全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 688 - 694
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 22; 修回日期 : 2007 - 04 - 23
基金项目 : 云南省科技攻关项目 (2003NG05) ; 云南省农业科技攻关计划项目 (2006NG34)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xingqih@public1km1yn1cn)
致谢 : 昆明杨月季公司和云南省农业科学院花卉研究所李树发副研究员为本研究提供试材。
月季突变体抑制差减杂交 cDNA文库构建及分析
谢吉容 1, 2 , 梁国鲁 1 , 唐开学 3 , 张　灏 3 , 程在全 3 , 黄兴奇 33
(1西南大学园林园艺学院 , 重庆 400715; 2 重庆文理学院生命科学系 , 重庆 402168; 3云南省农业科学院 , 昆明
650223)
摘 　要 : 为了分析月季花色花香突变机理和揭示花色花香代谢的相关基因 , 利用抑制性消减杂交技术
分离了月季红花无香突变体 ‘往日情怀 ’ (以下简称突变体 ) 与其野生型金黄色浓香品系 ‘金银岛 ’ (以
下简称野生型 ) 之间表达差异 cDNA片段。分别以突变体作为驱赶子 , 野生型为检测子 , 以及以野生型作
为驱赶子 , 突变体为检测子建立了两个差异表达 cDNA文库 W SSH和 JSSH, 分别代表在突变体和野生型中
特异表达的 cDNA; 再经文库高密度点阵膜的杂交差示筛选分析 , 在 W SSH库中获得特异表达的 27个阳性
克隆 , 在 JSSH文库中得到 25个阳性克隆。差异表达克隆测序后经 BLAST比对分析发现 W SSH文库中含有
与红花突变体的花青素积累直接相关的 CHS、DFR、细胞色素 P450加单氧酶、乙二醛酶 Ⅰ、己糖转移因
子、MYB1转录因子、S -腺苷蛋氨酸转移酶、ADR等花色相关 EST; JSSH文库中含有与野生型花香形成
相关的月季甲基间苯二酚 O -甲基转移酶、转醛醇酶、Acyl2CoA 结合蛋白、钙调素结合蛋白、MYB92转录
因子的 EST以及导致芽变的 Ty12cop ia2like逆转座子。
关键词 : 月季 ; 抑制性消减杂交 ; 花色 ; 花香 ; 突变体 ; 差异表达
中图分类号 : S 685112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320688207
Con struction and Ana lyses of SSH cD NA L ibrar ies of Rose Flora l Color and
Scen t M utan t
X IE J i2rong1, 2 , L IANG Guo2lu1 , TANG Kai2xue3 , ZHANG Hao3 , CHENG Zai2quan3 , and HUANG Xing2qi33
( 1 College of Horticu ltu re and Gardens, S ou thw est U n iversity, Chongqing 400715, Ch ina; 2D epartm en t of L ife S cience,
Chongqing U n iversity of A rts and S ciences, Chongqing 402168, Ch ina; 3 Yunnan A cadem y of A g ricu ltura l S ciences, Kunm ing
650223, Ch ina)
Abstract: In order to analyse molecular mechanism of rose flower and scent metabolism and to exp lore
the genes involved in rose floral color and fragrance metabolism, the supp ressive subtraction hybridization
( SSH) technique was used. Two differential exp ressing cDNA libraries were constructed with the cDNA s of
the rose color and scentmutantW angriqinghuai as driver and the cDNA s of itswild type J inyindao (R osa ×hy2
brida) as tester, vice versa. The cDNA libraries of W SSH indicated the differential exp ressing cDNA frag2
ments in W angriqinghuai and JSSH indicated the differential exp ressing cDNA fragments in J inyindao. The
difference of PCR bands for substracted samp le and non2substracted samp le was obvious. The relevant cDNA
fragments exp ressing differentially between W angriqinghuai and J inyindao were revealed and isolated through
m icoarray analysis of the clones in SSH. Twenty2seven positive clones ofW SSH and 25 positive clones of JSSH
were obtained. After sequencing the clones exp ressing differentially in two cultivars and blasting their se2
quences, some ESTs regulating the color of p ink mutant, such as CHS, DFR, MYB1, ADR were obtained
from W SSH. Some ESTs regulating the floral color and scent of yellow p rogenitor, such as OOMT, MYB92
　3期 谢吉容等 : 月季突变体抑制差减杂交 cDNA文库构建及分析 　
were also obtained from JSSH. Ty12cop ia2like retrotransposon most likely causing bud mutation was also got in
this study. This is the first report on rose mutant SSH which would be useful for analysis and isolation of the
genes related to rose floral color or scent.
Key words: Rose; Supp ressive subtraction hybridization; Floral color; Floral scent; Mutant; D ifferential
exp ression
月季花色花香代谢路径复杂 , 涉及的相关基因很多。前人曾在许多植物中利用矮牵牛、金鱼草等
花卉的花色花香突变体 , 分离了大部分花色代谢的关键酶和少量的花香代谢基因 (OpiReilly et al. ,
1985; Manuel et al. , 1997; David & V icki, 1999)。但是月季遗传分子基础研究很少 , 目前 NCB I上
只登记月季属 (R osa) 8 699条核酸序列 , 其中 352个功能基因 EST ( Exp ressing Sequence Tag) , 与花
色相关的基因有 9个 ( Tanaka et al. , 1995; Kagam i & Suzuki, 2005; Ogata et al. , 2005) ; 与花香代
谢相关基因有 12个 ( Lavid et al. , 2002; Shalit et al. , 2003; Scalliet et al. , 2006a, 2006b)。对于遗
传背景研究较少的月季 , 利用珍贵的自发突变体 , 比较研究突变体与其野生型在相同环境条件下基因
表达的差异可以获取基因功能的信息。作者利用 SSH方法对非常特别的月季花色花香突变体 ‘往日
情怀 ’与其野生型对照品系 ‘金银岛 ’表达差异进行了研究 , 为进一步发掘花色花香调控新基因及
获得其全长 cDNA提供参考。
1　材料与方法
111　材料与试剂
月季 ‘金银岛 ’ (以下简称为野生型 ) 是昆明杨月季公司从法国引进的一个切花品种 , 金黄色 ,
花香浓郁 ; 其芽变品种 ‘往日情怀 ’ (以下简称为突变体 ) 粉红色 , 无香味。两个品种除了突变性状
外 , 遗传背景完全一致。两个供试材料被种植在该公司育种圃的不同垄上。
2006年 2月 12日 , 从其枝条上分别采取 3期 (花蕾已是粉红色或金黄 , 花蕾未开 )、4期 (外
轮花瓣开放 ) 花朵 , 摘下其花瓣立即用液氮保存 , 送云南农业科学院生物所分子生物学重点实验室 ,
供试验研究。
PCR SelectTM cDNA Subtractio Kit和 PCR_SelectTM D ifferential Screening Kit均购自 CLONTECH公司 ;
mRNA Purification Kit购自上海华舜生物工程有限公司 ; pMD182T Vector, DNA Marker DL 2000购自
Takara公司 ; Taq酶、 dNTP、巢式 PCR引物 P1和 P2R购自上海生工生物工程公司 ; 250 bp DNA
Marker购自 Generay B iotech Co. L td; 尼龙膜购自 Sigma公司 ; E1coli DH5α为本实验室保存 ; 其它试
剂均为 Sigma公司和国产分析纯产品。
112　总 RNA提取和 m RNA的纯化
分别取两个供试材料对应的 3、4期花瓣 , 液氮研磨混匀 , 按照杨传平等 (2002) 的 CTAB多级
沉淀法提纯两种月季花瓣材料的总 RNA。参照上海华舜 mRNA Purification Kit说明进行 mRNA的纯
化 , 溶于 10μL DEPC处理的 H2 O中。经紫外分光光度计及甲醛变性琼脂糖胶检测 , - 70℃保存备
用。
113　抑制性消减杂交及 PCR产物的克隆
cDNA的合成、R saⅠ消化、连接接头、第 1次杂交和第 2次杂交及 PCR反应均参照 CLONTECH2
PCR_SelectTM cDNA Subtraction Kit说明 , 在 B io2Rad公司的 MJR型 PCR仪上进行。以突变体作为驱赶
子 , 野生型为检测子 , 以及以突变体作为检测子 , 野生型为驱赶子进行两次消减杂交 , 将两种杂交的
第 2次 PCR产物纯化后分别克隆至 pMD182T载体中 , 建立两个抑制差减 cDNA文库 W SSH和 JSSH,
分别代表在突变体和野生型特异表达的 cDNA。
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PCR产物与 pMD182T的连接以及转化 E1coli DH5α参照 pMD182T vector Kit说明书及相关文献
(Havard, 2002) 进行。
114　阳性克隆筛选
在蓝白筛选基础上 , 进行具有插入片段的阳性克隆鉴定。用巢式 PCR引物扩增插入片段 , 克隆
片段与 250 bp Marker电泳条带比较 , 分析片段有无和大小 ; PCR扩增体系改为 20μL (10 ×Buffer 2
μL, 25 mmol·L - 1 MgCl2 2μL, 215 mmol·L - 1的 dNTP 2μL, 10μmol·L - 1的 Primer 1和 Primer 2R
各 018μL, Taq酶 (5 U·μL - 1 ) 016μL, 水 1016μL, 模板菌液 1μL ) ; PCR循环参数改为 94℃
30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 115 m in, 共 23个循环 , 最后 72℃延伸 1 m in。
将经鉴定的插入片段在 100 bp以上的克隆运用于筛选差异表达阳性克隆 , 操作按 PCR Select D if2
ferential Screening Kit (Clontech) 说明书进行。阳性克隆判断也依据该说明书的标准。
115　阳性克隆片段 D NA测序及同源序列的检索与比较
阳性克隆采用甘油保菌的方法送北京华大基因测序中心测序。测出的 DNA序列在经过切除载体
和接头序列后在 National Center for B iotechnology Information核酸数据库 B lastn和蛋白数据库 B lastx中
进行同源核苷酸和蛋白序列检索。
2　结果与分析
211　样品总 RNA与 m RNA质量检测结果
突变体和野生型样品总 RNA提取后分别取 5μL RNA 样品 , 纯化的 mRNA取 1μL, 点样于甲醛
变性琼脂糖 /溴化乙锭凝胶上 , 经 4 V·cm - 1恒压电泳 1 h , 在紫外灯下观测 RNA条带 , 并照相记录
(图 1)。大部分 RNA集中在 18S与 28S区域间 , 其完整性较好 , 可进一步用于提取 mRNA。纯化的
mRNA呈现正常弥散的亮带 , 说明 poly (A) + RNA质量良好 , 可用于构建文库。
212　cD NA合成以及 cD NA酶切效果分析
cDNA合成反应取决于 AMV逆转录酶的活性 , 电泳结果 (图 2) 显示 , cDNA分子大小分布正
常 , 运用 R saⅠ酶切后的 cDNA大小主要在 750～250 bp范围 , 说明酶切效果好 , 适于后续试验。
图 1　月季突变体 (W ) 和野生型 ( J) 花瓣总 RNA和
m RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图谱
F ig. 1　Tota l RNA and m RNA pur if ied from corolla tissue
of rose m utan t and its w ild type using the forma ld
hydedena tured agarose gel in electrophoresis
M: RNA marker RL 6000.
图 2　月季突变体 (W ) 和野生型 ( J) 花瓣
dscD NA以及其 Rsa I酶解片段电泳图谱
F ig. 2　Electrophoretic pa ttern of dscD NA and
the ir fragm en ts
M: DNA marker DL 2000.
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　3期 谢吉容等 : 月季突变体抑制差减杂交 cDNA文库构建及分析 　
213　SSH文库消减效率检测
从图 3可知 , 正反抑制差减后的第 2次 PCR
产物 1、3分别比未差减的对照的第 2次 PCR产
物 2、4分子数量少 , 分子量范围窄一些 , 说明差
减效率高 , 可以进行后续试验分析。
214　转化阳性菌落检测
根据蓝白筛选原理 , 从 W SSH中随机挑取白
色克隆 235个 , 利用 PCR检测出具有一个插入片
段的克隆 213个 , 阳性克隆克隆率 90163% ; 从
JSSH中随机挑取白色克隆 249个 , 利用 PCR检
测出具有一个插入片段的克隆 221个 , 阳性克隆
克隆率 88175% ; 可见 “白色的菌落可能并不一
定就插入了 INSERT”, 这种菌落通常称之为假阳
性菌落 , 这种情况是难以避免的。所以在克隆测
序前有必要利用 PCR检测插入片段的有无和大
小。
W SSH的 235个和 JSSH的 249个重组克隆的
插入片段 PCR扩增部分结果见图 4。结果表明 ,
93%以上的克隆均能扩增出有效产物 , 插入片段
大部分集中在 400 bp左右 , 这说明稍小的片段更
容易与载体连接。
图 3　抑制差减杂交后的第 2次 PCR产物分析
M. 250 bp DNA marker; 1. 正向差减杂交后的第 2次
PCR产物 ; 2. 正向未差减杂交后的第 2次 PCR产物 ;
3. 反向差减杂交后的第 2次 PCR产物 ; 4. 反向未差
减杂交后的第 2次 PCR产物。
F ig. 3　Ana lysis of second PCR product after SSH
M. 250 bp DNA marker; 1. Secondary subtractive p roduct after
forward subtraction; 2. Secondary un2subtractive p roduct after
forward subtraction; 3. Secondary subtractive p roduct
after reverse subtraction; 4. Secondary un2subtractive
p roduct after reverse subtraction.
图 4　差减 cD NA文库外源插入片段的的检测
M. 250 bp DNA marker; 1～29. 随机挑取的克隆。
F ig14　 Iden tif ica tion of fore ign in serted fragm en ts of the subtracted cD NA library W SSH
M. 250 bp DNA marker; 1 - 29. Random p icked white clones.
215　差异表达的阳性克隆筛选以及 EST序列分析
利用两端特异引物对重组克隆的插入片段进行 PCR扩增 , 扩增产物纯化后点在尼龙膜上。每个
产物同时点在 4张膜的对应位置上 , 再与正反向差减后的 dscDNA和未差减的 dscDNA探针进行杂交
(图略 )。
统计结果分析表明 , 在 W SSH和 JSSH差异文库中分别得到 27和 25个阳性克隆。对正反向文库
的差异表达阳性克隆进行测序 , 发现文库插入片段多数集中在 200～500 bp, 片段大小成正态分布 ,
最多的是 400 bp左右的片段。证明了 PCR方法检测插入片段长度的可靠性。
通过在 NCB I上比对分析 (表 1) , 在两个文库中发现许多次生代谢相关基因 : W SSH文库中含有
CHS、细胞色素 P450加单氧酶、乙二醛酶 Ⅰ、MYB1转录因子、S -腺苷蛋氨酸转移酶、ADR等花色
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相关 EST (Martin & Gerats, 1993; Grotewold et al. , 1994; Kroon et al. , 1994; Timothy & Edwina,
1995; Mol et al. , 1996; Glover et al. , 1998) , 这与红花突变体的花青素积累直接相关。JSSH文库中
含有月季甲基间苯二酚 O -甲基转移酶、转醛醇酶、Acyl2CoA 结合蛋白、MYB92转录因子 ( Sablows2
ki et al. , 1994; U imari & Strommer, 1997; Guterman et al. , 2002; Lavid et al. , 2002; Zuker et al. ,
2002; Shalit et al. , 2003) 与野生型的花香形成相关的 EST以及导致芽变的 Ty12cop ia2like逆转座子
( Tao et al. , 2005) , 说明抑制性消减文库已经构建成功。
另外 , 由于月季分子遗传研究背景少 , 序列比对时有 43%的 EST没有对应功能的相似序列 , 这
是一些代表已经登陆 GenBank的未知功能蛋白或未登陆的新基因。因为花色花香代谢存在底物竞争 ,
亲本突变后 , 产生了花青素高而芳香物质减少的红花。这可能与 MYB类转录因子在两个材料中的表
达差异有关 , 而引起转录因子表达差异的原因还有待进一步研究。
表 1　差异表达克隆测序与 Bla st比对分析结果
Table 1　Fea tures of som e sequenced clones and results of Bla st search
克隆号
Clone
片段大小
Size
登录号
Accession
number
Score
E值
E2value 同源性Identity( % ) 同源序列DNA homology
JSSH0106 530 AF502434 959 0 99 月季间苯二酚 O - 甲基转移酶 OOMT2
Rosa hybrida cultivar orcinol O2methyltransferase (OOMT2) mRNA
JSSH0135 232 AJ489197 337 8e290 96 Beta nana Ty12cop ia2like 反转录转座子
Beta nana Ty12cop ia2like retrotransposon partial pol p seudogene
JSSH0179 316 AJ249833 143 3e231 86 毛地黄 acbp3基因
D igita lis lanata mRNA for Acyl2CoA binding p rotein ( acbp3 gene)
JSSH0194 455 DQ074474 180 2e242 91 苹果 Myb92
M alus ×dom estica Myb92 mRNA
JSSH0172 361 AY335817 56 7e205 81 陆地棉转醛醇酶
Gossypium hirsutum transaldolase mRNA
JSSH0231 323 AF502433 276 6e2153 99 月季间苯二酚 O - 甲基转移酶 OOMT1
Rosa hybrid cultivar orcinol O2methyltransferase (OOMT1) mRNA
JSSH0363 384 D49385 242 4e261 91 月季σ29脱饱和酶
Rosa hybrida mRNA for delta29 desaturase homologue
W SSH0261 581 AB038246 1 021 0 99 月季‘Kardinal’CHS
Rosa hybrid cultivar‘Kardinal’CHS mRNA for chalcone synthase
W SSH 262 591 AF022464 54 5e204 82 大豆 CYP77A3p
Glycine m ax cytochrome P450 monooxygenase CYP77A3p
W SSH0460 433 AY196776 129 8e227 85 小金海棠 Myb1
M alus xiaojinensis transcrip tion factorMyb1 mRNA
W SSH0475 506 AJ010423 131 2e227 83 大豆乙二醛酶 I
Glycine m ax mRNA for glyoxalase I
W SSH0150 538 X696440 119 9e224 89 大豆 ADR11
Glycine m ax ADR11 mRNA
3　结论与讨论
利用突变体分析和分离一些与次生代谢相关的基因已成为研究植物次生代谢分子机理的重要手
段。分析突变体与亲本遗传差异尽管可以运用 cDNA2AFLP法 (康俊根 等 , 2006) , 但是如果突变位
点没有引起酶切位点改变 , 利用该法筛选差异基因的可能性就很小。突变体和亲本表型差异明显 , 是
基因差异表达的结果 , 因而采用差异表达分析方法中最新的抑制性消减杂交法 , 分离差异表达基因是
非常可行的。
分离差异表达基因的方法很多 , 但基因表达连续分析法 ( Serial Analysis of Gene Exp ression,
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　3期 谢吉容等 : 月季突变体抑制差减杂交 cDNA文库构建及分析 　
SAGE) 具有假阳性率高、需要进行大量的引物筛选工作 , 得到的特异 cDNA 片段往往是 3′端的非编
码序列以及序列胶分析结果常呈弥散状态等不足之处 ; 有序差异显示 (O rdered D ifferential D isp lay,
ODD ) 具有平端连接效率低 , 工作量较大的缺点 ; 代表性差异分析 (Rep resentational D ifference Anal2
ysis, RDA) 无法解决低丰度 mRNA基因的克隆 (王广慧 , 2005)。而 SSH通过单链 Tester cDNA的消
减均等化 , 以及两轮抑制性 PCR使高低丰度的差异表达基因均能有效地进行分离 , 并可同时得到多
条片段 (D iatchenko et al. , 1996) ; 而且它设计巧妙 , 操作简便 , 初始 mRNA只需 1～2μg, 前后只
需 3～4 d, 即可得到 PCR扩增的差减 cDNA群体 ; 通过 T/A克隆建立 cDNA文库 , 从而方便以后的
筛选、鉴定等研究工作 , 具有假阳性少 , 重复性高等优点 , 并能对低丰度 mRNA进行显示 ; 这些是
其它分离差异表达基因方法所不具备的优势 (D iatchenko et al. , 1999)。目前利用 SSH法对植物材料
特别是次生代谢突变体研究以期分离相关的差异表达 cDNA片段还不多见。
植物花色是由花色素种类、助色素、液泡 pH值以及花瓣表皮结构等诸多因素决定的一个复杂性
状 , 花香是由多种挥发性小分子混合形成的使动物产生嗅觉的一个性状 , 花色代谢以及某些花香挥发
性物质形成都涉及大量基因的协同作用 , 因此对花色花香突变分子机理的研究需要选择能够同时对众
多基因的表达进行研究的高通量技术。 SSH结合微阵列技术由于具有以上优点 , 是该研究的首选技
术。但是 SSH法要求非常好的 RNA质量和一定的 RNA总量 (至少 200μg) , 才能保证低丰度的差异
表达基因能被检测。
本研究建立了月季花色花香突变体特异表达基因的正反 SSH文库。通过对正反向消减文库克隆
的测序和对这些基因的进一步表达分析 , 已经筛选出新的花色花香代谢调控基因 MYB1、MYB92转录
因子同源的 EST, MYB1、MYB92转录因子在月季上还没有相关研究。这为下一步克隆其 cDNA全长
和功能分析奠定了基础。
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