料表达明显上调的 1 920个基因中，上调倍数 (signal
log ratio)介于0．1～1．0倍的基因 1 533个，上调 1．0～2．0倍的基因434个，上调2．0～3．0倍的基
因108个，上调3．0～4．0倍的基因38个，大于4倍的 14个，上调幅度最大的为6．8倍。
表达上调幅度最大的前30位基因见表 1。
表 1 白粉菌接种诱导后表达上调幅度最大的3o个基因
Table 1 The top 30 expression up—regulated genes after inoculation
序号 GenBank登录号 功能预测 上调倍数 功能
维普资讯 http://www.cqvip.com
1056 园 艺 学 报 35卷
从表 1中可以看出，葡萄白粉病菌接种诱导后上调幅度最大的基因主要涉及以下几类：一是葡萄
中发现的未知基因，共20个，占66．7％；二是逆境反应蛋白，包括激酶、抗逆蛋白基因、激素调控
基因，共6个，占20％；三是结构蛋白，共4个，占13．3％。
在抗病材料中比感病材料表达明显下调的 1 760个基因中，表达下调幅度 (R：S log ratio)大于 1
倍的基因1 481个，下调幅度大于 1倍小于2倍的基因322个，下调幅度大于2倍小于3倍的基因60
个，表达下调幅度大于3倍小于4倍的基因33个，表达下调幅度大于4倍的 l0个，其中下调幅度最
大的为下调6倍。
下调最明显的20个基因序列见表2。
由表2可以看出，接种诱导后，表达比对照明显下调的基因主要涉及四类：一是未知基因，共
l4个，占70％；二是结构蛋白基因，共3个，占15％；三是逆境反应基因，共2个，占10％；四是
次生代谢相关基因，共 1个，占5％。
综合表 1和表2可以看出，在病原菌诱导后，葡萄抗病植株中表达上调或者下调的基因中，未知
新基因总数34个，占上调和下调基因总数的68％，其他已知基因合计占总数的32％，说明中国野生
葡萄中抗白粉病相关基因可能主要是这些未知的新基因。克隆这些未知基因并验证其功能是下一步研
究的重要内容。
维普资讯 http://www.cqvip.com
7期 张军科等：应用基因芯片检测中国野生葡萄抗白粉病基因表达 1057
CF2O1790
2 CB974807
3 CB971438
4 CD720593
5 CA817399
6 CF5】6950
7 CA816427
8 CF514383
9 CD718658
1O CF514789
l1 CD0116o1
12 CF213419
13 CF2l1981
14 CF403395
15 CF2O962O
16 CF415732
17 CB970344
18 CD713471
19 CFD74697
20 CF207362
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列，与拟南芥推测蛋白有中等程度的相似性
vinifera transcribed sequence with moderate similarity to A．thaliana
putative protein
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列
vinifem transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列 ，与拟南芥40S核糖体蛋白高度相似
vinifem transcribed sequence with strong similarity to A．thaliana
40S ribosomal protein
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列，与拟南芥可能的黄酮醇糖苷转移酶有较弱的
相似性 vinifera transcribed sequence with weak similarity to
A．thaliana probable flavonol 3-O-glucosyltransferase
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列，与拟南芥细胞色素 P450有较弱的相似性
vinifera transcribed sequence with weak similarity to A．thaliana
cytochrome P450-like protein
欧洲葡萄转录序列，与拟南芥过敏性反应蛋白有较弱的相似性
vinifera transcribed sequence with weak similarity to A．thaliana
hypothetical protein
欧洲葡萄转录序列，与拟南芥过敏性反应蛋白有较弱的相似性
vinifera transcribed sequence with weak similarity to A．thaliana
hypothetical protein
欧洲葡萄转录序列，与拟南芥 F-box蛋白家族AtFBW2有较弱的
相似性 vinifera transcribed sequence with weak similarity to
A．thalhann F．box protein family
．
AtFBW2
欧洲葡萄转录序列，与拟南芥表达蛋白有中等程度的相似性
vinifera transcribed sequence with moderate similarity to A．thaliana
expressed protein
欧洲葡萄转录序列
vinifera transcribed sequence．not in UniGene
欧洲葡萄转录序列，与拟南芥推测的富含丝氨酸蛋白有较弱的
相似性 vinifera transcribed sequence with weak similarity to
A．tha／hana putative serine-rich protein
一 6．O
一 5．4
— 5．1
— 4．7
— 4．7
— 4．5
— 4．1
— 4．O
一 4．O
一 3．9
— 3．7
— 3．7
— 3．6
— 3．5
— 3．5
— 3．5
— 3．4
未知 Unknown
未知 Unknown
未知 Unknown
未知 Unknown
未知 Unknown
未知 Unknown
未知 Unknown
未知 Unknown
未知 Unknown
结构蛋白
Structural protein
未知 Unknown
次生代谢
Secondary metabolic
protein
未知 Unknown
结构蛋白
Structural protein
逆境反应蛋白
Stress response protein
逆境反应蛋白
Stress response protein
结构蛋白
Structural protein
一 3．4 未知 Unknown
一 3．3
— 3．3
未知 Unknown
未知 Unknown
维普资讯 http://www.cqvip.com
l058 园 艺 学 报 35卷
3 讨论
以往对于葡萄基因表达的大部分研究都采用了针对某一器官或时期的基因芯片，其探针的数量和
代表性都是有限的 (Pacey-Miler et a1．，2003；Terrier et a1．，2005；Waters et a1．，2005；Fernandez et
2006)。本研究采用的 Mfymetrix葡萄基因芯片包含了葡萄上绝大多数已知的表达序列，涉及葡
萄不同的发育阶段、不同器官和生理代谢反应，因此检测结果能够较为全面地反映葡萄中基因的表达
变化。
基因表达芯片的检测能力很大程度上取决于芯片上探针的数量、代表性和特异性 (Reymond，
2001)。根据 Jailon等 (2007)的报道，欧洲葡萄中基因总数为 30 434个，而目前葡萄基因芯片中，
包含基因探针组数最多的欧洲葡萄芯片共有探针组 16 602个，仍有大约 14 000多个基因缺乏基因检
测探针，仍有待进一步增加基因探针数量。
利用欧洲葡萄基因芯片检测中国野生葡萄基因表达也可能会存在探针特异性问题。现有研究认为
如果探针序列与检测 目标序列同源性较低，那么这一问题可以通过调整探针信号域值范围来解决
(Wang et a1．，2002)，但是如果中国野生葡萄存在特有基因，那么该芯片将无法检测到这些基因。在
芯片中增加中国野生葡萄特有的基因探针或者使用自点样芯片可以克服这一问题。
本研究首次证实了使用欧洲葡萄基因芯片检测中国野生葡萄基因表达的可行性。
References
Fernandez L，Torregrosa L，Terrier N，Sreekantan L，Grimplet J，Davies C，Thomas R M，Romieu C，Ageorges A．2006．Identification of genes
associated with flesh morphogenesis during grapevine fruit development．Plant Mol Bio1．123：221—225．
He Pu—chao，Wang Yue-jin．Wang Guo—ying．Ren Zhi—bang，He Chun—cheng．1991．The studies on the disease resistance ofwild grape species O—
riginated in China．Scientia A cuhura Sinica，24 (3)：50—56．(in Chinese)
贺普超，王跃进，王国英，任治邦，和纯成．1991．中国葡萄属野生种抗病性的研究．中国农业科学，24(3)：50—56．
Jaillon O，Aury J M，Noel B，Policriti A．Clepet C．Casagrande A，Choisne N．2007．The grapevine genome sequence suggests ancestral
hexaploidization il major an~osperm phyla．Nature．449：463—467．
Pacey—Miller T，Scott K，Ablett E，Tingey S，Ching A．Henry R．2003．Genes associated with the end of dormancy in grapes．Funct Integr Ge —
nomics．3： 144 —152．
Reymond．2001．DNA microarray and plant defence．Plant Physiol Biochem．39：313—321．
Sun Ma，Wang Yue-jin．2006．Study on the chmmo~me ploidy of Chinese wild Vitis species．Acta Agricuhurae Boreali—Occidentalis Sinica，15
(6)：148—152．(in Chinese)
孙 马，王跃进．2006．中国野生葡萄染色体倍性研究．西北农业学报，15(6)：148—152．
Terrier N，Glissant D，Grimplet J，Barrieu F，AbbM P，Couture C，Ag~rges A，Atanassova R，L6【)n C，Renaudin J P．Drdaldrchamp F，
Romieu C，Delmt S，Hamdi S．2005．Isogene specifc oligo arays reveal muhifaceted changes in gene expression during grape bery(Vitis
vinifera L．)development．Planta．222：832—847．
Wang J，Jan D，Hans C A．Erlan d S，OlaM．2002．Clustering ofthe SOM easily reveals distinct gene expression patterns：Results of a reanalysis
of lymphoma study．BMC Bioinform atics．3：36—44．
Waters E L D，Hohon A T，Ablett M E．Lee S L，Henry J R．2005．cDNA micmanay analysis of developing grape(Vitis vinifera cv．Shiraz)
berry skin．Funct lntegr Genomics．5：4O一58．
Zhang Jin-jin，Wang Yue-jin，Wang Xi—ping．Yang Ke—qiang，Yang Jin—xiao．2003．Studies on total RNA extraction of grapevine．Journal of Fruit
Science，20 (3)：178—181．(in Chinese)
张今今，王跃进，王西平，杨克强，杨进孝．2003．葡萄总RNA提取方法的研究．果树学报，20(3)：178—181．
维普资讯 http://www.cqvip.com