全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 130～133
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 08; 修回日期 : 2005 - 08 - 17
基金项目 : 国家转基因专项资助项目 ( YJ042B202) ; 湖南农业大学引进人才基金项目 (03YJ09)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: dengzn@hunau1net)
分子检测部分的试验在湖南农业大学细胞工程重点实验室完成。
转 rol基因枳橙分子鉴定及部分生物学的观测
胡春华 1 　邓子牛 13 　A. Gentile2 　徐　艳 1 　熊兴耀 1
(1 湖南农业大学园艺园林学院 , 长沙 410128; 2University of Catania, Catania 95123, 意大利 )
摘 　要 : 对转 rol基因枳橙 B、D、E 3个系及对照田间高接植株进行了 PCR分子鉴定、RT2PCR转基因
表达分析和生物学特征的观测。PCR分析表明 rolA、 rolB、 rolC已成功转入到 3个转化枳橙系中。利用 RT2
PCR在田间转化植株中只检测到 nptⅡ和 rolC基因的表达 , 而 rolA、 rolB基因未检测到。3个转化系枳橙均
表现出顶端优势减弱 , 侧枝增多 , 植株矮化性状明显 , 高度只有对照植株的 44% ～50% , 节间长度缩短 ,
叶面积减少 ; 光合作用增强 ; 内源赤霉素、生长素、玉米素等促进类激素在中部、下部叶片含量均高于对
照 , 这可能是诱导上述形态特征的变化的因素之一。
关键词 : 转基因 ; 枳橙 ; rol基因 ; RT2PCR; 形态特征 ; Pn; 内源激素
中图分类号 : S 666　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120130204
M olecular Ana lysis, M orpholog ica l and Physiolog ica l Eva lua tion of the
Tran sgen ic C itrange Plan tsW ith rolA, ro lB, ro lC Genes
Hu Chunhua1 , Deng Ziniu13 , Gentile A lessandra2 , Xu Yan1 , and Xiong Xingyao1
( 1 Horticu lture and L andscape College, Hunan A gricultural U niversity, Changsha 410128; 2U niversity of Catan ia, Ca tania
95123, Ita ly)
Abstract: Molecular identification, physiology evaluation and morphological observation of the rolA ,
rolB and rolC transgenic citrange clones (B , D, E) were conducted. PCR analysis indicated that the rolA ,
rolB , rolC genes were integrated into the citrange genome. The exp ression of the transgenes nptⅡ and rolC
was detected by using RT2PCR; while the transgenes rolA and rolB did not show any RT2PCR p roduct, and it
was not clear for the factors related to their exp ression. In comparison with the control p lants, the rol transgen2
ic p lant showed evident dwarfing characteristics, such as only half of the control in p lant height, shorter inter2
nodal length, weaker ap ical dom inance with more lateral branches, smaller leaf area, and higher net photosyn2
thesis rate. H igher contents of the endogenous GA3 , IAA and zeatin were found in the m iddle and basal parts
of the transgenic shoots than the control, this could be one of the factors responsible for the above described
morphological modifications.
Key words: Transgenic; Citrange; rol gene; RT2PCR; Morphology; Pn; Endogenous hormone
1　目的、材料与方法
枳橙 〔C itus sinensis (L. ) O sb. ×Poncirus trifolia te (L. ) Raf. 〕是枳与甜橙的杂种 , 是世界各生
产国广泛应用的砧木 , 生长势强。据报道 , 转 rol基因植物矮化性状突出。Gentile等〔1〕获得了 5个转
rolA、 rolB、 rolC组合基因系 , 其中 B、D、E系在温室内的盆栽苗表现出明显的矮化特征。本试验对
其转 rol基因枳橙 B、D、E系的田间高接植株进行分子鉴定、基因表达分析和田间形态及生理特性的
观测 , 以未经转化的通过相同再生体系获得的枳橙植株为对照。2003年所有转基因系和对照同时高
　1期 胡春华等 : 转 rol基因枳橙分子鉴定及部分生物学特征的观测　
接于湖南农业大学果树教学基地 10年生枳砧温州蜜柑尾张树上。以进一步了解其分子基础 , 转基因
的表达、生长、生理特点 , 为砧木试验提供翔实参数。
改良 CTAB法〔2〕提取叶片 DNA, 以携带 rolA、 rolB、 rolC基因的质粒 DNA为阳性对照 , 分别用各基
因的专一引物进行 PCR分析。Trizol试剂盒提取总 RNA。B iosciences公司 Reandy2to2Go RT2PCR Beads试
剂盒进行 RT2PCR反应。反转录反应程序为 42℃ 25 m in, 随后用基因专一引物进行 PCR反应。以失活
反转录酶反应为阴性对照 , 排除 DNA干扰。同时以携带 rolA、 rolB、 rolC基因的质粒 DNA为阳性对照。
将转基因系及对照各分为 3组 , 3次重复 , 每组 3～5个枝条 , 从 2004年 4月 8日 ～8月 6日 ,
每半月测定 1次株高。8月 6日记录各组枝条的节间长度、分枝数量和叶面积 , 其中叶面积采用剪纸
称量法〔3〕测定三出复叶的 3个小叶的总叶面积。最后数据取 3组平均值。采用美国 L I2COR公司生产
的 L i26400光合测定系统测定光合速率 ( Pn)、气孔导度 ( Gs)、胞间 CO2 浓度 ( Ci) 和蒸腾速率
( Tr) 等指标。每个转基因系和对照各选 5根枝条 , 取春梢从上往下数第 3～4片完整功能叶片测定 ,
每一处理测定 5片叶 , 取平均值。在生长季节各选取 5根嫁接在同一尾张树上生长一致的转基因和对
照枝条 , 分别在枝的上、中、下部取叶样 , 采用岛津 LC29A 型高效液相色谱系统测定吲哚乙酸
( IAA)、赤霉素 ( GA3 )、玉米素 ( Zit) 和脱落酸 (ABA ) 的含量。
2　结果与分析
211　转基因植株的分子鉴定
对 B、D、E 3个转化系分别用 rolA、 rolB、 rolC和 nptⅡ基因的特异性引物进行了 PCR检测 , 结
果显示各转化系都扩增出特异条带 , 与阳性对照一致 , 而阴性对照没有扩增出相应的条带 (图 1) ,
表明外源基因 rolA、 rolB、 rolC已经整合到枳橙基因组中 , 并在高接子代中稳定传递下来。
图 1　转 ro lA、 ro lB、 rolC、nptⅡ枳橙 PCR分析
M: 100 bp DNA分子量标记 ; CK + : 阳性对照 ; B、D、E: 转化株系 ; CK - : 未转化植株对照。
F ig. 1　PCR ana lysis of tran sgen ic c itrange plan ts w ith ro lA, ro lB, ro lC, nptⅡ pr im ers
M: 100 bp DNA marker; CK + : Plasm id DNA; B, D, E: Transgenic citrange clones; CK - : Non2transformed p lants.
212　ro l基因在枳橙基因组中的表达
应用 RT2PCR分析转化系 B、D、E和对照田间苗 , 只有 nptⅡ和 rolC基因有扩增片段 , 并且与质
粒 DNA的 PCR扩增片段相符 , 而 rolA和 rolB基因均未获得相应的 RT2PCR产物。当反转录酶失活
后 , 均无相应的 RT2PCR扩增片段 , 排除了 DNA的干扰。对照植株没有任何反应产物 (图 2)。以上
初步结果表明 nptⅡ和 rolC能在枳橙基因组中正常表达 , 而 rolA和 rolB基因虽然已转入枳橙基因组 ,
但在本研究的条件下未检测到表达信息。这可能与 rol转入基因的组分和是否出现基因沉默有关。
213　转 ro l基因枳橙的形态特征和生长习性
嫁接芽在 2004年 3月中、下旬萌发 , 转化系与对照芽萌发时间相差无几 , 对照植株在 5～6月间
出现 1个生长高峰 , 整个生长季生长呈 “S”型曲线。转基因植株 3个系植株在整个生长季长势缓
慢 , 生长曲线类似 , 几乎成一平缓的直线。7月下旬之后 , 高温干旱 , 植株基本停止生长。
B、D、E转化植株平均枝条长度分别是对照植株的 50%、46%、44% (图 3) , 节间平均长分别
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园　　艺　　学　　报 33卷
只有对照枳橙节间长度 3102 cm 的 41%、38%、
38% , 同时单枝平均节数增多 , 这与单转 rolC基
因节数减少的报道〔4, 5 〕不一致。对照叶具翼叶 ,
而转化叶几乎没有翼叶。转化植株叶柄长约为对
照的 1 /3, 叶面积减少 , 以三出复叶面积计算 ,
转化系 B、D、E叶面积仅为对照的 31% ～32%
左右 , 3个转基因系之间叶面积无显著差异 (表
1, 图 3)。转化植株单芽平均萌发新梢 212个 ,
每根枝条至少具有 1个分枝 , 最多的有 8个分枝
(D系 ) , 顶端优势减弱 , 而对照嫁接芽每芽主干
枝条没有分枝 , 表现出很强的顶端优势。
表 1　转基因植株主要形态特征指标的观测
Table 1　M orpholog ica l observa tion of the tran sgen ic plan ts
株系
Samp le
单枝平均节数
Number of
nodes
植株高度
Plant height
( cm)
节间长
Internode
length ( cm)
叶面积
Leaf area
( cm2 )
对照 Control 72B 22312A 311A 3915A
B 93A 11514B 113B 1213B
D 91A 10216B 112B 1310B
E 81A 9816B 112B 1310B
　　注 :邓肯氏新复极差测验法检验 ,α = 0101。
Note: Duncanpis new multip le range test, 1% level.
214　转基因植株光合特性的变化
测定结果表明 , 转基因植株具有较高的 Pn,
同时叶片 Gs、Ci、Tr等指标都比对照高 (表 2)。
说明转化植株的光合作用的适宜温度范围比对照
广 , 更能适应高温的环境。
215　内源激素
转 rol基因枳橙内源激素发生了很大变化
(图 4)。GA3 含量在转化植株中、下部较顶部高 ,
对照则相反。转化 D、E系各部分叶片 GA3 含量
下部 , 较顶部高很多。B系中部较顶端和下部低 ,
但下部含量仍高于顶端。GA3 在转化植株茎下部
含量相对高 , 有利于腋芽的萌发和侧枝的生长 ,
植株表现出分枝增多、矮化。对照植株 GA3 上部
和中部较高 , 有利于植株的顶端生长。转 rol基因
可能的矮化机理如果单从 GA3 在植株中的梯度含
量看 , 下部的高浓度 GA3 有利于植株矮化。生长
素在顶端和下部的含量 D、E系植株与对照近似 , 但前两者中部含量比对照中部高 2倍多。B系顶端和
中部生长素含量较对照植株同一部位都要低。有报道〔6〕, 单转 rolB基因能提高转基因植株内源生长素含
量 , 这与本试验 D、E系转基因植株一致 , 但 B系植株相反。Zit含量 3个转化系均高于对照 , 特别是 D
和 E中部叶片含量较对照高出 5倍以上。转 rol基因枳橙矮化原因之一很可能是 rol基因提高了植株
体内 Zit含量。据报道〔7〕, rolC基因具有类似细胞分裂素的生理效应 , 可能会提高体内活性态细胞分
裂素水平。ABA含量 B与对照差不多 , D , E中部叶片含量较对照高 , 上部和下部叶片较对照低 , 没
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　1期 胡春华等 : 转 rol基因枳橙分子鉴定及部分生物学特征的观测　
有明显的变化规律。内源激素含量的改变 , 实际上可能是各个 rol基因分别表达产生的综合结果。
表 2　光合特性测定结果
Table 2　The effect of tran splan ts and w ild plan ts on photosyn thetic character
温度
Tleaf (℃)
光强 PAPi
(μmol·m - 2 ·s - 1 )
样品
Samp le
净光合速率 Pn
(μmol·m - 2 ·s - 1 )
气孔导度 Gs
(mmol·m - 2 ·s - 1 )
胞间 CO2 浓度 Ci
(μmol·mol - 1 )
蒸腾速率 Tr
(mmol·m - 2 ·s - 1 )
28 1 000 对照 Control 12103 0106975 621666 1137
B 11141 0107655 981401 1147
D 12152 0107583 731812 1151
E 13117 0109447 1101725 1183
35 1 000 对照 Control 11155 0108336 1101100 2138
B 12152 0110266 1371142 2181
D 13116 0111833 1331001 2198
E 15112 0112433 1341666 3117
35 500 对照 Control 9148 0108860 1641501 2145
B 9117 0111847 2101750 3105
D 10153 0110176 1681333 2164
E 9182 0110565 1831333 2176
图 4　不同部位叶片的内源植物激素
F ig. 4　Ana lysis of four endogenous horm one of leaves in d ifferen t position
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