全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1263～1267
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 01 - 04; 修回日期 : 2006 - 05 - 19
基金项目 : 浙江省自然科学基金资助项目 ( Y504220)
云锦杜鹃自然居群遗传多样性的 ISSR分析
金则新 1 　李钧敏 1 　顾奇萍 1, 2
(1 台州学院生态研究所 , 浙江临海 317000; 2 西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室 , 重庆 400715)
摘 　要 : 利用 ISSR技术对浙江省境内的 5个云锦杜鹃自然居群的遗传多样性进行分析。12个引物共
检测到 170个位点 , 其中多态位点 150个 , 多态位点百分率 P ( % ) 为 88124%。物种水平的 Shannon信息
指数 ( I) 为 014317, N ei指数 ( h) 为 012848, 表明物种水平的遗传多样性很高 ; 而居群水平的遗传多样
性较低 , P%平均为 48123% , I平均为 012682, h平均为 011818。AMOVA分子差异分析显示 40103%的变
异存在于居群间 , 59197%的变异存在于居群内 , 居群间的遗传分化明显。居群间的基因流较低 , 为
018824。居群隔离、自交衰退可能是导致云锦杜鹃居群间遗传分化的主要原因。5个居群间的平均遗传距
离为 011755。聚类显示 , 括苍山居群和天台山居群组成一组 , 凤阳山居群和百山祖居群组成另一组 , 干坑
居群单独成一组。
关键词 : 云锦杜鹃 ; 自然居群 ; 遗传多样性 ; 遗传分化 ; ISSR
中图分类号 : S 685121　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621263206
Genetic D iversity in the Na tura l Popula tion s of R hododendron fortune i
Revea led by ISSR M olecular M arkers
J in Zexin1 , L i Junm in1 , and Gu Q ip ing1, 2
(1 Ecology Institu te of Taizhou U niversity, L inhai, Zhejiang 317000, Ch ina; 2 Key L abora tory of the Three Gorges Reservoir
R egionpis Eco2environm ent, M inistry of Education, Southw est U niversity, Chongqing 400715, Ch ina)
Abstract: Genetic diversity in the five natural populations of R hododendron fortunei in Zhejiang p rovince
of China were analyzed using inter simp le sequence repeat ( ISSR ) molecular markers. A total of 170 loci,
150 of which were polymorphic ones, were detected in natural populations of R hododendron fortunei using 12
ISSR p rimers. Total percentage of polymorphic loci ( P , % ) was 88124% in the species, while Shannonpis in2
formation index ( I) and N eipis gene diversity ( h ) were 014317 and 012848, respectively. These indicated
that the genetic diversity of R hododendron fortunei was relatively high. In the contrary, the genetic diversity at
population level of R hododend ron fortunei was relatively low. The mean value of P% , I and h were 48123% ,
012682 and 011818, respectively. Analysis of molecular variance (AMOVA ) demonstrated that the among2
population component accounted for 40103% of the total variations, while the within2population component ac2
counts for 59197%. The genetic differentiation was relatively high and the gene flow was low ( 018824 ).
These results suggested that population isolation and inbreeding regression may p lay the main roles in the ge2
netic differentiation among R hododend ron fortunei populations. The pair2wise mean genetic distance among
populations was 011755. The clustering analysis showed that KCS population and TTS population were in one
group, FYS population and BSZ population in another group, and GK population separated from all the other
populations in the dendrogram.
Key words: Rhododendron fortunei; Natural population; Genetic diversity; Genetic differentiation; ISSR
云锦杜鹃 (R hododendron fortunei) 为杜鹃花科 ( Ericaceae) 常绿灌木或小乔木 , 花大如碗 , 花冠
粉红色 , 具有很高的观赏价值。其分布于长江流域各省区 , 生长于海拔 400～1 900 m的沟谷阔叶林或
山顶灌草丛〔1〕。目前有关云锦杜鹃的研究较少 , 仅在群落学〔2〕、繁殖生物学〔3, 4〕、光合生理生态〔5〕和
次生代谢产物〔6〕等少数方面进行了研究 , 而有关云锦杜鹃遗传多样性的研究未见报道。物种的遗传
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
多样性既是维持其繁殖活力和适应环境变化的基础 , 也是其它一切多样性的基础和最重要的部分〔7〕,
而居群的遗传多样性水平在相当程度上制约其对环境的适应能力 , 从而可预测这个居群的发展趋
势〔8〕。本研究利用简单重复序列区间 ( Inter simp le sequence repeat, ISSR) 分子标记技术〔9〕对浙江省
境内的 5个云锦杜鹃自然居群的遗传多样性进行研究 , 从分子水平阐明其遗传多样性水平和遗传结
构 , 为有效保护和合理利用云锦杜鹃遗传资源提供科学依据。
1　材料与方法
试验材料采自浙江省境内 (表 1) , 各居群均随机选取 20株成年植株 , 相邻植株间距大于 30 m。
采植株的幼嫩叶片置于保鲜袋中 , 封口 , 用样品贮藏箱 (由超低温冰袋保持冷藏条件 ) 带回实验室 ,
- 70℃低温冰箱保存 , 供 DNA提取。
表 1　云锦杜鹃居群分布地的基本情况
Table 1　 Informa tion on the sam pling sites of Rhododendron fortunei popula tion s
居群 Population 产地 Locality 地理位置 Geographical location 海拔高度 A ltitude (m)
括苍山 Kuocangshan ( KCS) 临海市 L inhai City 28°49′N, 120°55′E 960
天台山 Tiantaishan ( TTS) 天台县 Tiantai County 29°15′N, 121°06′E 930
凤阳山 Fengyangshan ( FYS) 龙泉市 Longquan City 27°53′N, 119°10′E 1 440
百山祖 Baishanzu (BSZ) 庆元县 Q ingyuan County 27°46′N, 119°06′E 1 500
干坑 Gankeng( GK) 临安市颊口镇 Xiakou Town, L inpian City 30°08′N, 119°01′E 980
采用改进的 SDS法〔10〕提取基因组总 DNA。 ISSR引物是根据加拿大哥伦比亚大学 (University of
B ritish Columbia, Set No. 9, No. 8012900) 公布的序列 , 由上海生工生物工程公司合成。扩增反应在美国
Thermo公司的 P ×2热循环仪中进行。经优化的云锦杜鹃最适的 ISSR扩增反应条件为 : 10μL PCR反应
体积 , 1 ×Taq酶配套缓冲液 (10 mmol/L Tris·HCl, pH 910, 50 mmol/L KCl, 011% Triton X2100) ,
115 mmol/L MgCl2 , 0145 U Taq酶 (上海华美公司 ) , 16 ng模板 DNA, 12 pmol引物 (上海 Sangon公
司 ) ; dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 0115 mmol/L。同时设立阴性对照 , 以双蒸水代替总 DNA。经优化
的 PCR扩增程序为 : 94℃预变性 5 m in, 94℃变性 30 s, 5619℃退火 45 s, 72℃延伸 115 m in, 共 35个循
环 ; 72℃完全延伸 5 m in。扩增产物在 116%的琼脂糖凝胶 (含 015μg/mL溴化乙锭 ) 中电泳 , 电泳缓
冲液为 015 ×TBE, 用 GIS凝胶成像分析系统 (上海天能科技服务公司 ) 拍照保存。
用λDNA / EcoRⅠ + H ind Ⅲ标准分子量参照物 (上海华美公司 ) 做分子量标记 , 对照反应产物在
凝胶上的对应位置 , 有带记为 “1”, 无带记为 “0”, 得到 ISSR分析的原始数据矩阵。采用 POP2
GEN32软件〔11〕计算多态位点百分率 P ( % )、Shannon信息指数 ( I) 和 N ei指数 ( h) 用来估算基因
多样性。采用 DCFA 111软件〔12〕计算欧氏距离平方和 , 建立遗传距离矩阵 , 并利用 W INAMOVA 115
软件〔13〕进行分子方差分析。根据居群间的遗传距离 , 采用算术平均数的非加权成组配对法 (Un2
weighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA ) 对各居群进行聚类分析。
2　结果与分析
211　引物筛选及 ISSR扩增
从 100个引物中筛选出在 5个云锦杜鹃居群
中均可扩增出清晰条带 , 且条带不弥散 , 不模糊 ,
重复性好 , 同时阴性对照中无带的 12个引物作为
正式的 ISSR扩增引物 (表 2)。12个引物扩增出
200～2 000 bp之间的清晰条带共 170条 , 平均每
个引物 1412个条带。其中百山祖 (BSZ) 居群用 表 2　 ISSR分析用的 12个引物序列Table 2　Sequences of 12 pr im ers used in ISSR ana lysis引物Primer 序列Sequence 引物Primer 序列SequenceUBC817 (CA) 8 C UBC841 ( GA) 8 YCUBC826 (AC) 8 C UBC855 (AC) 8 YTUBC827 (AC) 8 G UBC856 (AC) 8 YAUBC835 (AG) 8 YC UBC888 BDB (AC) 7UBC836 (AG) 8 YA UBC895 AGAGTTGGTAGCTCTTGAUBC840 ( GA) 8 YT UBC900 ACTTCCCCACAGGTTAAC
4621
　6期 金则新等 : 云锦杜鹃自然居群遗传多样性的 ISSR分析 　
引物 UBC836的扩增图谱如图 1所示。
212　遗传多样性
170 个位点中多态性位点为 150 个 , 占
88124%。5个居群的多态位点百分率 ( P , % ) 变
化范围在 42194% ～55188%之间 (表 3) , 平均为
48123% ; Shannon信息指数 ( I) 的变化范围在
012468～012977之间 , 平均为 012682; N ei基因
多样性 ( h) 的大小从 011688到 011997, 平均为
011818。不同居群的遗传多样性以 KCS居群最
高 , TTS居群最低。物种水平的 I与 h 分别为
014317和 012848。 图 1　云锦杜鹃 BSZ居群用引物 UBC836的扩增结果1～20: 个体 ; M: λDNA /EcoRⅠ + H ind Ⅲ。F ig. 1　The ISSR gel pa ttern s of pr im er UBC836 in theBSZ popula tion of Rhododendron fortunei1 - 20: Individual; M: λDNA /EcoRⅠ + H ind Ⅲ.
表 3　云锦杜鹃居群内的遗传多样性
Table 3　Estima tes of genetic d iversity w ith in Rhododendron fortunei popula tion s
居群
Population
样本数 Number
of individuals
多态位点数 Number
of polymorphic loci
多态位点百分率 Percentage
of polymorphic loci ( P, % )
Shannon信息指数 Shannonpis
index of diversity( I)
N ei基因多样性 N eipis
genetic diversity( h)
KCS 20 95 55188 012977 011997
TTS 20 73 42194 012468 011688
FYS 20 77 45129 012594 011776
BSZ 20 85 50100 012694 011812
GK 20 80 47106 012674 011818
种 Speices 100 150 88124 014317 012848
SD 012323 011744
　　注 : SD为标准误。Note: SD indicates the standard deviation.
213　遗传分化
AMOVA分子变异对 5个云锦杜鹃居群的分析显示 , 在总的遗传变异中 , 40103%的变异发生在
居群间 , 59197%的变异发生于居群内 , 居群间、居群内的变异均极显著 ( P < 01001) (表 4)。根据
N ei指数所估算的居群间的基因流为 018824。
表 4　5个云锦杜鹃居群 100个个体的 AMO VA分析
Table 4　Ana lysis of m olecular var iance ( AMO VA) of 100 ind iv idua ls from f ive popula tion s of Rhododendron fortunei
变异来源
Source of variance
自由度
d. f
平方和
SSD
方差
M SD
变异组分 Variance
component
百分率
Percentage ( % )
概率
P3
居群间 Among popualtions(AP) 4 75010200 1871505 817219 40103 < 01001
居群内 W ithin populations (W P) 95 1 24113500 131067 1310668 59197 < 01001
　　注 : d1f, 自由度 ; SSD , 平方和 ; M SD , 期望方差。3 1 000次交换单倍型的显著性检验。
Note: d1f, degree of freedom; SSD , sum of squares; M SD , expected mean squares. 3 Number of permutation = 1 000.
214　遗传距离
利用 POPGENE软件计算的结果可知 , 5个居
群平均遗传相似度为 018490, 平均遗传距离为
011755。KCS和 TTS之间的遗传距离最小 , 为
011307; BSZ和 GK之间的遗传距离最大 , 为
011935。
根据云锦杜鹃居群间的遗传距离 , 采用
UPGMA法对 5个居群进行聚类分析 (图 2) , 大
致 可以将 5个居群分为 3组 , 即 KCS居群和 TTS
图 2　5个云锦杜鹃居群间的 N ei遗传距离聚类分析图
F ig. 2　The dendrogram of the f ive popula tion s of Rhododendron
fortunei ba sed on N ei’s genetic d istance
5621
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
居群组成一组 , FYS居群和 BSZ居群组成另一组 , GK居群单独成一组。
3　讨论
ISSR分子标记揭示了云锦杜鹃物种水平的 P为 88124%、 I为 014317、 h为 012848, 表明云锦杜
鹃物种水平的遗传多样性较高 , 与大多数广布种如罗汉果 ( S ira itia grosvenorii, P为 8210%、 I为
01354、h为 01248)〔14〕、海桑 (S onnera tia caseola ris, P为 81117%、 I为 013256、 h为 012100 )〔15〕的
遗传多样性水平较接近。云锦杜鹃是广泛分布的一种长寿命、多年生常绿木本植物。广布种相对于其
它特有种常具有较高的遗传多样性〔16〕。相对于物种水平而言 , 云锦杜鹃各居群的遗传多样性较低
( P平均为 48123% , I平均为 012682, h平均为 011818)。由于云锦杜鹃喜阴凉、湿润的生境 , 常分
布在海拔 400～1 900 m的沟谷阔叶林或山顶灌草丛 , 居群间有不适生境的阻隔 , 基本上呈岛屿状分
布 , 使得基因交流变得困难 , 近交程度加深。此外 , 野外观察云锦杜鹃的传粉方式可能是由虫媒传粉
向自花传粉演化〔3, 4〕。近交或自交都可以导致杂合度的降低而影响个体的适合度 , 进而导致遗传多样
性的丧失 , 从而使居群内遗传多样性降低。
AMOVA分子变异分析显示 , 云锦杜鹃的遗传变异 40103%存在于居群间 , 5个居群间的平均遗
传距离为 011755, 这些都表明居群间已产生较大程度的分化。居群间遗传分化的产生主要与居群间
的基因交流受到限制有关。云锦杜鹃多零星散生在高山上 , 居群间的空间距离较远 , 花粉的传播受到
了很大的阻碍 , 限制了种内居群间的随机交配 , 居群间的基因流受阻 , 使居群间的遗传分化越来越明
显。此外 , 云锦杜鹃的繁育系统为自交和异交并存的混合交配型 , 但自然状态下以自花传粉为
主〔3, 4〕。自交可以降低基因流 , 引起基因的丢失 , 增大遗传分化。W right〔17〕认为居群间基因流大于 1
能发挥其均质化作用 ; 反之小于 1则表明基因流成为遗传分化的主要原因。云锦杜鹃的基因流为
018824, 小于 1, 表明总体水平的基因流较低。因此 , 云锦杜鹃由于居群隔离、自交引起的较低的基
因流是居群间遗传分化重要原因。
云锦杜鹃是优良的观赏植物 , 具有重要的经济价值 , 保护好云锦杜鹃遗传资源 , 对于利用其遗传
资源 , 培育适于平地栽培的新品种 , 解决引种栽培的实际问题具有重要意义。从本研究的结果来看 ,
括苍山居群的遗传多样性水平较高 , 是保护和利用的重点。但是云锦杜鹃各居群间有较大的遗传分
化 , 基因流低 , 因此也要注意其它居群的保护和利用。也可在云锦杜鹃居群间进行植株迁移、种子和
幼苗的交换 , 人为创造居群间基因交流和重组的条件 , 更好地维持和提高云锦杜鹃遗传多样性水平。
参考文献 :
1　方云亿. 浙江植物志 (第 5卷 ) . 杭州 : 浙江科学技术出版社 , 1989. 9～10
Fang Y Y. Flora of Zhejiang ( volume 5) . Hangzhou: Zhejiang Science Technology Press, 1989. 9 ～10 ( in Chinese)
2　李晓红 , 肖宜安 , 龙婉婉 , 胡文海 , 吴　杨. 井冈山自然保护区云锦杜鹃群落物种多样性研究. 浙江林业科技 , 2005, 25 ( 1) :
17～20
L i X H, Xiao Y A, LongW W , Hu W H, W u Y. Study on species diversity of Rhododendron fortunei community in J inggangshan nature re2
serve. Journal of Zhejiang Forest Science and Technique, 2005, 25 (1) : 17～20 ( in Chinese)
3　边才苗 , 金则新. 天台山云锦杜鹃的开花与结实特性. 园艺学报 , 2006, 33 (1) : 101～104
B ian C M, J in Z X. The flowering and fruit set features of R hododendron fortunei in Tiantai mountains. Acta Horticulturae Sinica, 2006, 33
(1) : 101～104 ( in Chinese)
4　边才苗 , 金则新. 云锦杜鹃的开花动态与繁育系统研究. 广西植物 , 2005, 25 (2) : 169～173
B ian C M, J in Z X. Studies on floral dynam ic and breeding system of Rhododendron fortunei. Guihaia, 2005, 25 ( 2 ) : 169～173 ( in
Chinese)
5　金则新 , 柯世省. 云锦杜鹃叶片光合作用日变化特征. 植物研究 , 2004, 24 (4) : 447～452
J in Z X, Ke S S. The diurnal variation of photosynthesis in leaves of R hododendron fortunei. Bulletin of Botanical Research, 2004, 24 (4) :
447～452 ( in Chinese)
6　李钧敏 , 金则新 , 杨蓓芬. 云锦杜鹃总黄酮含量及成分分析. 西北林学院学报 , 2004, 19 (1) : 110～112
6621
　6期 金则新等 : 云锦杜鹃自然居群遗传多样性的 ISSR分析 　
L i J M, J in Z X, Yang P F. The content and analysis of the components of flavonoids in R hododendron fortunei. Journal of Northwest Forestry
University, 2004, 19 (1) : 110～112 ( in Chinese)
7　Sp iess E B. Genes in population. 2nd ed. . New York: John W iley & Sons, 1989. 787～792
8　潘　莹 , 赵桂仿. 分子水平的遗传多样性及其测定方法. 西北植物学报 , 1998, 18 (4) : 645～653
Pan Y, Zhao G F. Estimation of genetic diversity at molecular level. Acta Botany Boreal2Occident Sinica, 1998, 18 (4) : 645～653 ( in Chinese)
9　Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerp rinting by simp le sequence repeat ( SSR) 2anchored polymerase chain reaction amp lifi2
cation. Genom ics, 1994, 20: 176～183
10　李钧敏 , 柯世省 , 金则新. 濒植物七子花 DNA的提取及分析. 广西植物 , 2002, 22 (6) : 499～502
Li J M, Ke S S, J in Z X. Extraction and determination of DNA from Heptacodium m iconioides. Guihaia, 2002, 22 (6) : 499～502 ( in Chinese)
11　Yeh F C, Boyle T J B. Population genetic analysis of co2dom inant and dom inant markers and quantitative traits. Belgian Journal of Botany,
1997, 129: 157
12　张富民 , 葛　颂. 群体遗传学研究中的数据处理方法 I. RAPD数据的 AMOVA分析. 生物多样性 , 2002, 10 (4) : 438～444
Zhang F M, Ge S. Data analysis in population genetics. I. Analysis of RAPD data with AMOVA. B iodiver Science, 2002, 10 (4) : 438～
444 ( in Chinese)
13　Excoffier L, Smouse P, Quattro J M. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA hap lotypes: app lication to hu2
man m itochondrial DNA restriction data. Genetics, 1992, 131: 479～491
14　彭云滔 , 唐绍清 , 李伯林 , 刘燕华. 野生罗汉果遗传多样性物 ISSR分析. 生物多样性 , 2005, 13 (1) : 36～42
Peng Y T, Tang S Q, L i B L, L iu Y H. Genetic diversity of S iraitia grosvenorii detected by ISSR markers. B iodiversity Science, 2005, 13
(1) : 36～42 ( in Chinese)
15　李海生 , 陈桂珠. 海南岛红树植物海桑遗传多样性的 ISSR分析. 生态学报 , 2004, 24 (8) : 1657～1663
L i H S, Chen G Z. Genetic diversity of mangrove p lant Sonneratia caseolaris in Hainan Island based on ISSR analysis. Acta Ecologica Sinica,
2004, 24 (8) : 1657～1663 ( in Chinese)
16　B rown A H D, Clegg M T, Kahler A L, W eir B S. Plant population genetics, breeding and genetic resources. USA: Sinauer A ssociater,
1989. 43～63
17　W right S. Evolution in Mendelian population. Genetics, 1931, 6: 91～159
收稿日期 : 2006 - 02 - 08; 修回日期 : 2006 - 07 - 11
基金项目 : 河北省自然科学基金资助项目 (C2004000356)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhangwei631126@1631com)
鸭梨果酒香气成分分析
何 　义 1 　张 　伟 13 　赵红梅 2 　林 　杨 1 　马晓燕 1 　李英军 1 　 (1 河北农业大学食品科技学院 ,
河北保定 071001; 2 河北农业大学信息学院 , 河北保定 071001)
Ana lysis of Aroma Com ponents of‘Ya li’Pear W ine by Gas Chroma tography
- Ma ss Spectrom etry
He Yi1 , Zhang W ei13 , Zhao Hongmei2 , L in Yang1 , Ma Xiaoyan1 , and L i Yingjun1 ( 1 Food Science and Tech2
nology College, A gricu ltural U niversity of Hebei, B aoding, Hebei 071001, Ch ina; 2 Inform ation College, A gricultura l U niversity of
Hebei, B aod ing, Hebei 071001, Ch ina)
关键词 : 梨 ; 果酒 ; 香气成分 ; 气相色谱 -质谱
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621267202
香气成分是构成和影响果实与果酒质量、典型性的主要因素 [ 1 ]。鲜梨中的香气化合物种类较少 , 以酯类为主 , 包
括乙酸乙酯、己酸乙酯 , 也含有少量醇、醛、芳香和芳香杂环化合物 [ 2 ]。目前对鸭梨果酒香气成分还未见报道。
试验用鸭梨产自河北保定。鸭梨果酒于 2006年 8月由河北农业大学食品科技学院酿制 , 酒度 815% (V /V ) , 含
糖量 1121 g/L, pH 316, 于 2006年 12月进行鸭梨果酒香气成分的测定。取样 200 mL, 分别用 200、100、50 mL二氯
甲烷萃取 3次 , 合并有机相 , 无水硫酸钠脱水 , 减压浓缩至 1 mL, 供 TRACE 2000 DSQ气质联用仪 (美国 Thermo
Finnigan公司 ) 分析。色谱柱 : DB - 5MS 30 m ×0125 mm ×0125μm。色谱条件 : 进样口温度为 250℃, 柱温箱起始温
度 50℃, 保留时间 2 m in, 以 7℃ /m in升至 240℃, 保留 10 m in; 载气 He, 恒流 1 mL / m in。质谱条件 : 电离方式 E I,
电离电压 70 eV, 离子源温度 250℃, 连接杆温度 260℃。
7621