全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(8)：1147—1154
Acta Horticulturae Sinica
黄瓜属 Tyl—cop／a类逆转座子逆转录酶序列的克隆
及分析
江 彪，娄群峰，刁卫平，陈龙正，张万萍，陈劲枫
(南京农业大学园艺学院，作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095)
摘 要：根据 Tyl—copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物，通过 PCR扩增，从黄瓜属野生
种酸黄瓜 (Cucumis hystrix Chakr．)和栽培黄瓜 (Cucumis sativus L．)中均扩增出 260 bp左右的目标条带。
扩增产物经纯化后克隆于pGEM—T Easy质粒载体 ，选择阳性克隆，再经菌落 PCR鉴定，然后进行测序及序
列分析，获得了21条来源于酸黄瓜和栽培黄瓜的逆转录酶序列 ，通过核苷酸聚类分为5个家族。这些核苷
酸序列具有较高的异质性，主要表现为缺失突变，序列长度变化范围为 255～272 bp，同源性范围为
27．0％ ～98．1％。翻译成氨基酸后，有4条序列出现终止密码子突变，6条序列表现出移框突变。将这些
逆转录酶的氨基酸序列与已登录的不同物种同一类型逆转录酶的氨基酸序列进行聚类分析，表明它们可能
有共同的起源。
关键词：黄瓜；Tyl—copia类逆转座子 ；逆转录酶；异质性
中图分类号：S 642．2 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)08—1147-08
The Cloning and Analysis of Reverse Tran~criptase of Tyl·-cop／a·—like Retro·—
transposons in Cucumis
JIANG Biao，LOU Qun—feng，DIAO Wei—ping，CHEN Long—zheng，ZHANG Wan—ping，and CHEN Jin—
feng
(College ofHorticulture，Na ng Agricultural University，State Key Laboratory ofCrop Genetics and Germplasm Enhancement，
Ⅳn ng 210095，China)
Abstract：Using degenerate oligoncleotide primers corresponding to conserved domains of the Ty1一copia
retrantranspon reverse transcriptase，a fragment of 260 bp was amplified by PCR from Cucumis hystrix and c．
sativus．The amplicons were cloned into pGEM—T Easy vector after purification，positive clones selected and
identified by colony PCR，then sequenced and analyzed．Twenty—one different sequences of reverse tran—
scriptase from Cucumis hystrix and C．sativus ‘Beijing Jietou’were obtained．and five families were distin—
guished after cluster and alignment analyses of their nucleotide sequences． These sequences showed high
heterogeneity mainly characterized by deletion mutation．Th e length of the nucleotide sequences varied from
255 to 272 bp，and homology ranged from 27．0％ to 98．1％ ．When translated into amino acids．four se—
quences presented stop codon mutation，and six sequences presented frameshif mutation．The amino cluster
and alignment analyses of these sequences with other reverse transcriptase sequences from other accessions
showed that they may have the same origin．
Key words：Cucumis；Tyl-copia—like retrotransposons；reverse transcriptase；heterogeneity
收稿日期：2008—02—29：修回日期：2008—05—12
基金 项 目：国家 自然 科 学基金 项 目 (30671419；30700541)；国家 高技 术 研究 发展 计 划专项 项 目 (2006AA100108；
2006AA10Z108)；教育部高校博士点青年教师基金项目 (20070307034)
通讯作者 Author for corespondence(E—mail：jfchen@njau edu．cn)
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1148 园 艺 学 报 35卷
逆转座子 (retrotransposon)是真核生物中种类最多、分布最广的转座因子，其特殊的转座方式
使其成为植物核基因组的重要组成部分，通常占DNA总量的一半以上 (Kumar&Benne~en，1999)，
有的物种如玉米中逆转录转座子甚至占到核基因组的70％ ～85％ (Bevan et a1．，1998)，在普通小麦
中甚至高达90％以上 (Flavel，1986)。由于逆转座子在基因组中的重要地位，其序列的克隆与分析
研究对于植物基因组组成、进化与基因的表达调控研究均有重要的意义。
逆转座子包括长末端重复逆转录转座子 (1ong terminal repeat，LTR)和非长末端重复逆转录转座
子 (non-long terminal repeat，non．LTR) (Kumar，1996；Grandbastien，1998)。LTR又可分为 Tyl—CO—
pia类和 Ty3-gypsy类 (Voytas et a1．，1992；Suoniemi et a1．，1998)，其中 Tyl-copia类在植物界广泛
分布，是研究最多的一类 (Flavel et a1．，1992)。
迄今已在多种主要作物中研究分析了逆转座子的种类和组成 (Pearce et a1．，1996；Rogers&
Pauls，2000；Alix et a1．，2005)。目前黄瓜属中关于逆转座子的研究很少。作者最近克隆获得了Tyl-
copia类逆转子的LTR区序列，并开发出了黄瓜属基于Ty1．copia-LTR的SSAP标记系统 (Lou&Chen，
2007)。而有关该逆转座子具转录活性的部分，即逆转录酶序列尚未见报道，而逆转录酶序列的分离
克隆是深入研究逆转座子是否具有转录活性的关键。
作者以Tyl-copia类逆转录酶的保守序列设计简并引物，采用 PCR方法进行黄瓜属植物逆转录酶
序列的分离克隆，首次从黄瓜属植物基因组 DNA中分离克隆了Ty1．copia类逆转座子部分逆转录酶序
列，并通过序列分析初步研究其变化特点。
1 材料与方法
1．1 试验材料
共选用了黄瓜属中的6个材料。一个为黄瓜属珍稀野生种——酸黄瓜 (Cucumis hystrix Chakr．，
2n：24)，与栽培黄瓜的杂交亲和，采集于云南西双版纳 (Chen et a1．，1997)。其余 5个均为栽培黄
瓜 (Cucumis sativus L．)，其中 ‘北京截头’由中国农业科学院蔬菜花卉研究所戚章春研究员提供，
经本实验室多代自交保存； ‘长春密刺’购于新疆农业科学院园艺研究所，经本实验室多代自交保
存；‘翠玉’、‘津春’和 ‘津绿’等购自南京市蔬菜种子公司。
1．2 DNA提取及逆转录酶扩增
植株长至第 5片真叶时，取刚展开的新叶，采用 CTAB法 (Murray&Thompson，1980)提取基
因组 DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭显色进行 DNA浓度的定量。
参照文献 (Kumar et a1．，1997)设计逆转座子的逆转录酶引物。上游引物为：5 ．ACNGCNTYPy．
PyTNCAPyGG一3 ；下游引物为5 -APIlCATPuTCPuTCNACPuTA．3 ，其中N：A+T+C+G，Py=A+G，
Pu=T+C。
PCR反应体系为：DNA 20 ng，0．2 mmol·L。。dNTPs，2．0 IxL 10×Bufer(含 MgC12)，1 U的
Taq DNA聚合酶 (购自TaKaRa公司)，加双蒸水至20 。
扩增程序为：94 oC 1 min；94 oC 1 min，45 oC 1 min，72 oC 1 min，40个循环；最后72℃延伸7
min；整个 PCR反应在 PTC．100TMpcR仪上完成。
1．3 PCR产物的回收、克隆及转化
用 1％琼脂糖凝胶检测 PCR产物，并从凝胶上回收酸黄瓜和 ‘北京截头’两种材料的PCR扩增
产物，用 Bio Spin胶回收试剂盒回收。
回收产物经纯化后连接于 pGEM．T Easy载体 (Promega)上，转化大肠杆菌 DH5ot感受态细胞，
37℃培养16～20 h后，蓝白斑筛选，挑取白色单克隆，在含有100 mg·L 氨苄青霉素的LB液体培
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8期 江 彪等 ： 黄瓜属 T yl一 copia 类逆转座子逆转录酶序列 的克隆及 分析
养基 中培养过夜后 ， P C R 鉴定 阳性 克隆 。
1 ． 4 逆转录酶序 列测定及序 列分析
将鉴定为 阳性 的菌液送 往上 海英骏生 物技术有 限公 司测序 。 利用 D N A S tar 和 D N A M A N 软件对 获
得 的逆转录酶序列进行分析 。
2 结果与分析
2． 1 P C R 扩增 结果 、 重 组 质粒的鉴定及 测序
以逆转座子逆转录酶 区域保守位点设计引物 ， P C R 结果表明 ， 在酸黄瓜 和 5 个栽培黄瓜 中均检测
到 了逆转 录酶序列 ， 长度 一 致 ， 均为 260 bp 左右 (图 1 )， 这与前人 的报道 (V oytas et a1． ， 1992 ) 一
致 ， 表 明 T yl． copia 类逆转座 子在酸黄瓜 和栽培黄瓜 中普遍存在 。
图 1 酸 黄瓜 和 5 种 栽培黄瓜 中逆 转录酶序 列 的 P C R 扩增
M ． M arker ； 1 ． 酸 黄瓜 ； 2 ． 北 京截头 ； 3 津春 ； 4 ． 津绿 ； 5 ． 翠玉 ； 6 ． 长春密刺
F ig． 1 P C R am plification ofreverse transcriptase from C ucum is hystrix C hakr．
and five species ofC ucum is sativus L ．
M ． M arker； 1 ． C ucum is hystrix ； 2 ． B eijing J ietou ； 3 ． J in ehun ； 4 ． J inlti；
5 ． C uiyu ； 6 ． C hangchu n M ici．
将 以 酸黄瓜 和栽培黄瓜 ‘ 北 京截头 ’ 为模板扩增 得 到 的 260 bp 左 右 的片段 回收纯 化 ， 克隆测 序
后 ， 共得 到 21 条不 同 的序列 ， 其 中 6 条来 自酸 黄瓜 (编 号 以 C hrt 开 头 )， 15 条来 自 ‘ 北 京 截头 ’
(编号以 C srt开头 )， 均与已报道 的其它物种 的 R T 保守 区 域吻合 。
2． 2 T yl- cop／a 类逆转 录 酶的异质性
所有 21 条序列均与 已知植物 T yl- copia 类逆转座子 的逆转录酶序列有很高的同源性 ， 说 明其逆转
座子是真实的 。
这些 序列 已 提 交 到 G en B ank 中 ， 登 录号 分别 为 ： E U l62101 ～ E U l62106 、 E U l62109 ～ E U l62122
和 E U l62124 。 所有序列 富含碱基 A T ， A T 与 G C 的 比例范围为 1 ． 02 ～ I ． 83 ， 与 S tergiO U 等 (2002) 的
试验结果 一 致 。
21 条逆转录酶 的核苷酸序列 变化 范 围为 255 ～ 272 bp (表 1 )。 而 前 人 的研 究结果 表 明该 序列 长
度为 273 bp (V oytas eta1． ， 1992)， 21 条序列 长度均少 于 273 bp， 都有不 同程度的缺失 ， 说 明缺失是
造成黄瓜逆转录酶序列长度变化 的主要原 因 。
从表 2 可 以看 出 ， 酸黄瓜 中逆转 录酶序列 间 同源 性范 围为 27 ． O ％ ～ 57 ． 6％ ， 北 京 截头序列 间为
30． 1％ ～ 98． 1％ ， 两 者所有序列 间 同源 性 范 围为 27 ． 0％ ～ 98． 1％ 。 由此 可看 出 ， 由同 一 简 并 引物 获
得的逆转座子 的逆转录酶序列并不 完全 一 致 ， 它们在长度 、 碱基 变化上 的多态性表 明黄瓜属 同一 类逆
转座子存在高度 的异质性 。
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1150 园 艺 学 报 35卷
表1 黄瓜中逆转录酶序列的组成
Table 1 Base composition of leYel~e transcriptase in cucumber
表2 黄瓜中逆转录酶的序列差异百分率 (左下方)和同源性 (右上方)
Table 2 The divergence(below the diagona1)and percent identity(above the diagona1)
of reverse trancriptase in cucumber
chrtl chrt2 chrt3 chrt4 chrt5 chrt6 esrtl csrt2 csrt3 csrt4 csrt5 csrt6 csrt7 csrt8 csrO csrtl0 csrtl l esrtl2 csrtl3 csrtl4 csrtl5
l 41．3 34．0 48．9 33．8 37．6 56．9 87．6 50．6 49．6 90．6 33．0 54．9 49．2 55．6 54．948．9 48．1 49．2 87．2 90．6
2 112．1 39．0 45．5 35．2 57．6 41．2 42．0 46．2 34．5 42．4 35．2 42．4 45．1 42．8 41．34-4．7 36．7 45．5 40．9 42．0
3 l55．1 l23．1 35．5 27．0 43．2 35．5 34．4 34．4 34．7 32．8 46．7 37．5 34．4 36．7 36．335．1 34．0 34．7 32．4 32．0
4 84．2 96．9 l43．4 33．3 44．6 42．7 47．9 96．2 53．9 49．4 36．0 41．6 95．1 41．2 40．496．6 53．9 96．3 47．6 49．1
5 l60．4 145．6 257．1 167．4 36．6 31．9 34．7 34．0 37．7 35．8 29．9 33．3 33．7 33．2 32．534．0 39．7 33．7 34．1 34．4
6 l31．0 63．2 l03．3 103．0 l34．2 43．1 38．4 43．8 34．0 39．9 34．9 48．1 41．9 48．9 47．442．5 35．2 43．1 36．9 38．8
7 63．3 l15．7 146．2 l07．0 220．0 l05．5 58．1 42．7 4-4．6 57．3 36．2 51．2 42．3 52．7 51．243．8 42．7 42．7 58．5 56．9
8 l3．7 l08．4 l52．0 87．7 l51．5 l29．3 60．4 48．3 46．6 88．4 33．0 53．0 48．7 53．0 52．248．9 45．7 49．1 92．2 88．1
9 79．6 94．6 l52．3 3．9 l64．1 104．5 l07．1 86．5 50．4 50．6 35．2 40．4 95．5 40．4 39．695．8 54．0 96．2 48．3 5O．6
l0 82．6 l55．1 l49．2 74．9 l33．3 l75．0 l00．2 94．3 73．5 49．3 33．3 40．1 53．6 39．6 37．754．5 93．3 54．7 48．9 49．6
l1 10．2 l()6．9 165．0 83．0 l44．1 l20．0 62．7 l2．8 79．6 86．4 30．1 52．2 50．2 53．0 51．150．0 49．8 50．2 86．9 97．8
12 164．0 l48．8 93．9 l40．2 l98．1 l48．5 l47．6 l66．6 145．4 l61．7 l84．0 31．0 35．2 30．3 29．935．6 33．0 36．0 32．2 30．7
13 68．1 l07．3 l31．5 1l6．4 l65．0 89．2 77．9 73．8 l20．0 l36．4 76．2 241．4 40．4 97．8 98．141．8 37．8 40．1 51．9 51．9
l4 83．0 98．9 l51．9 5．1 l61．7 l14．9 l08．7 85．3 4．7 75．9 80．7 145．4 l21．7 40．4 40．195．5 54．7 96．3 49．8 50．9
l5 66．1 l05．6 l35．9 1l8．0 l61．9 86．6 73．7 75．8 120．0 l27．1 74．0 247．8 2．3 l21．7 97．841．4 38．2 39．7 52．2 51．5
l6 68．1 l】2．3 l38．3 l22．1 168．4 91．7 77．9 75．9 l23．5 l38．5 79．4 251．4 1．9 l23．1 2．3 40．7 37．1 39．3 51．9 50．7
l7 84．2 99．5 146．3 3．5 l58．7 113．2 l02．3 85．3 4．3 73．7 81．8 l52．7 l15．9 4．7 l】7．6 l21．5 55．1 97．4 48．1 48．9
l8 87．7 l42．0 l57．6 74．7 l19．7 l56．7 l08．1 97．2 73．3 7．2 83．0 163．6 l36．2 72．5 l33．7 l41．471．3 54．7 46．8 49．4
l9 83．0 96．9 l49．5 3．9 l62．8 110．0 l06．9 84．2 3．9 72．9 80．7 140．2 l23．3 3．9 l25．2 l27．1 2．7 72．4 49．1 50．2
20 l4．2 l14．5 l68．4 89．0 l54．4 l38．5 59．7 8．4 86．5 88．2 l4．7 l72．7 78．2 81．9 76．0 77．187．7 93．9 84．1 87．8
2l l0．1 l08．6 l72．5 84．2 l51．9 l26．2 63．5 l3．2 79．6 86．2 2．3 l88．5 78．3 78．5 78．3 80．785．4 84．5 80．7 l3．7
}1：chrtl；2：chrt2；3：chrt3；4：chrt4；5：chrt5；6：chrt6；7：csrtl；8：csrt2；9：csrt3；10：csrt4；11：csrt5；12：csrt6；13：csrt7；
14：csrt8；15：csrO；16：csrtlO；17：csrtl1；l8：csrtl2；19：csrtl3；20：csrtl4；21：csrtl5．
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8期 江 彪等：黄瓜属 Tyl—copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析
2．3 逆转录酶的核苷酸序列和氨基酸序列分析
为阐明黄瓜中Ty1．copia类逆转座子间的相互关系，利用 DNAStar对分离到的21条逆转录酶序列
进行聚类分析，构建黄瓜中该类逆转座子的系统发育进化树 (图2)。
根据进化树 branch的长度将把这 21条 RT序列分成 5个家族 (Familyl～5)，代表由同一祖先而
来的遗传家系。其中Family5只有一个序列，把它各自单独列为一族，与其余家族的遗传距离较大。
Familyl、Family2和 Family3分别包括5个、4个和9个序列，这3个家族约占克隆总数的86％，说明
这3个家族是构成黄瓜逆转座子的主要成分。
160 140 120 lO0 80 60 40 2O
核苷酸代换 (×100)
NuGleotide substitutions
图2 黄瓜逆转录酶序列进化树
Fig． 2 Phylogenetic tree of seqences of reverse transcriptase in cucumber
Family2
Gsn1 5 }
Ghrtl
Gsrt2
~srtl4 F
amilv3
Gsrt7 I
Gsrt10 I
csrt9 I
I
Gsrtl
csrt4 ]
csnl2-『I F i y
Ghrt5 ——Family5
将这21个逆转录酶翻译氨基酸，参照Tyl-copia类逆转座子逆转录酶基因的氨基酸保守序列，在
翻译过程中有 6条序列发生了移框突变，分别是：chrt3(第 39个氨基酸处)、chrt6(第48个氨基酸
处)、csrtl(第 57个氨基酸处)、csn7(第 37个氨基酸处)、csrt9(第 37个氨基酸处)、csrtl0(第
37个氨基酸处)。有4条序列即 chrt3、chrt5、chrt6和 csrt3发生了终止密码子突变，其中chrt3在第
25、26、57、62和72个氨基酸处发生了5个终止密码子突变；chrt5在第 76个氨基酸处发生了 1个
终止密码子突变；chrt6在第75个氨基酸处发生了 1个终止密码子突变；csrt3在第 23个氨基酸处发
生了1个终止密码子突变 (图3)。因此推测，移框突变和终止密码子突变也可能是逆转座子异质性
的重要原因
∽
C C C C C C C C C C
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l152 园 艺 学 报 35卷
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图3 黄瓜中逆转录酶氨基酸序列比较
终止密码子；“．”为优化联配而产生的缺口；下划线的氨基酸为移框翻译的位点。
Fig．3 The amino sequence alignment of reverse transcriptanse in cucumber
Stop code；“．’’Gaps introduced for optimal alignment；
Frameshifi mutations are undedined．
从 GenBank中搜索到已登录的来源于不同生物的逆转录酶的氨基酸序列，与作者从黄瓜属中克
隆的2l条逆转录酶的氨基酸序列用 DNAMAN软件构建有根进化树 (图4)。结果显示作者所克隆到
的逆转录酶氨基酸序列与苹果、马铃薯、番茄、拟南芥、水稻等有较高的同源性。
图4 黄瓜与其它植物部分逆转录酶的氨基酸序列的进化树
Fig．4 Phylogenetic tree of anuno sequences of partial reverse transcriptase in cucumber and other accessions
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8期 江 彪等：黄瓜属Tyl—copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析 1 153
3 讨论
本研究首次对黄瓜属植物中的Tyl—copia类逆转座子逆转录酶序列进行 PCR扩增，从野生种酸黄
瓜和五个栽培黄瓜中均扩增出260 bp左右的目标片段，说明Tyl—copia类逆转座子在黄瓜中广泛存在。
逆转座子的增殖方式是以DNA—RNA—DNA的方式依靠其 自身携带的逆转录酶进行的，由于该酶没
有校对功能，其碱基错配率比 DNA聚合酶高 10 000倍以上，此外寄主的防御机制也会促使逆转座子
变异，因此在长期进化过程中，逆转座子形成了高度异质性的群体 (Steinhauer&Holand，1986)。
从酸黄瓜和栽培黄瓜 ‘北京截头’中获得了21条逆转录酶序列，这些序列表现出很大的变异性，其
核苷酸序列变化范围为255～272 bp，而前人的研究结果表明该序列长度为 273 bp(Voytas et a1．，
1992)，说明黄瓜中Tyl—copia类逆转座子存在缺失突变；翻译成氨基酸后，6个序列发生了移框突
变，4个序列发生了 1～5个不同程度的终止密码子突变。因此缺失突变、移框突变以及终止密码子
突变可能是造成逆转座子异质性的重要原因。
分析黄瓜中所获得的21条逆转录酶序列的同源性 ，可将它们分为5个家族。不同家族含有的逆
转录酶序列数不同，反应了各家族逆转座子转座过程的差异，家族内所含克隆数越多，表明该家族存
在的历史越久远，其逆转座子具有转座活性的可能性就越大。
逆转座子在植物界的广泛分布及其序列的高度异质性表明，逆转座子在早期的植物中已出现，是
一 个较为古老的转座元件。作为基因组的成分之一，它们能在世代间遗传给下一代 (Doolitle et a1．，
1989)。此外，逆转座子还可在物种间进行横向传递 (Kumar，1998)。通过与其它作物逆转录酶的氨
基酸聚类分析 (图4)，发现黄瓜 Tyl—copia类逆转录酶与苹果、马铃薯、番茄、拟南芥、水稻等其它
植物有较高的同源性，表明它们可能有共同的起源，这可能是不同物种间逆转座子横向传递的结果，
进一步说明了生物界有共同的起源。
本实验室利用黄瓜属野生种酸黄瓜与栽培黄瓜杂交获得了许多种间材料，下一步将利用本研究中
获得的酸黄瓜逆转录酶序列为探针进行原位杂交，研究酸黄瓜的染色体片段在这些种间中间材料中的
分布，这对于基因组组成、进化及优良基因发掘将具有重要意义。
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l154 园 艺 学 报 35卷
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中国园艺学会番茄分会
2008年年会通知
中国园艺学会番茄分会 2006年8月在沈阳召开了首次会议，参会 62人；2007年9月在合肥召开了第二次年会，
参会 123人。经研究，决定于今年 10月 30日至 11月 1日在广东省珠海市召开中国园艺学会番茄分会2008年年会。
1．会议时间和地点
10月 30日 (星期四)全天报到，31日全天会议交流，1日上午离会。会议地点暂定珠海市石景山大酒店。请计
划参加会议的人员务必在 8月 31日前与会议联系人联系，以便安排食宿和告知最后选定的酒店信息。
2．会议内容
(1)围绕番茄遗传资源与育种、栽培生理与栽培技术、采后处理与流通、种子生产与经营等内容进行研讨和交
流。会议采用多媒体形式大会交流，每人发言 10—15分钟。
(2)召开分会理事会，商定2009年年会的举办地点。
3．参会人员
科研院所、大专院校 、生产管理和技术推广部门以及企业中从事番茄科研 、生产、流通的有关科研与技术人员
(包括研究生)、管理与经营人员。特别欢迎企业的人员参加。
4．会议费用
参会人员每人会务费500元，住宿统一安排，费用自理。
5．会议组织
组织单位：中国园艺学会番茄分会；承办单位：广东省农业科学院蔬菜研究所。
6．会议联系单位及联系人：
广州市五山广东省农业科学院蔬菜研究所，邮编：510640；
黎振兴 ：020—38469456；13922793784；E—mail：lizhxgaas@163．con；
李庆怀 ：020—38469427；13503093659；E—mail：vrigaas@163．con；传真：020—38469605，020—38469591。
北京市中关村南大街 12号，中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ，邮编：100081；
王孝宣 ，010-68919538，E—mail：wxxlhy@yahoo．con．cn；
国艳梅 ，010-68919538，E—mail：yanmeiguo@163．con；传真：010-62174123；010-62146160。
中国园艺学会番茄分会
广东省农业科学院蔬菜研究所
2008年 6月 25日
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