全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (6) : 1056～1060
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 12 - 17; 修回日期 : 2005 - 03 - 07
基金项目 : 回国留学人员启动基金资助项目 (200306)
墨兰组织培养结合化学处理脱除建兰花叶病毒
( CymM v) 的研究
姜　玲 1 　张明涛 1 　陈泽雄 1 　马国华 2
(1 华中农业大学园艺林学学院 , 园艺植物生物学教育部重点实验室 , 国家果树种质资源脱毒室内保存中心 , 武汉
430070; 2 中国科学院华南植物园 , 广州 510650)
摘 　要 : 对墨兰原球茎顶端分生组织培养结合化学处理脱除建兰花叶病毒 (CymMv) 病原的效果进行了
研究。取 1～2 mm大小的墨兰原球茎顶端分生组织 , 经 0, 20和 40 mg·L - 1的三氮唑核苷浸泡 15 m in处理和
继代培养 , 诱导再生植株。RT2PCR检测表明 : 从带病叶样提取的 RNA经反向转录和 PCR扩增反应 , 在琼脂
糖凝胶电泳中检测到长为 767 bp的 CymMv病原特异扩增产物 , 而健康墨兰叶样中未检测到该扩增产物。单
纯利用原球茎顶端分生组织培养获得的试管苗 , 脱毒率为 7219%; 原球茎顶端分生组织经过 20 mg·L - 1的三
氮唑核苷处理 , 可以获得 100%的无病毒苗。虽然三氮唑核苷处理造成原球茎顶端分生组织细胞一定程度的
伤害 , 但经过 5～6个月的培养 , 分生组织能恢复生长 , 不定芽能有效地增殖 , 并获得了再生植株。当三氮唑
核苷处理浓度为 40 mg·L - 1时 , 原球茎的顶端分生组织出现透明和褐变现象 , 细胞活力难以恢复。
关键词 : 墨兰 ; 建兰花叶病毒 ; 三氮唑核苷 ; RT2PCR
中图分类号 : S 68　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0621056205
Erad ica tion of CymM v from T issue Cultures of C ym bidium sinense w ith
Chem otherapy
J iang L ing1 , Zhang M ingtao1 , Chen Zexiong1 , and Ma Guohua2
(1D epartm ent of Horticulture, Huazhong Agricultural U niversity, Key Laboratory of Horticultural P lant B iology, M inistry of Educa2
tion, N ational Indoor Conservation Center of V irus2free Germ plasm s of Fruit Crops, W uhan 430070, China; 2 Huanan B otanical
Garden, the Chinese Academ y of Sciences, Guangzhou 510650, China)
Abstract: Meristem2tip of p rotocorm s of Cym bid ium sinense was emp loyed to study eradication of CymMv
by combining tissue culture and chemotherapy. Meristem2tip of p rotocorm s about 1 - 2 mm in length were ex2
cised and immersed separately with 0, 20 and 40 mg·L - 1 of antiviral agent, ribavirin for 15 m ins, followed
by the sub2culture, the regenerated p lantlets were achieved. Above materials were determ ined for virus infec2
tion by RT2PCR assay. Experiment indicated that RNA of virus2infected samp les were determ ined and the am2
p lified 767 bp specific fragments of CymMv could be visibled clearly in agarose gel electrophoresis, and no
p roduct appeared in the health control; only 7219% of the p lantlets obtained merely by meristem of p rotocorm s
culture were virus2free, while the percentage was 100% for p lantlets regenerated from meristem of p rotocorm s,
ever treated by 20 mg·L - 1 of ribavirin, though the chem ical injured tissue to certain extents, which were still
recovered, efficient p roliferation of adventitious buds were achieved, and p lantlets were regenerated subse2
quently after 5 - 6 months. W hen treated with 40 mg·L - 1 of ribavirin following above2mentioned method,
meristem of p rotocorm s became transparent and browned, and the cell vigor could not be recovered.
Key words: Cym bidium sinense (Andr. ) W illd. ; CymMv (Cymbidium mosaic virus) ; Ribavirin; RT2PCR
病毒病的侵害一直影响着兰花工业的正常发展。据统计 , 目前兰花受到 27种病毒的侵染 , 最主
要的是建兰花叶病毒 ( Cymbidium mosaic virus, CymMv) 和齿兰环斑病毒 (Odontoglossum ringspot,
ORSV)〔1〕。CymMv的普遍发生与无性繁殖方式有着密切的关系 , 人工繁殖时造成的机械伤口 , 可导
　6期 姜 　玲等 : 墨兰组织培养结合化学处理脱除建兰花叶病毒 (CymMV) 的研究 　
致病毒的传播。随着国内外兰花品种交流的增加和贸易迅猛增长 , 也给病毒病的传播和蔓延提供了更
多的机会。
研究和建立一种既能保持品种优良特性和较高的繁殖系数 , 又能脱除培养材料中的病毒病原的有
效方法 , 对于防止病毒的进一步扩散 , 减少种植者的风险具有重要的现实意义。
获得无病毒苗的主要途径有茎尖培养、热处理和化学处理〔2～7〕。茎尖培养应用最广 , 但脱毒效果
常受茎尖大小的影响 ; 热处理可抑制病毒的复制和运动蛋白的合成 , 使多种病毒失活〔7〕, 但处理时
间长 , 成活率易受影响 , Stone等〔8〕研究证明热处理不能从兰花中脱除 CymMv病原 ; 抗病毒剂处理先
后在马铃薯、甘蔗等植物上获得成功〔2, 7〕, L im等在兰花 (Mokara Char Kuan‘Pink’) 上 , Toussaint
等在 Cym bid ium Sw. 上作过成功的尝试〔10, 11〕。虽然墨兰组织培养研究先后有一些报道〔9, 12, 13〕, 但利用
组织培养技术进行病毒病的脱毒研究未见报道。RT2PCR〔14〕分子鉴定技术能在 pg水平上更精确地检
测出病毒病原 , 也为墨兰脱毒工作提供了良好的检测手段。
本研究旨在将原球茎顶端分生组织培养与抗病毒剂处理相结合 , 对脱毒前后材料进行 RT2PCR检
测 , 从而为墨兰无病毒苗的工厂化生产提供技术保证。
1　材料与方法
111　植物材料的准备
从中国科学院华南植物园采集叶片上带有不规则褪绿斑纹的墨兰植株 , 以健康的墨兰作对照。去
叶后的茎尖分生组织作为初代培养材料。带病的和健康的叶片用液氮处理后贮存在 - 70℃超低温冰箱
中 , 待检测用。
112　外植体消毒及培养条件
将墨兰植株外围几枚叶片去掉 , 保留中心分生组织 , 将茎尖分生组织材料用自来水冲洗 30 m in
后 , 放入 70%乙醇中浸泡 5 s。在无菌烧杯中滴入 2滴吐温 40, 并加入用无菌水配制的 2%次氯酸钠
消毒液 (有效氯浓度为 50 000 mg·L - 1 )。外植体材料在次氯酸钠溶液中浸泡 30 m in, 边浸泡边搅
拌 , 在无菌水中清洗 4～5次 , 接种到诱导愈伤组织和原球茎的培养基中。培养室温度 (25 ±1) ℃,
光照强度 40～50μmol·m - 2 ·s- 1 , 14 h /d, 相对湿度 70% ～80%。
113　愈伤组织诱导及原球茎增殖分化
在 MS + 62BA 4 mg·L - 1 +NAA 1 mg·L - 1 +蔗糖 20 g·L - 1培养基 (pH 515) 上诱导愈伤组织和
原球茎。初代培养时 , 用牛皮纸覆盖容器 , 使材料在弱光条件下培养 3～4周 , 此后在培养室正常光
照条件下进行培养。经过 1～2次继代培养 , 获得绿色、紧实的愈伤组织和原球茎 , 在 MS + 62BA
1 mg·L - 1 +NAA 015 mg·L - 1 +蔗糖 20 g·L - 1培养基上诱导原球茎分化芽。生根培养基为 1 /2MS +
NAA 2 mg·L - 1 +香蕉泥 100 g·L - 1 +蔗糖 20 g·L - 1 + 015%活性炭。
114　脱毒处理及墨兰植株再生
切取大小为 1～2 mm的原球茎顶端分生组织 , 分别放入含有 0、20和 40 mg·L - 1三氮唑核苷的
无菌离心管中浸泡 15 m in, 然后将上述材料分别接种到含相应浓度的三氮唑核苷的培养基中暗培养 4
周 , 再转入不含抗病毒剂的培养基中诱导愈伤组织和原球茎增殖。每浓度处理 50个原球茎分生组织
小块 , 重复 3次。继代培养 2～3个月后 , 诱导出新生原球茎并分化出芽。从基部切下新芽 , 接种到
生根培养基中 , 获得再生植株 , 收集叶片用于病毒检测。
115　墨兰脱毒前后的 RT2PCR检测
按照异硫氰酸胍法〔14〕提取墨兰健康株、带病株及脱毒前后培养材料中的 RNA, 根据 A jjikuttira
等〔15〕的方法设计能扩增 CymMv的特异性引物 , 用于 RT2PCR试验。引物由上海生工生物技术公司合
成 , 用于 CymMv扩增的引物序列为 ( + ) 5pi2TAGCTAGGCCCCTGGC23pi和 ( - ) 5pi2CTTTAGAAAACCA2
CACGC23pi。RT2PCR扩增反应在 PTC2100 Peltier Thermal Cycler (MJ Research) 热循环仪中进行。采用
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TaKaRa One step RNA PCR Kit (AMV) 进行 RT2PCR反应。经试验采用的最佳反转录和扩增条件为 :
48℃保温 45 m in, 94℃变性 30 s, 从 60℃开始 , 每个循环递减 015℃, 退火 30 s, 72℃延伸 2 m in, 进
行 10个循环 , 94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃延伸 2 m in, 进行 21个循环 , 72℃再延伸 7 m in。
PCR扩增产物经 2%的琼脂糖凝胶 (Mersco) , 在 60 V电压下电泳 50 m in, 溴化乙锭染色 , 然后在凝
胶成像系统中进行观察。
2　结果与分析
211　墨兰脱毒苗的培养
在含有相应浓度三氮唑核苷的诱导培养基上 , 经 20 mg·L - 1三氮唑核苷处理后的分生组织约 1 /4
出现褐变 , 生长处于停滞状态 , 转入新的诱导培养基后 , 分生组织块需要近 4周的缓解过程 , 生活力
才逐渐恢复 , 随后细胞不断分裂和生长。隔 30 d继代 1次 , 继代培养 2次后 , 愈伤组织块逐渐增大 ,
形成小突起 , 其表面有时还产生不定芽和白色毛状物 , 切分这些芽继续培养 110～120 d时 , 原球茎
陆续长出。完成脱毒和植株再生程序需要 5～6个月 (图版 , 1～3)。在 40 mg·L - 1三氮唑核苷中处
理的材料 , 分生组织出现严重的透明和褐变现象 (图版 , 4) , 细胞生活力很难恢复 , 未获得再生植
株。
未经化学处理的分生组织 , 前 4周开始变化不大 , 当继续培养时 , 愈伤组织细胞不断分裂 , 形成
小突起 , 原球茎不断增殖。观察发现 , 试管苗上并无典型的 CymMv症状。将原球茎分化出的芽从基
部切分下来 , 接种到生根培养基中 , 25～30 d后每株可长出 3～4条健壮的根。
212　脱毒苗的 RT2PCR检测
试验表明 , 带病症的墨兰叶样 (图版 , 5) 的 RNA经反转录反应 , 获得了 cDNA, 在 CymMv特
异性引物作用下扩增的 PCR产物 , 经琼脂糖凝胶电泳 , 在约 767 bp处有明显的扩增带产生 , 阴性对
照没有特异扩增带 (图 1)。根据外观症状判断和 RT2PCR鉴定 , 母本植株中带有 CymMv病原。RT2
PCR分析显示 , 经 20 mg·L - 1三氮唑核苷处理后诱导的再生植株 , 其 RNA经提取分析 , 所有被检的
脱毒苗没有发现 CymMv特异扩增产物。而直接切
取的原球茎分生组织再生的植株 , 有 2711%仍带
有 CymMv病原 (表 1 ) , 即脱毒率达到 7219%。
经两个样本百分数的均数差异显著性测验 , 20
mg·L - 1三氮唑核苷处理与不加三氮唑核苷处理
的被检测植株的带毒率呈极显著的差异 ( P <
0101)。
表 1　三氮唑核苷处理对墨兰 CymM v脱毒效果影响
Table 1　Effect on erad ica tion of CymM v from Cym bidium
sinense w ith r ibav ir in trea tm en t
处理
Treatment RT2PCR3 带毒百分率Ratio of virus2infected ( % )
0 mg·L - 1 ribavirin 13 /48 2711A
20 mg·L - 1 ribavirin 0 /38 　0B
40 mg·L - 1 ribavirin3 3 - -
阳性对照 Positive control 6 /6 100
阴性对照 Negative control 0 /6 　0
　　注 : 3 分子为 RT2PCR检测到特异扩增带的样品数 , 分母为
被检样品数 ; 3 3 褐变 , 未出苗。
Note: 3 Numerator exp ressed that the number of samp leswere de2
term ined with specific amp lified fragments, and denom inator was total
number of samp les, which were determ ined; 3 3 Becomed brown and
p lantlet did not formed.
图 1　墨兰脱毒苗的 RT2PCR检测
1. 从原球茎获得再生植株 ; 2. 未经化学处理 , 通过原球茎获
得的再生植株 ; 3. 脱毒前从紧实的愈伤组织提取 RNA; 4. 经
20 mg·L - 1三氮唑核苷处理获得的脱毒苗 ; 5. DL2000 marker;
6. 阳性对照 ; 7. 用于初代培养的 015 cm大小的顶端
分生组织 ; 8. 健康对照。
F ig. 1　RT2PCR a ssays for the plan tlets of erad ica tion v irus
1. Regenerated p lantlets inducted from p rotocorn were achieved;
2. The samp le was not treated with ribavirin, regenerated p lantlets
from p rotocorn with invisible symp tom were achieved, and the specific
767 bp fragments appeared; 3. Before eradication the virus, RNA
extracted from tight callus, the specific 767 bp fragments appeared;
4. Treated with 20 mg·L - 1 of ribavirin, the sample could not amplified
CymMv specific fragment; 5. DL2000 marker; 6. Possitive control;
7. Meristem2tip of 015 cm in size for initiation culture, RT2PCR assay
exp ressed CymMv specific fragment; 8. Nagative control.
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3　讨论
从理论上讲 , 茎尖分生组织不带病毒或带毒浓度很低 , 使茎尖培养脱毒成为可能。考虑到
脱毒取用的茎尖分生组织太小 , 会导致诱导愈伤组织和再生植株的困难。本试验取原球茎的顶
端分生组织 ( 1～2 mm ) 进行培养 , 使脱毒材料来源丰富且减小了植株再生的难度 , 但直接培
养获得的脱毒率只有 7219 %。由此可见 , 单纯使用 1～2 mm大小的分生组织培养 , 不能达到理
想的脱毒目的。
L im等〔10〕研究指出 , 三氮唑核苷进入被病毒感染的细胞后迅速磷酸化 , 其产物作为病毒合成酶
的竞争性抑制剂 , 阻止病毒 RNA和蛋白合成 , 抑制病毒的复制与传播。本试验证明 , 三氮唑核苷在
墨兰上表现出明显的抗 CymMv病毒作用。经过 20 mg·L - 1的三氮唑核苷浸泡和继代培养 , 能获得
100%无病毒苗 , 但三氮唑核苷浓度过高时 , 易造成植物细胞严重的伤害 , 产生透明状和褐变现象 ,
甚至导致生命力无法恢复。这个结果与 Klein等〔2〕在 马铃薯上的研究有类似的表现。
本研究将分生组织培养与化学处理方法相结合 , 明显提高了脱毒的效果。这种方法在墨兰脱毒处
理上尚未见过报道。本试验结果在墨兰无病毒苗培育方面具有实际参考价值 , 但控制好三氮唑核苷的
浓度和处理时间至关重要。
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图版说明 : 墨兰原球茎培养及抗病毒剂处理脱毒　1. 利用墨兰顶端分生组织诱导原球茎和不定芽产生 ; 2. 切取 1～2 mm大小的原
球茎顶端分生组织 , 经 20 mg·L - 1三氮唑核苷处理后 , 接种在含相应浓度的三氮唑核苷培养基上 , 原球茎顶端分生组织表现绿色 ;
3. 诱导植株再生 ; 4. 经 40 mg·L - 1三氮唑核苷处理后 , 接种在含相应浓度的三氮唑核苷培养基上 , 原球茎顶端分生组织出现透明和
褐变 ; 5. 墨兰带病叶片上有不规则褪绿斑块。
Explana tion of pla tes: Erad ica te the CymM v by protocorm s culture and an tiv ira l trea tm en t in Cym bidium sinense　1. Formation of p ro2
tocorm s and adventitious buds from meristem tip of Cym bidium sinense; 2. Meristem of p rotocorm s about 1 - 2 mm were peeled off and treated by
20 mg·L - 1 of antiviral agent ribavirin, and sub2cultured in medium containing corresponding ribavirin, which exp ressed green; 3. Induction re2
generation of the p lantlets; 4. Treated by 40 mg·L - 1 of antiviral agent ribavirin inoculated in medium containing corresponding ribavirin, p roto2
corm s exp ressed transparent and brown; 5. Anomalistic, yellowish mottle symp tom appeared in virus2infected leaf of Cym bid ium sinense.
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