全 文 ：果 树 学 报 ２００9，２6（1）: 103～107
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ
锥栗自然居群 ISSR-PCR分析技术的建立
刘国彬 1，2，龚榜初 1*，罗正荣 2
（1中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江富阳 311400；
2华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）
摘 要： 提取野生锥栗的基因组 DNA 作为 ISSR-PCR 模板，对反应体系中的模板用量、Mg2+浓度、dNTPs 浓度、引物
浓度和 Taq DNA 聚合酶用量 5 个主要影响因素进行梯度试验，并对扩增程序中的退火温度与循环次数进行了探讨，
初步确立了适合野生锥栗的 ISSR-PCR分析技术体系，即 25μL反应体系中，模板 DNA 40或 50 ng、Mg2+ 2.25 mmol·L-1、
dNTPs 0.2 mmol·L-1、引物 0.2 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶 1.0 U；PCR 扩增程序为 : 94 ℃预变性 3 min；然后 94 ℃变性
45s，（Tm+2～4 ℃）退火 45s，72 ℃延伸 2 min，共 32 个循环；最后 72 ℃充分延伸 5 min；1.5％琼脂糖凝胶电泳分离扩增
产物。
关键词： 锥栗； 自然居群； ISSR
中图分类号：Ｓ６６4．2 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０(２００9)０1－103－０5
Establishment of inter -simple sequence repeat reaction system in Cas-
tanea henryi
LIU Guo-bin1，2，GONG Bang-chu1*，LUO Zheng-rong2
(1Research Institute of Subtropical Forestry， Chinese Academy of Forestry， Fuyang， Zhejiang 311400 China； 2Key Laboratory for Horticul-
tural Plant Biology， Ministry of Education， Huazhong Agricultural University， Hubei，Wuhan 430070 China)
Abstract: In order to investigate the genetic diversity and relationship within and among Castanea henryi， Zhejiang and
Huangshan natural C. henryi were subjected to inter-simple sequence repeat (ISSR-PCR) analysis. Genomic DNA of C. hen-
ryi was extracted from leaves as the template， the mainly influencing factors of ISSR were studied and the experiment param-
eters were optimized. By adjusting the concentration of template DNA， Mg2+， dNTPs， primer and the contents of Taq DNA
polymerase， the PCR amplification system were optimized； Then we also optimized the amplified program， including the an-
nealing temperature and PCR cycles， the PCR amplification conditions were established， finally. The optimal experiment
conditions were as follow: 25 μL reaction system containing 40 or 50 ng template DNA， 2.25 mmol·L-1 Mg2+， 0.2 mmol·L-1
dNTPs， 1.0 U Taq DNA polymerase， 0.2 μmol·L-1 primer； with a ABI thermal cycle， the optimal amplification program was
an initial denature for 3 min at 94 ℃， followed by 32 cycles of 45 s at 94 ℃， 45 s at Tm+2~4 ℃， 2 min at 72 ℃， and a final
extension for 5 min at 72 ℃.
Key words： Castanea henryi； Natural population； ISSR
锥栗[Castanea henryi （Skan） Rehd. et Wils.]为我
国特有，属壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea Mill.）植
物，别名珍珠栗、尖栗、旋栗等。主要分布在秦岭以南
广大亚热带丘陵山区， 大多分布在海拔 500 m以上
的低山丘陵及山区。 锥栗为落叶大乔木，主干通直，
材质坚实，耐水湿，被广泛应用于建筑、造船、家居等
方面，锥栗果实富含淀粉、糖、蛋白质等，营养丰富，
生食或熟食风味均佳。 其通直高大的特性成为长江
流域各地至南岭以北的主要造林树种， 具有重要的
经济价值。目前，关于锥栗方面的研究还仅仅限于资
源调查[1-2]、新品种培育[3]、果实性状分析[4]方面。 近年
来虽然部分学者对栗属展开分子生物学方面的研
究，但大多数局限于中国板栗（C. mollissima）[5-7]或针
对整个栗属（Castanea）植物 [8-9]，而利用分子技术对
中国野生锥栗进行深入而系统研究还未见报道。
ISSR（inter-simple sequence repeat）是一种基于
收稿日期： ２００8－07－29 接受日期: ２００8－11－07
基金项目： 国家农业科技成果转化资金项目“锥栗优良新品种中试与产业化示范”（2007GB24320385）；国家林业局重点项目“锥栗优良新
品种示范”（[2007]-74 号）
作者简介： 刘国彬，男，硕士，研究方向:生物技术与种植创新。 E-mail: liuguobin0209@webmail.hzau.edu.cn
觹 通讯作者。 Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ． Tel: 0571-63310045， E-mail: gongbc@126.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2009.01.022
果 树 学 报 ２6 卷
Template DNA/ng
Mg2+/mmol·L-1
dNTPs/mmol·L-1
Taq polymerase/U
Primer/μmol·L-1
20.0
1.0
0.1
0.5
0.1
30.0
1.25
0.15
1.00
0.20
40.0
1.50
0.20
1.25
0.30
50.0
1.75
0.25
1.50
0.40
60.0
2.0
0.3
2.0
0.5
70.0
2.25
2.50
0.60
80.0
2.5
100.0
2.75 3.0 3.5
反应成分
Components
用量或浓度梯度
Different concentrations of component
表 1 ISSR-PCR 反应体系各成分优化方案
Table 1 Optimum design of component concentrations for
ISSR-PCR protocol
微卫星序列的特殊的分子标记技术，具有技术简单、
成本低、信息量大、多态性丰富等优点，已经在植
物品种鉴定 [10-11]、亲缘关系分析 [12]、遗传多样性分
析 [13-16]、指纹图谱及分子遗传图谱构建 [17-20]等方面成
功应用。由于物种不同，ISSR反应体系不尽相同。在
运用 ISSR技术进行分析时，首先需要建立稳定性好
的反应体系。我们以栗属中国特有种-中国野生锥栗
的基因组 DNA为模板， 对影响 ISSR扩增效果的主
要因素 Taq DNA 聚合酶、Mg2+、引物浓度、dNTPs、退
火温度及循环次数进行探讨， 拟建立适用于野生锥
栗的最佳 ISSR-PCR 技术体系， 从而为中国野生锥
栗居群遗传多样性分析打下基础。
1 材料和方法
1.1 试材
试材为 31 份野生锥栗单株叶片。一份取自浙江
省富阳，鲜样；另外 30 份取自安徽黄山，硅胶保存。
采用改进后的 CTAB 微量法 （5 mmol·L-1醋酸钠和
2/3等体积异丙醇沉淀）提取总 DNA。
1.2 主要试剂及仪器
PCR 扩增所用的主要试剂 Taq DNA 聚合酶
（5 U·μL-1）、10×PCR 缓冲液、MgCl2 （25 mmol·L-1）、
dNTPs （各 2.5 mmol·L-1） 以及标准分子量 DNA
（DL2000）等由宝生物工程（大连）有限公司提供；引
物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；电
泳所用主要试剂 Tris、 琼脂糖等由北京鼎国生物技
术有限责任公司提供。
1.3 方法
1.3.1 试验设计 以浙江野生锥栗叶片为试材，参
考 ISSR 技术在柿 [21]、珍珠黄杨 [22]等植物上各成分的
用量，并以 Ai Cheng-xiang[13]的 ISSR-PCR 反应体系
作为原始反应体系 （25 μL 体系中 10×PCR 缓冲液
2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.2 mmol·L-1、 引物
0.3 μmol·L-1、Taq 酶 1.0 U、DNA 50 ng），以其体系中
各成分的用量为依据，根据预备实验的结果，从合成
引物中任意选取 10条引物，以扩增较好的通用引物
UBC845、824、815 作为基因组 DNA 扩增引物，采用
单因素实验设计方法， 对 ISSR反应体系中的模板、
Mg2+、dNTPs、引物浓度、Taq DNA 聚合酶 5 种主要成
分进行分析 （25 μL 反应体系中各成分优化设计方
案见表 1），在此基础上，对影响 PCR 结果的退火温
度、循环次数进行优化。从而建立适用于野生锥栗的
ISSR-PCR反应的优化体系。
PCR 反应在 ABI-2720 型热循环 PCR 仪上进
行，反应程序为： 94℃，预变性，3 min；94 ℃，45s，Tm
（依引物而定）45 s，72 ℃，2 min，32 个循环；72 ℃，5
min。
1.3.2 产物检测 PCR 扩增产物在 0.5×TBE 缓冲
液中，1.5%琼脂糖凝胶上，5 V·cm-1，电泳 60～90 min，
SYBR Gold 核酸凝胶染料染色， 然后通过计算机凝
胶成像系统 （FR-200A 全自动紫外与可见分析装
置）观察和摄影记录。
2 结果与分析
2.1 模板DNA用量对 ISSR反应的影响
从图 1 中可以看出，30～100 ng 均获得了比较清
晰的扩增产物。 20 ng 时扩增模糊， 在 40、50、60 ng
扩增稳定，本实验选择 40 ng 或 50 ng 为适宜的模板
含量，与原始反应体系中的模板含量相当。
2.2 Mg2+浓度对 ISSR反应的影响
Taq 酶是 Mg2+离子依赖性酶，Mg2+浓度是否合
适，对 PCR 反应尤为重要。 为了更好的优化 Mg2+浓
度， 本实验设置了 1.0～3.5 mmol·L-1共 10 个浓度梯
度。 图 2显示，Mg2+浓度在 1.75～3.5 mmol·L-1间均有
扩增产物。在 1.0 mmol·L-1、1.25 mmol·L-1时，由于浓
度太低，降低了 Taq酶的活性，导致无扩增产物。1.5
mmol·L-1时虽有扩增产物， 但比较弥散且出现部分
谱带缺失， 而在 2.75～3.5 mmol·L-1时出现扩增条带

1 2 3 4 5 6 7 8 M

1PC R 
:182030 40 50 60 70 80 100ng;
M :D N A ;:U B C845
Figure 1.Effects of differen tcon centratio n o ftem p late D N A on banding p attern of ISSR-P CR
N ote:18 representthe concentration of tem plate D N A 20,30,40,50,60,70,80,100n g;
M :D L2000m arker;prim er:U B C845
2000bp
1000bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 M
100
bp
250
500
750
2 000
图 1 不同模板用量对 PCR 反应的影响
1～8 泳道分别表示 20、30、40、50、60、70、80、100 ng；M:标准分子质量
DNA；引物:UBC845
Fig. 1 Effects of different concentration of template DNA on
banding pattern of ISSR-P CR
1～8 represent the concentration of template DNA 20、30、40、50、60、70、
80、100 ng； M: DL2000 m arker；Primer: UBC845
104
1 期 刘国彬等: 锥栗自然居群 ISSR-PCR 分析技术的建立
模糊，Mg2+在 1.75～2.5 mmol·L-1间有较好的扩增，但
比较发现 2.25 mmol·L-1和 2.5 mmol·L-1处扩增条带
更清晰稳定，比原始反应体系中的用量（2.0 mmol·L-1）
稍高。 本实验确定 2.25 mmol·L-1 为适宜的 Mg2+浓
度。
2.3 dNTPs浓度对 ISSR反应的影响
dNTPs 是 PCR 的原料，浓度过高或过低都会对
扩增结果产生影响。 图 3 结果表明：dNTPs 浓度在
0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol·L-1时， 都有扩增产物，
但在 0.1 mmol·L-1和 0.15 mmol·L-1时出现扩增谱带
部分缺失，0.3 mmol·L-1时扩增模糊，在 0.2 mmol·L-1
和 0.25 mmol·L-1时扩增条带清晰，稳定性好，所以
选择 0.2 mmol·L-1为 dNTPs的最佳浓度，0.25mmol·L-1
可作为一个候选浓度。
2.4 引物浓度对 ISSR反应的影响
不同引物浓度也是影响 PCR 扩增效果的重要
因素。 本实验设置 0.1~0.6 μmol·L-1共 6个梯度。 从
图 4 中可以看出：引物浓度过高（0.6 μmol·L-1）反应
结果并不理想， 甚至出现缺失， 无扩增产物， 而在
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1 时均有清晰的扩增产
物。 原始反应体系中引物浓度为 0.3 μmol·L-1，但在
本实验结果中，0.2 与 0.3 μmol·L-1 扩增效果一致，
因此取引物浓度为 0.2 μmol·L-1。
2.5 Taq酶对 ISSR反应的影响
Taq 酶作为影响 PCR 反应的重要因素之一，用
量过多，会产生非特异性扩增；用量少，又会导致合
成速率下降。 在其它作物中，ISSR-PCR反应体系中
Taq 酶的用量在 0.5～1.5 U，本实验设置了从 0.5～2.5
U 共 6 个梯度。 结果（图 5）显示：Taq 酶除在 0.5 U
时出现部分扩增谱带缺失外，1.0、1.25、1.5、2.0、2.5
U用量下都扩增出稳定而清晰的谱带，且带型相似，
没有明显的区别。从经济角度出发，确定 25 μL反应
体系中 Taq酶的最终用量为 1.0 U。
2.6 对野生锥栗的扩增
至此，ISSR-PCR 反应的条件基本优化完全并
固定下来。 其 25 μL 反应体系为：10×PCR 缓冲液

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp

2M g2+PCR 
:1~10 :1.01.251.51.752.02.252.52.753.03.5
m m olL-1.M :DNA;:UBC845
Figure 2.Effectsofdifferentconcentration ofM g2+on banding pattern ofISSR-PCR
Note:110 representthe concentration ofM g2+1.0,1.25,1.5,1.75,2.0,2.25,2.5,2.75,
3.0,3.5 m m olL-1 respectively.M :DL2000 m arker;prim er:U BC845
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
100
bp
250
500
750
1 0
2 0
图 2 不同 Mg2+浓度对 PCR 反应的影响
1 ～10 泳道分别表示 1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.5
mmol·L-1；M:标准分子质量 DNA；引物:UBC845
Fig. 2 Effects of different concentration of template Mg2+ on
banding pattern of ISSR-PCR
1～10 represent the concentration of Mg2+ 1.0，1.25，1.5，1.75，2.0，2.25，
2.5，2.75，3.0，3.5 mmol·L -1 respectively； M: DL2000 marker；Primer:
UBC845

1 2 3 4 5 6 M

4PCR 
:160.10.20.30.40.50.6 um olL-1.
M :DN A ; :U BC845
Figure 4.Effects ofdifferentconcentration ofprim er on ISSR-PCR
N ote:16 representthe concentration ofprim er0.1,0.2,0.3,
0.4,0.5,0.6um ol/L,respectively.M :DL2000 m arker;
prim er:U BC845
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
1 2 3 4 5 6 M
100
bp
250
500
750
图 4 不同引物浓度对 PCR 反应的影响
1～6 泳道分别表示 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol·L-1；M: 标准分子质
量 DNA；引物:UBC845
Fig. 4 Effects of different concentration of prime
on ISSR-PCR
1 ～6 represent the concentration of primer 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6
μmol·L-1 respectively； M: DL2000 marker；Primer: UBC845

1 2 3 4 5 M
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp

3dNTPsPCR 
:1 5:0.30.250.20.150.1m m olL-1.M :
DNA;:UBC845
Figure 3.Effectsofdifferentconcentration ofdNTPsonbandingpattern ofISSR-PCR
Note:15 representtheconcentration ofdNTPs0.3,0.25,0.2,0.15,0.1m m ol/L.
M :DL2000m arker;prim er:U BC845
3 4 5 M
1 0
bp
250
5 0
750
1 0
2 0
图 3 不同 dNTPs 浓度对 PCR 反应的影响
1～5 泳道分别表示 0.3、0.25、0.2、0.15、0.1 mm l·L-1；M:标准分子质量
DNA；引物:UBC845
Fig. 1 Effects of different concentration of dNTPs on
banding pattern of ISSR-PCR
1～5 represent the concentration of dNTPs 0.3，0.25，0.2，0.15，0.1 mmol·
L-1； M: DL2000 marker；Primer: UBC845

2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
1 2 3 4 5 6 M

5 Taq D N APCR
:1~6 0.51.01.251.52.02.5 U /25ul.M :
D N A;:U B C845
Figure 5.Effects ofd ifferent con centration ofTaq D N A polym erase on ISSR -PCR
N o te:16 represent the concentration ofTaq D N A p olym erase 0.5,1.0,1.25,
1.5,2.0, 2.5U ,resp ectively.M :D L2000 m arker;prim er:U BC845
2 3 4 5 6 M
100
bp
250
500
750
00
图 5 Taq DNA 聚合酶对 PCR 反应的影响
1～6 泳道分别表示 0.5、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5 U；M: 标准分子质量
DNA；引物:UBC845
Fig. 5 Effects of different concentration of Taq DNA
polymerase on ISSR-PCR
1 ～6 represent the concentration of Taq DNA polymerase
0.5，1.0，1.25，1.5，2.0，2.5，2.5 μL respectively； M: DL2000 marker；
Primer: UBC845
105
果 树 学 报 ２6 卷

2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

6U B C82422  ISSR
M :D N A
Figure6.ISSR profiles generated by prim erU BC824 from population
in H uangshan
M :D L2000 m arker
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5 16 17 18 19 20 2 22
100
bp
250
500
750
1 000
00
图 6 引物 UBC824 对安徽黄山 22 个野生锥栗
个体扩增的 ISSR 带型
M: 标准分子质量 DNA
Fig. 6 ISSR profiles generated by prime UBC824 from
population in Huangshan
M: DL2000 marker
2.5 μL、Mg2+ 2.25 mmol·L-1、dNTP 0.2 mmol·L-1、Taq
DNA 聚合酶 1.0 U、 引物浓度 0.2 μmol·L-1、 模板
DNA 40～50 ng，加无菌水至 25 μL。 利用优化体系对
安徽黄山部分野生锥栗单株进行 ISSR扩增，扩增结
果如图 6 所示，引物 UBC824 将黄山居群所有 30 个
单株（仅列出 1～22号单株）的带型完全扩增出来，所
产生的 ISSR扩增谱带清晰，反应系统稳定。
3 讨 论
ISSR-PCR 扩增受到基因组模板浓度与纯度、
Mg2+浓度、dNTPs 浓度、 引物浓度、Taq DNA 聚合酶
用量及循环程序等诸多因素的影响， 所以需要优化
固定 PCR反应的各种条件，以得到较好的扩增。
同一引物， 对于不同的物种， 退火温度可能不
同。AI等[13]运用 ISSR技术分析中国板栗遗传多样性
时引物 845 的退火温度为：52.4℃； 而 Casasoli 等[19]
在运用 ISSR 技术检测欧洲栗时所采用的引物 824
和 845 的退火温度均为 52 ℃。 而在本研究中引物
824和 845的退火温度分别为：56℃和 58℃，在 52℃
未得到清晰的产物。退火温度不同，产生的错配程度
也不相同。 较低的退火温度会使引物与模板间未完
全配对的位点得到错误扩增。因此，引物的退火温度
在不同物种中要进行优化设计， 在 Tm 允许的范围
内，选择较高的退火温度，可提高 PCR 反应的特异
性。
在进行正式的 ISSR-PCR 反应之前， 要建立稳
定的反应体系。 一般可采用单因素或两因素的完全
试验设计，对各影响因素进行单因素多水平的研究，
也可采用正交试验设计， 以有效分析不同因素的相
互作用，但缺点是处理水平设置有限。这 2种方法都
有应用 [21-23]， 主要取决于研究人员多方面的综合考
虑。 本试验利用引物 UBC845、824、815 采用单因素
多水平（6~10 梯度）的试验设计，系统而精细的研究
了各影响因子对 ISSR-PCR 扩增效果的影响， 较快
的建立了适用于不同引物、 稳定的锥栗 ISSR-PCR
优化体系。本实验稳定的 ISSR反应体系可为锥栗实
验的后续工作提供参考， 特别将为引物筛选和运用
ISSR 进行野生锥栗遗传多样性分析奠定一定的基
础。
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