全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 794～800
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 08 - 01; 修回日期 : 2005 - 12 - 01
基金项目 : 国家 ‘973’资助项目 ( G19990160) ; 国家自然科学基金资助项目 (3057157) 资助3 表示同等贡献3 3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lwqi@caf1ac1cn)
欧洲山杨一号染色体显微分离、原位杂交分析及特
异文库的构建
张守攻 13 　张　勇 1, 23 　刘　博 2 　李秀兰 2 　宋文芹 2 　韩素英 1 　齐力旺 13 3
(1 中国林业科学院林业研究所细胞生物学实验室 , 北京 100091; 2 南开大学生命科学学院 , 天津 300071)
摘 　要 : 以欧洲山杨 ( Populus trem ula) 根尖细胞为材料 , 采用玻璃针分离法 , 通过显微操作器成功地
分离出一号染色体。将分离到的单条染色体去蛋白、Sau3A酶切 , 并在染色体 DNA片段两端加上 Sau3A人
工接头 , 进行两轮 PCR扩增 , 得到了 200～3 000 bp的 DNA扩增片段。以 D IG2dUTP标记的欧洲山杨基因
组 DNA为探针进行 Southern杂交 , 结果表明显微分离出的染色体扩增片段与欧洲山杨基因组 DNA同源 ,
从而证明一号染色体 DNA确实已被成功地扩增。以一号染色体第 2轮 PCR产物为探针进行荧光原位杂交 ,
发现荧光信号较密集的分布于一号染色体 , 但同时荧光信号也出现在其它染色体的着丝粒及端粒区域。对
第 2轮 PCR产物进行克隆 , 构建单条染色体 DNA文库 , 经分析 , 该微克隆文库包含约 3 ×105 个重组子。
随机挑选 160个重组子进行鉴定 , 证明该文库的插入片段主要介于 230～2 200 bp之间 , 平均 800 bp。该文
库的构建为欧洲山杨 1号染色体特异探针的筛选、遗传图谱的构建、重要基因的克隆等研究奠定了基础。
关键词 : 欧洲山杨 ; 染色体 ; 显微分离 ; 特异性文库 ; 荧光原位杂交
中图分类号 : S 67811　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420794207
M icrod issection, in S itu Ana lysis and M icroclon ing of Poplar Chrom osom e 1
Zhang Shougong13 , Zhang Yong1, 23 , L iu Bo2 , L i Xiulan2 , SongWenqin2 , Han Suying1 , and Q i L iwang13 3
(1 L aboratory of Cell B iology, the Research Institu te of Forestry, the Chinese A cadem y of Forestry, B eijing 100091, China;
2 College of L ife Sciences, N ankai U niversity, T ian jin 300071, China)
Abstract: This study was performed to establish a method for single chromosome m icrodissection and m i2
crocloning in forest p lants using pop lar ( Populus trem ula) as a model. An individual chromosome 1 was m i2
crodissected from the metaphase sp reads of pop lar root2tip cells with the fine glass needle controlled by a m i2
cromanipulator. The dissected chromosome was amp lified in vitro by the S au3A linker adap tor mediated PCR
technique, by which 200 bp to 3 000 bp smear DNA fragments were obtained. Southern hybridization result
showed the PCR p roducts from the single pop lar chromosome were homogeneouswith the pop lar genom ic DNA ,
indicating thatDNA from the single chromosome has been successfully amp lified. Then, he second round PCR
p roducts were used as a comp lex p robe m ixture for fluorescent in situ hybridization ( F ISH) on the metaphase
sp reads of pop lar. Hybridization signals were observed, mainly, along the entire chromosome 1, at the same
time, signals were also p resent on telomeric and centromeric regions of other chromosomes. The second round
PCR p roducts from the single chromosome 1 were cloned into T2easy vectors to generate a DNA library of the
chromosome 1. App roximately 3 ×105 recombinant clones were obtained. Evaluation based on 160 random ly
selected clones showed that the sizes of the cloned inserts varied from 230 bp to 2 200 bp with an average of
800 bp. This library will facilitate specific p robe screening, molecular map construction, gene tagging and
gene cloning on this chromosome.
Key words: Populus trem u la; Chromosome; M icrodissection; Chromosome specific DNA library; Fluo2
rescent in situ hybridization
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　4期 张守攻等 : 欧洲山杨一号染色体显微分离、原位杂交分析及特异文库的构建 　
杨树是重要的用材树种 , 并在城市道路绿化中具有防沙滞尘功能 , 因此也是园林绿化的首选树
种。杨属 ( Populus) 植物由于具有基因组构成精简 〔单倍体 ( n = 19) 约含 500 ±20 Mbp〕; 物种丰
富 , 分布广泛 ; 遗传转化容易 , 再生能力强 , 易于无性繁殖 ; 已构建相对饱和的各种连锁图 , 获得大
量与目标性状相关的分子标记等生物学特性 , 成为研究木本植物的首选模式物种〔1～3〕。自 2002年起 ,
美国能源部 (US Department of Energypis Office, DOE) 下属的 “基因组研究合作 ”项目组 (Joint Ge2
nome Institute, JGI) 与多家研究机构启动了杨属植物基因组计划。目前 , 已覆盖全基因组 715倍 , 完
成了 418 G碱基的测序任务。
由于杨树染色体识别与分离的困难 , 杨树基因组计划采用以杨树基因组总 DNA建立基因文库的
方案 , 采用 “全基因组鸟枪法 ” (A whole2genome shotgun app roach) 进行测序 , 与人类基因组计划采
取的分离纯化单条染色体建库的策略有相当大的差距。以总 DNA 建库的方法前期工作容易获得大量
克隆片段 , 读出杨树基因组全部核苷酸顺序 , 但后期确定某一片段在染色体上的位置及克隆功能基
因 , 会遇到很大困难。由于其文库容量多达数百万个重组子 , 加上不同克隆片段之间可能出现部分同
源性 , 有不少筛选工作会没有结果。因此 , 构建杨树基因组单条染色体和特定区 DNA文库 , 筛选每
条染色体特异性分子标记 , 对推进杨树基因组计划的进程具有重要理论意义和应用价值。
作者在对欧洲山杨 ( Populus trem u la) 染色体识别的基础上 , 对欧洲山杨一号染色体进行了显微
分离、Southern杂交与染色体荧光原位杂交 , 结果表明 , 显微分离出的单条染色体扩增片段与欧洲山
杨基因组 DNA同源。以接头介导的 PCR (L inker adap tor mediated PCR, LA2PCR ) 微克隆方法对其进
行克隆 , 建立了一号染色体特异文库 , 并对该文库进行了分析。
1　材料与方法
取中国林业科学院杨树种质资源圃提供的欧洲山杨 ( Populus trem ula ) 一年生枝条 , 70%乙醇消
毒 , 25℃培养箱中水培养。采用宋文芹等〔4〕和张守攻等〔5〕的去壁低渗法制备欧洲山杨染色体标本。
111　一号染色体显微切割
确定分离的细胞后 , 首先进行核型分析 , 确定染色体序号。显微分离的仪器为经作者改装的安装
在防震台上的液压传动式显微操作仪 (Narishige, Japan)。用硅化的直径 015μm 左右的微细玻璃针
将分离的染色体直接放在微量离心管底部 , - 20 ℃保存备用。具体操作方法参照文献 〔6〕。
112　单染色体 PCR扩增
制备 Sau3A 接头所用的两个引物 (24个碱基和 10个碱基的寡核苷酸片段 ) 由上海 Sangon公司
合成 , 序列分别为 : LA2PCR224: 5pi2CGGGAATTCTGGCTCTGCGACATG23pi; LA2PCR210: 5pi2GATCCAT2
GTC23pi。接头的制备参照文献 〔7〕进行。
单染色体 DNA 的限制酶酶切、接头连接、PCR扩增按文献 〔6, 8〕的方法进行。为了避免外源
DNA 的污染 , 整个单染色体体外扩增操作过程均在无菌条件下进行 , 并设立严格的不含染色体 DNA
的阴性对照和以 1 pg基因组 DNA为模板的阳性对照。
113 　Southern杂交分析
欧洲山杨基因组 DNA的提取和纯化采用 CTAB方法〔9〕。DNA的纯度和浓度用 018%琼脂糖凝胶
和 ND21000分光光度仪 (NanoD rop, America) 检测。取适量的基因组 DNA用 EcoR I于 37℃酶切过
夜 , 与染色体 LA2PCR产物进行 018%琼脂糖凝胶电泳 , Southern印迹过程参考文献 〔10〕。以 EcoR I
酶切并经 D IG2dUTP随机引物标记法标记的欧洲山杨基因组 DNA为探针进行 Southern杂交 , 具体杂
交、检测过程详见 Roche D IG H igh Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ说明。
114　荧光原位杂交分析
通过随机引物法用 D IG (D igoxigenin2dUTP, Roche) 标记的第 2轮 PCR产物作为探针 , 在欧洲山
杨根尖有丝分裂中期染色体标本上进行原位杂交。杂交及杂交后的信号按 Zhang等〔11〕的方法检测。
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115　染色体特异性文库的构建及分析
单染色体的第 2轮 LA2PCR产物 (50μL) 采用 UN IQ210柱纯化 ( Sangon, 上海 ) , 溶于 50μL无
菌水。取 2μL与 T2Vector ( Sanong, 上海 ) 16℃连接 16 h, 1 /10连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受
态细胞。100μL涂布于含 IPTG、X2gal和 Amp的 LB平板上 , 37℃培养过夜 , 筛选重组克隆。随机挑
选 160个白斑克隆 , 碱裂解法制备质粒 DNA , 用载体上 M13正 /反向通用引物进行 PCR扩增。115%
琼脂糖凝胶电泳检查 PCR产物 , 与已知浓度和大小的 DNA标准比较 , 估算插入片段的大小和浓度。
2　结果与分析
211　欧洲山杨染色体观察及目标染色体的确定
采用改进的去壁低渗法制片〔4, 5〕, 获得了分散良好的中期染色体分裂相 (图 1)。观察了 20个不
同根尖的细胞染色体 , 结果表明欧洲山杨基因组含 19对同源染色体 , 2n = 2x = 38。
图 1　欧洲山杨中期分裂相 ( A) 及核型图 ( B)
F ig. 1　 Image of Popu lus trem u la soma tic m etapha se chrom osom es ( A) and the karyotype ( B)
图 2　欧洲山杨一号染色体微分离
箭头示一号染色体
F ig. 2　Procedure of isola tion of an ind iv idua l chrom osom e 1 ( ind ica ted by arrow head) in poplar
212　欧洲山杨一号染色体的显微分离
杨树染色体较小 , 前中期染色体长度 0133～212μm , 大多数相邻染色体之间差异不显著 , 因此
染色体识别比较困难。欧洲山杨一号染色体为最大的 1对中着丝粒染色体 , 在 100 ×油镜下可清晰分
辨。选择分散良好的中期染色体分裂相 , 确定适于分离的目标染色体。
将制好的微细玻璃针固定于操作动力臂上 , 用改装的显微镜镜台推进器 XY轴 , 调节微切针至待
分离染色体的大约位置 , 操纵显微操作器的微调螺旋杆 , 使玻璃针对准待分离的染色体 , 换成 100 ×
油镜 , 在目镜视野监视下进行染色色体分离 , 将黏附有目标染色体的玻璃针尖折断于 015 mL
Eppendorf管底。图 2显示从 1个分裂相中分离单条染色体的过程。
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　4期 张守攻等 : 欧洲山杨一号染色体显微分离、原位杂交分析及特异文库的构建 　
213　欧洲山杨一号染色体的 LA2PCR扩增及 Southern杂交分析
将分离的一号染色体置于 015 mL Eppendorf管中 , 每管 1条 , 经蛋白酶 K消化 , Sau3A酶切 ,
S au3A接头连接 , 并经两轮 PCR扩增 , 结果如图 3, A所示。首轮扩增后 , 可见有微量的 DNA散布
在泳道中 , 扩增产物大小从 200～1 500 bp不等。第 2次扩增后 , 电泳信号明显增强 , 弥散形的条带
在泳道中清晰可见 , DNA片段长度大约在 200～3 000 bp之间 , 且在 300～1 200 bp范围内信号相对
集中。以基因组 DNA为模板的阳性对照亦能扩增出类似的 DNA, 而在阴性对照中无扩增产物 , 表明
在整个微切和 PCR扩增过程 , 虽涉及到大量的酶切、连接反应 , 但并未带来明显的外源 DNA污染。
欧洲山杨一号染色体二轮扩增产物及阴性对照、阳性对照二轮扩增产物与经 EcoRⅠ消化的杨树
基因组 DNA电泳。转膜后 , 与 D IG2dUTP标记的杨树基因组 DNA探针进行杂交 , 发现杨树基因组
DNA、阳性对照及一号染色体的扩增产物均出现了明显的杂交信号 (图 3, B)。与此同时 , 阴性对照
则无任何杂交信号 , 说明单条染色体的扩增产物确实来自杨树基因组。
图 3　欧洲山杨一号染色体的 LA2PCR扩增 ( A) 及 Southern杂交检测 ( B)
M: DNA marker; 1～3: 一次扩增 , 4～6: 二次扩增 (1, 4: 阴性对照 ; 2, 5: 一号染色体 ; 3, 6: 阳性对照 ) ; 7: 基因组酶切产物。
F ig. 3　LA2PCR am plif ica tion w ith m icrod issected chrom osom es 1 ( A) and southern blot hybr id iza tion ana lysis ( B)
M: DNA marker; 1 - 3: The first round PCR, 4 - 6: The second round PCR (1, 4: Negative control; 2, 5: The single chromosome 1
as DNA temp late; 3, 6: The positive control used 1 pg genom ic DNA as temp late) ; 7: EcoR I2digested genom ic pop lar DNA).
图 4　染色体荧光原位杂交结果
A: 一号染色体二轮 LA2PCR产物为探针的 F ISH结果 ; B: 染色体 DAP I复染结果。
F ig. 4　Result of F ISH using m icrod issection am plif ica tion products a s probe
A: Metaphase sp read hybridized with labeled LA2PCR p roducts of chromosome 1; B: The chromosomes staining with DAP I.
A rrows indicate the chromosome 1.
214　PCR产物的荧光原位杂交分析
由于 Southern杂交的结果仅能证实扩增产物来自原基因组 , 没有提供直接的证据证实扩增产物是
来自原分离染色体。本研究用 D IG2dUTP标记的第二轮 PCR产物作为探针 , 在欧洲山杨根尖细胞有丝
分裂中期染色体标本上进行原位杂交。如图 4所示 , 分裂相中的两条一号染色体均出现明显的黄色杂
交信号 , 信号均匀分布于整条染色体上 , 色彩均匀 , 未见背景干扰。初步证实扩增产物来自被分离的
染色体 , 而不是来自基因组的其它染色体。同时 , 在其它染色体着丝粒及端粒区域也可检测到一定强
度的杂交信号 , 说明这些部位存在一号染色体的同源重复序列。
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215　单染色体文库的特性分析
回收纯化并克隆目标染色体的第二轮 PCR产物 , 转化大肠杆菌 , 得到 3 ×105 个重组克隆。随机
挑选 160个白斑克隆子 , 碱裂解法小量制备质粒 DNA , 用载体上的 M13正 /反向通用引物进行常规
PCR扩增。结果如图 5所示 , 插入片段大小为 220～2 300 bp , 平均长度 800 bp。
图 5　部分重组克隆子的 M 13正 /反向通用引物 PCR扩增结果
M: DNA marker; CK: 阴性对照 ; 1～15: 克隆样品。
F ig. 5　Partly electrophoresis result of am p if ied clon ing fragm en ts by PCR using M 13 forward /reverse pr im ers
M: DNA marker; CK: Negative control; 1 - 15: PCR p roducts of posive clone.
3　讨论
311　杨树高质量染色体标本制备及显微分离
高质量染色体标本的制备是影响染色体显微分离成功与否的重要因素。因此 , 在制备染色体标本
时 , 力求染色体分散好 , 收缩程度适中 , 染色清晰。杨树根尖细胞含较浓的细胞质 , 在染色体制片过
程中如果不能很好地去除细胞质的影响 , 很容易在显微分离过程中把其它染色体 (来自细胞质 DNA
和其它非目标染色体 ) 甚至整个细胞一并挑起 , 造成单条染色体 DNA的内源污染。本试验采用改进
的去壁低渗法制备欧洲山杨染色体标本〔4, 5〕, 较好地解决了杨树单条染色体显微分离中细胞质干扰的
问题 (图 1)。DNA在酸性条件下容易脱嘌呤 , 通常所用的固定液中含有醋酸 , 对染色体 DNA有降
解作用〔12〕, 因此作者在制备染色体标本时进行了条件优化 , 采用 70%乙醇代替甲醇 ∶冰醋酸 (3∶1)
固定液 , 避免了酸对 DNA的破坏作用。
欧洲山杨染色体较小 , 前中期染色体绝对长度分布在 0133～212μm, 根据染色体等级划分标
准〔13〕, 属于小染色体 , 因此分离技术上要求相当高 , 这也是至今鲜见此类报道的主要原因。我们在
已建立的玻璃针分离技术的基础上稍加改进 , 在制作玻璃针时 , 通过调整拉针仪的电流强度 , 制作出
适合分离染色体所需的细而短的针尖〔6〕。本试验使用针尖直径为 015μm左右的微细玻璃针 , 用于杨
树单条染色体的显微分离。用微细玻璃针挑取染色体方法的操作难度相对较大 , 但可以挑取整条染色
体 , 还可以对染色体进行切割 , 也不易被其它非目标物质污染〔14〕。
312　PCR技术在微克隆中的应用
近年来 PCR技术在微克隆中的应用 , 不仅提高了克隆效率 , 而且突破了植物染色体分离、切割、
酶切、酚抽提及连接反应等均需在纳升体积中进行的限制〔16〕。但是 , PCR扩增极易出现假阳性 , 因
此保证无外源 DNA污染是试验成功的关键〔14〕。本研究表明 , 以下措施可有效控制污染 : (1) 所有试
验操作严格控制无菌条件 ; (2) 玻璃器皿均在 180℃下烘烤 5 h以上 , 塑料器皿高压灭菌 30 m in以
上 ; (3) 各种试剂经过滤除菌 , 独立分装为 1次用量 ; (4) 制片时使染色体充分分散并尽量去除细
胞质 ; (5) 选用高质量的试验试剂。
PCR扩增片段的大小关系到染色体文库的完整性。本研究中 , PCR扩增及 Southern杂交结果表
明 , 扩增片段较前人报道的稍大。A lbani等〔17〕报道在小麦中 , 单染色体的扩增片段为 100～2 000 bp,
多数集中在 200～800 bp。而 Chen等〔8〕在对燕麦的报道中 , 扩增片段为 150～3 000 bp, 多数集中在
300～1 000 bp。扩增片段的大小可能与染色体的自身序列结构、S au3A 的酶切程度、Taq酶的活性及
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植物材料在含冰醋酸的固定液中的处理时间长短有关〔18〕。总之 , 人们期望得到较大的扩增片段 , 这
样才有可能建立单染色体的完整文库。
杨树的基因组比较小 , 单倍体基因组 DNA含量约为 112 pg, 480 ±20 Mbp〔1～3〕, 平均 1条染色体
的 DNA含量为 0102～0106 pg。由于一号染色体相对长度大约为整个单倍体染色体长度的 5% , 因此 ,
推测杨树单条一号染色体 DNA含量为 0106 pg (23 Mbp)。按插入片段大小为 1 kb计算 , 每个 DNA插
入片段至少出现 1次 , 染色体文库约含 114 ×105 个重组克隆〔10〕。本研究采用 Sau3A接头介导的 PCR
方法构建的欧洲山杨一号染色体文库 , 共获得了 3 ×105 个重组子 , 插入片段主要分布于 230～2 200
bp, 平均为 800 bp, 基本可以覆盖杨树整条一号染色体。
313　染色体扩增产物来源的确定
目前已有较多关于植物染色体显微分离和扩增的报道 , 但这些研究在扩增出分离染色体 DNA片
段后 , 常用基因组 Southern杂交方法证实扩增产物来自原基因组〔5, 7, 8, 17, 18〕, 却很少有直接证据能证
实扩增产物仅来自目标染色体。程祝宽等〔19〕用水稻染色体图谱上已定位的 STS及微卫星标记等序列
扩增法 , 证实微分离染色体 DNA扩增产物来自水稻第 5染色体短臂 , 而不是来自其它染色体。刘宝
等〔20〕以普通小麦 “中国春 ”全套 “缺体 2四体 ”为材料 , 进行 Southern分析 , 杂交结果表明所建立
的 7B染色体亚基因组 DNA文库不仅没有外源 DNA污染 , 也没有小麦其它染色体的污染。
但要证实显微分离获得的染色体 DNA扩增产物确实源于目标染色体 , 最有效的方法仍然是通过
染色体原位杂交技术 , 将分离获得的染色体 DNA扩增产物特异性定位于目标染色体上。关于人及动
物染色体显微分离的报道中 , 该策略被广泛应用〔12, 21〕。在植物研究中 , 很多研究者也进行了广泛的
尝试 , 但由于植物自身基因组结构的特点 , 成功的报道并不多见〔12〕, 主要集中于植物 B染色体及性
染色体的研究。Zhou等〔22〕以黑麦 1R染色体第二轮扩增产物为探针 , 与其根尖细胞中期分裂相进行
染色体原位杂交 , 当以适量基因组 DNA进行封阻时 , 显微分离染色体 DNA扩增产物成功地重新定位
在一对 1R染色体上。本文的染色体荧光原位杂交结果显示 , 杨树染色体中期分裂相中两条一号染色
体均出现明显的杂交信号 , 信号均匀分布 , 但同时在其它染色体着丝粒及端粒区域也可检测到一定强
度的杂交信号 , 以不同计量的杨树基因组 DNA进行封阻时 , 结果并未有显著改善 (结果未列出 ) ,
这和大多数前人的结果一致〔12, 23, 24〕。
同时 , 由于染色体片段特异性 DNA 文库的克隆效率高、针对性强 , 辅助基因组的物理作图也极
为有利。因此 , 进行杨树单条染色体的分离和克隆将为杨树分子标记的染色体定位研究和木本植物基
因组研究提供新的研究策略和技术手段。
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