全 文 ： 收稿日期：2011-06-01
基金项目：福建省博士青年基金项目(2008F3015)、福建省自然科学基金（2009J01080）、福建省公益类研究院所专项（2009R10005-3）
作者简介：郭莺(1981-)，女，福建龙岩人，助理研究员，博士，从事植物抗病分子育种研究。

侵染厦门地区蝴蝶兰的建兰花叶病毒的分子鉴定
郭 莺，林志楷，刘黎卿, 林清洪
（福建省亚热带植物研究所 福建省亚热带植物生理生化重点公共实验室，福建 厦门 361006）

摘 要：根据已公布的建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）序列，设计特异引物，利用 RT-PCR
方法分离克隆了厦门蝴蝶兰 CyMV 的病毒分离物，获得完整的 CP 基因序列，并与来自中国和其它亚洲国家的
病毒分离物进行同源性分析，其同源性均达 96%以上。系统进化树分析结果表明，厦门的病毒分离物与中国台
湾、韩国、印度的分离物成簇，而福建、北京和新加坡的病毒分离物独立形成另一簇。
关键词：蝴蝶兰；建兰花叶病毒；检测
Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2011.03.001
中图分类号：S681.9 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2011)03-0001-03

Molecular Identification of Cymbidium mosaic
Virus Infecting Orchid in Xiamen
GUO Ying, LIN Zhi-kai, LIU Li-qing, LIN Qing-hong
(Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant, Fujian Institute of Subtropical Botany, Xiamen
361006, Fujian China)

Abstract: Based on the reported Cymbidium mosaic virus (CyMV) genomic cDNA sequence,
specific primer of CymV-CP was designed, and RT-PCR was performed with the total RNA as
templates extracted from diseased orchid plant collected from Xiamen, to attain complete CP gene
sequence. The result was that the virus isolates of XM orchid had high homology with isolates that
separated form other areas of China and Asian countries (the homologies were all above 96% at
nuclear acid). According to phylogenetic tree analysis, the virus isolates of XM orchid clustered with
reference sequences of Taiwan, Korea and India, and Fujian, Beijing and Singapore isolates clustered
together.
Key words: Orchid; Cymbidium mosaic virus; detection

CymMV 隶属线形病毒科(Flexiviridae)马铃薯 X 病毒属(Potexvirus)[1]，病毒核酸为 ssRNA，基因组
全序列约 6 200 nt[2]。CyMV 是迄今从兰花上分离到的病毒中分布最广、危害最严重者之一[3]，能使蝴
蝶兰产生褪绿斑点及坏死斑。兰花种植过程中任何可造成机械性伤口的操作[4]、栽培过病株的盆钵、
甚至灌溉水均可导致病毒的传播，加上近年来兰花产业逐渐规模化以后，为了达到快速繁殖种苗所采
用的组培技术，更加速了病毒的广泛蔓延。
目前大部分品种感染病毒后，在幼年期并不表现严重的病症，此种情况在蝴蝶兰上特别明显。但
每当植株进入成熟期，或生长势因环境压力而减弱时，兰花往往会逐渐表现出病症并且加速恶化[5]。
近年来，在厦门蝴蝶兰种植区的温室里发现大量病株，叶片上有明显的花叶症状，花朵小且色泽不鲜，
花瓣上有条纹状。本试验通过RT-PCR快速检测体系来鉴定CyMV病毒株系。

2011,40(3):1-3.
Subtropical Plant Science
第 40 卷 ﹒2﹒
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒源 毒源来自厦门航空港蝴蝶兰培育中心。以蔓陀罗(Datura stramonium)为繁殖寄主。摩擦接
种CyMV，置光照培养箱中培育生长，15 d后开始观察症状，并采集病叶，用液氮处理，于－80℃冰箱
保存备用。
1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 菌株由本实验室保存；克隆载体 pMD18T 购自
TaKaRa 公司。
1.1.3 寡聚核苷酸引物 试验中所合成的引物和克隆片段的测序均由上海生物工程有限公司完成。
1.1.4 生物化学药品 RT-PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司的 RT-PCR version 3.0；RNA 提取试剂盒为
Invitrigen 公司产品；DNA 回收试剂盒购自天为时代公司；质粒提取试剂盒购自博大泰克公司；IPTG、
X-Gal、抗生素、DNA 分子量标准购自上海生物工程有限公司；Ex Taq DNA 聚合酶、T4 连接酶、限制
性内切酶均为 TaKaRa 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 植物总 RNA 提取 植物总 RNA 的提取方法按 Invitrigen 公司提供的试剂盒说明书完成。
1.2.2 RNA 完整性及纯度检测 用 Ultrospec 2100 核酸蛋白测定仪，以溶解 RNA 的灭菌无离子 DEPC
处理过的水为对照，测定 230 nm、260 nm 和 280 nm 的光吸收值，确定 RNA 的浓度及纯度。同时取 1
µl 提取的 RNA，在 1.2%琼脂糖凝胶上电泳，然后在凝胶成像系统上紫外照相，检测 RNA 的完整性。
1.2.3 引物设计 收集 NCBI 网上已公布的 CyMV-CP 基因的序列，进行同源性分析，并根据保守区序
列进行引物设计。引物具体如下：
CyMV-CPfs: ATGGGAGAGCCCACTCCAACT
CyMV-CPaf: CACGCCTTATTAAGTTTGGCG
1.2.4 CyMV-CP 的 RT-PCR 反应和目的片段回收 利用已合成的引物，以提取的感病叶片的总 RNA
为模板，使用 TaKaRa 公司的 RT-PCR version 3.0 试剂盒中的反转录酶合成 cDNA 第一条链，并以 cDNA
进行 PCR 反应，PCR 反应体系（50 μl）: 5×PCR Buffer 10 μl；灭菌超纯水 32.75 μl；dNTPs (10 mM each)
2 μl；TaKaRa Ex Taq (5 U/μl) 0.25 μl；RT-PCR-3’ (10 μmol/μl) 1 μl；RT-PCR-5’ (10 μmol/μl) 1 μl；cDNA 3
μl。反应程序为 95 ℃ 3 min；95 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行 38 个循环；72 ℃ 10 min。
以新鲜的 TAE Buffer 为电泳缓冲液，在 1%琼脂糖凝胶上进行电泳，采用 PCR Fragment Recovery Kit
的方法回收 RT-PCR 产物。
1.2.5 CyMV-CP 连接、转化 目的片段连接按试剂盒方法进行，并转化大肠杆菌，于 37 ℃培养，12 h
后可形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。选取数个转化后的白色菌落，PCR 法鉴定阳性克隆。
1.2.6 CyMV-CP 重组 DNA 质粒的提取和酶切验证 取 PCR 鉴定为阳性的菌液，采用博大泰克小量提
取试剂盒提取其质粒 DNA，并用 EcoR I 和 Hind III 进行双酶切验
证。
1.2.7 CyMV-CP 基因测序和序列的比对、分析 将阳性菌液送上海
生物工程有限公司进行测序，采用 BLAST、DNAMAN 4.0、
OMIGA2.0 软件进行序列分析。
2 结果与分析
2.1 侵染蝴蝶兰CyMV-CP的RT-PCR结果
利用已合成的引物对叶片总 RNA 进行 RT-PCR 扩增，电泳结
果如图 1，目的片断大小为 747 bp，与预计大小相同。
2000
750
500
250
100
图 1 CyMV-CP 基因 RT-PCR
电泳结果
第 3 期 郭莺,等：侵染厦门地区蝴蝶兰的建兰花叶病毒的分子鉴定 ﹒3﹒
2.2 侵染蝴蝶兰CyMV-CP的序列分析
克隆的厦门分离物全序列由 747 个碱基组
成，包括完整的病毒外壳蛋白基因，并提交到
NCBI 数据库，其序列号为 GQ507023。将
CyMV-CP 核苷酸序列与 NCBI 网上公布的来自
中国和其它亚洲国家的病毒分离物进行同源性
分析，其同源性均达 96%以上。氨基酸序列比
对结果显示此病毒分离物为马铃薯 X 病毒外壳
蛋白家族的成员之一，与台湾的病毒分离物作同
源性比较，并进行系统进化树分析，结果如图 2
所示，来自福建、北京和新加坡的病毒分离物相
聚一类，而厦门的病毒分离物与中国台湾、韩国、
印度的亲源性更高，聚成一簇。
3 讨 论
蝴蝶兰具有品种丰富、花色艳丽、花期长等特点深受民众喜爱，成为盆花中最流行的观赏植物。
不但国内如此，在荷兰、美国等欧美市场，蝴蝶兰也倍受青睐。但是蝴蝶兰病毒病相当严重，病毒可
在兰花植株上造成全身系统性感染，使兰株生长缓慢，叶片出现条纹、斑块、坏疽或绿色分布不均的
嵌纹病症，导致其产量和质量受到极大影响[6]。目前蝴蝶兰病毒病主要以预防为主，在生产过程中应
进行多次病毒检测，及时发现病株并剔除，保证植株健康生长。随着核酸技术的发展，分子生物学检
测手段也大量应用于植物病毒的检测[7-9]。通过基因序列分析对植物病毒进行鉴定，是近十多年发展
起来的鉴定植物病毒的新方法，具有快速、准确、简便等特点，还能为病毒亲缘关系研究提供信息。
本文通过设计CyMV病毒CP基因的特异引物，对其进行鉴定，并进行相关分析，发现厦门分离物与来
自台湾的亲缘性较高，而与同来自福建的分离物亲缘性较远。这可能是由于在厦门种植蝴蝶兰的很多
是台湾企业，在培育新品种的过程中较多地选用了台湾较好的品种做为亲本进行杂交，并将其病毒也
传给了后代。本试验通过对厦门蝴蝶兰感染的CyMV病毒进行鉴定，并获得完整的CP基因，有利于深
入进行相关的分子生物学研究，并为分子育种打下基础。
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图 2 部分 CyMV-CP 基因的系统进化树分析