全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2003 , 30 (5) : 612～614
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2002 - 11 - 29 ; 修回日期 : 2003 - 02 - 21
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30070530) ; 国际基金资助项目 (D/ 3232 - 1)3 通讯作者 Corresponding author ; Tel : (025) 4395724 ; E2mail : zhangzhen nj @hotmail1com
梅单瓣复瓣花的相关分子标记初探
高志红1 ,2 　韩振海1 　章　镇2 3 　张玉明2
(1 中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094 ; 2 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 应用 RAPD 分子标记技术和 SCAR 分子标记技术研究了梅单瓣花与复瓣花相关的分子标记。结
果表明从 34 个随机引物中筛选到一个多态性引物 OPP01 , 扩增出只有单瓣花类型具有的分子量为 1899 bp
的 DNA 特异片段 , 即 OPP012DS21899 ; 根据该序列设计大小分别为 25 bp 和 24 bp 的一对引物 SSD21 和 SSD22 ,
将 RAPD 标记转为 SCAR 标记 , 该标记大小为 1079 bp。
关键词 : 梅 ; 复瓣 ; 单瓣 ; 分子标记
中图分类号 : S 685117 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2003) 0520612203
1 　目的、材料与方法
以梅 ( Prunus mume Sieb. et Zucc. ) 单瓣花基因型和复瓣花基因型为试材 , 筛选与复瓣、单瓣花
基因相关的分子标记 , 为梅杂交育种提供早期选择标记 , 也为研究单瓣、复瓣花调控基因打下良好基
础。
试材取自南京农业大学果梅种质园和南京梅花研究中心 , 包括宫粉型 (淡妆宫粉、宫粉) 、垂枝
型 (绿萼垂枝、绯司垂枝) 、绿萼型 (小绿萼、重瓣绿萼) 、朱砂型 (寒红) 、杏梅型 (云南丰后、杨
贵妃) 、玉碟型 (三轮玉碟、小玉碟) 、品字梅等复瓣基因型 12 株 , 以及酒盅梅、甲洲小梅、早花、
南高、晚红、小叶猪肝、横核、大粒种、四川黄梅、桃形梅、云南杏梅等单瓣基因型 11 株。采集供
试材料的嫩叶 , 分别提取基因组 DNA〔1〕。将两种基因型各样品 DNA 等量混合 , 对这两个混合的 DNA
进行 PCR 扩增筛选多态性引物 , RAPD 反应体系及反应程序见参考文献 〔2〕, 对筛选到的可能与单瓣
花复瓣花性状相关的多态性引物 , 再以每个样品的 DNA 为模板进行扩增 , 检验所得到的分子标记的
可靠性。反应引物及生化试剂购自上海生工生物工程公司。
从 114 %的琼脂糖回收 RAPD 特异片段 , 回收产物与 PUCm2T连接 , 转化到 TOP10 大肠杆菌之中 ,
经蓝白斑筛选 , 并经 PCR 鉴定得到阳性克隆后进行测序 (测序由上海博亚公司完成) 。根据 RAPD 特
异片段的测序结果设计一对引物 , 正向引物为 5pi2CAAGTAGTATGCCAGATGTGACCAT23pi, 代号为 SSD21 ;
反向引物为 5pi2TACAAAGCCAAAGGCCACAAATGA23pi, 代号为 SSD22。PCR 反应体系为 : 总体积为 25
μL , 其中 Mg2 + 25 mmol·L - 1 , 10 ×缓冲液 215μL , dNTP 0125 mmol·L - 1 , 引物 014μmol·L - 1 , Taq 聚合
酶 1U , 模板 DNA 60 ng ; 反应程序为 : 94 ℃预扩增 8 min , 然后 94 ℃40 s , 52 ℃1 min , 72 ℃1 min , 35
个循环 , 最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 反应采用美国 MJ 公司生产的 PTC2100 基因扩增仪。扩增产物经
114 %的琼脂糖电泳 , EB 染色后 , 在紫外透射仪上观察 , 拍照。
2 　结果与分析
211 　与单瓣、复瓣花性状相关的 RAPD 分析
以单瓣、复瓣相对基因型梅的 DNA 等量混合 , 作为模板进行 RAPD 扩增 , 从 34 个随机引物中筛
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选到一个引物即 OPP01 具有多态性 , 引物序列为 GTAGCACTCC , 多态性片段约为 1900 bp。单瓣基因
型混合 DNA 样品的 RAPD 扩增产物具有该片段 , 而复瓣基因型混合 DNA 样品的 RAPD 扩增产物不具
有该片段 (图 1) , 该片段可能是与单瓣花和复瓣花相关的 RAPD 标记。随机取梅 11 个复瓣花基因型
与 10 个单瓣花基因型为材料进行检测 , 结果表明 , 11 个复瓣类型除了 1 个样品有扩增产物外均没有
该特异片段 , 而 10 个单瓣花类型中除了 1 个 (泳道 19) 没有扩增出特异片段外 , 其他均有该扩增片
段 (图 2) 。证明该片段与梅花的单复瓣性状有关。
图 1 　引物 OPP01 对扩增单瓣与复瓣混合 DNA的扩增结果
1 : 单瓣基因池 ; 2 : 复瓣基因池 ; M: DNA 分子量标准。
Fig. 1 　RAPD amplified patterns of the primer OPP01 in single
flower pool and double flower pool
1 : Single flower pool ; 2 : Double flower pool ; M: DNA marker.
图 2 　引物 OPP01 对不同基因型单株 DNA的扩增结果
1～10 , 21 : 复瓣花基因型 ; 11～20 : 单瓣花基因型 ;
M: DNA 分子量标记。
Fig. 2 　RAPD amplified patterns from the different genotype
individual plant of Japanese apricot using the primer OPP01
1 - 10 , 21 : Double flower genotype ; 11 - 20 : Single flower genotype ;
M: DNA marker.
212 　特异片段的克隆与测序
将得到的 RAPD 标记回收、克隆和测序 , 结果表明 : 该片段大小为 1899 bp , 碱基序列如下所示。
黑体标记的碱基序列为将该 RAPD 标记转为 SCAR 标记所设计的引物 SSD21 和 SSD22 相匹配的位点 ,
预计得到的 SCAR 标记的 DNA 片段序列为上述引物序列之间的一段碱基序列。
213 　将 RAPD 标记转为 SCAR标记
根据测序结果 , 设计一对引物 SSD21 : 5pi2CAAGTAGTATGCCAGATGTGACCAT 23pi 和 SSD22 : 5pi2
TACAAAGCCAAAGGCCACAAATGA23pi, 以单瓣基因型和复瓣基因型单株的DNA 为模板进行 PCR扩增 , 结果
3165 期 　　　　　　　　　　　　　高志红等 : 梅单瓣复瓣花的相关分子标记初探 　　　　　　　　　　　　　　
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表明 , 11 株单瓣花型除 1 株外 (泳道 13) , 在
1079 bp 处均有一特异扩增片段 , 12 株复瓣类型
则没有该DNA 扩增片段 (图 3) , 扩增片段的有无
与表现型的符合率为 91 % , 这可能和材料的基因
杂合性有关。
Lammerts〔2〕以桃为试材研究指出 , 单瓣 (D)
对重瓣 (d) 为完全显性 ; 至于花瓣的数量 , 则是
由累加效应的两对基因控制。根据 ABC 模型 , 花
瓣是由 B 类 MAD2box 同源异形基因调控的。随着
开花分子生物学研究的深入 , 通过对拟南芥和金
图 3 　引物 SSD21 和 SSD22 对单复瓣梅基因型的扩增
1～121复瓣花基因型 ; 13～231单瓣花基因型 ; M. DNA分子量标记。
Fig. 3 　Amplification patterns of the SCAR marker linked to single2double flower gene in Japanese apricot
1 - 12. Double flower genotype ; 13 - 23. Single flower genotype ; M. Marker.
鱼草无瓣花突变体的研究表明 , 花瓣的决定基因为 A P3 和 PI , 但同时这两个基因又决定了雄蕊的表
达 , 许多被子植物存在着这两个基因的同源异形基因 , 但这两个基因如何作用还不清楚〔3～5〕。由于梅
的花瓣类型多 , 无瓣、单瓣、复瓣、重瓣类型均有 , 本文以梅为材料从分子标记的角度探讨了与梅单
复瓣花相关的调控基因 , 得到了与梅单复瓣花相关的分子标记 , 该标记很可能与花瓣的调控基因有
关 , 相关基因是否为 A P3 或 PI 基因 , 还有待进一步研究。　　　　
参考文献 :
1 　高志红 , 章　镇 , 盛炳成 , 等. 果梅随机扩增多态 DNA 技术的研究. 植物生理学通讯 , 1999 , 35 (3) : 214～218
2 　Lammerts W E. The breeding of ornamental edible peaches for mild climates ( I) Inheritance of tree and flower characters. Amer. J . Bot . , 1941 ,
32 : 53～61
3 　Purugganan M D , Suddith J I. Molecular population genetics of floral homeotic loci : departures from the equilibrium neutral model at the APETALA3
and PISTILLATA genes of Arabidopsis thaliana. Genetics , 1999 , 151 : 839～848
4 　Kramer E M , Dorit R L , Irish V F. Molecular evolution of genes controlling petal and stamen development : duplication and divergence within the
APETALA3 and PISTILLATA MADS2box gene lineages. Genetics , 1998 , 149 : 765～783
5 　Kramer E M , Irish V F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development . Nature , 1999 , 399 : 144～148
Identif ication of RAPD and SCAR Markers Linked to the Single2double Flower
Gene in Japanese Apricot ( Prunus mume Sieb. et Zucc. )
Gao Zhihong1 ,2 , Han Zhenhai1 , Zhang Zhen2 , and Zhang Yuming2
(1 Institute for Horticultural Plant , China Agricultural University , Beijing 100094 , China ; 2 College of Horticulture , Nanjing Agri2
cultural University , Nanjing 210095 , China)
Abstract : Randomly amplified polymorphic DNA ( RAPD) and sequence characterized amplified region
(SCAR) marker were performed to detect markers linked to the single double flower in Japanese apricot ( Prunus
mume Sieb. et Zucc. ) . Primer OPP01 was identified from 34 102mer primers examined. The fragment was cloned
and sequenced as 1899 base pairs. According to the sequence , one primer pairs were designed to convert the
RAPD marker to SCAR marker. The length of the amplified fragment of SCAR marker was 1079 base pairs.
Key words : Japanese apricot ; Double flower ; Single flower ; Molecular marker
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