全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (6) : 1003～1007
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 02 - 03; 修回日期 : 2005 - 06 - 15
基金项目 : 北京市科技新星项目 (953812200)3 通讯作者 Author for correspondence
桃果实有毛 /无毛性状的 SCAR标记
姜立杰 1 　杨英军 2 　张晓明 1 　李文生 1 　张开春 13
(1 北京市农林科学院林业果树研究所 , 北京 100093; 2 河南科技大学农学院 , 洛阳 471003)
摘 　要 : 以桃品种 ‘京玉 ’和 ‘美味 ’的正反交 69株 F1 群体为试材 , 利用 RAPD技术扩增出了与桃
果实有毛 /无毛性状 (G / g) 连锁的 2 258 bp的多态性片段 , 经克隆、测序后 , 根据获得的序列重新设计了
两对引物进行 SCAR转化。引物对 BFP94 /BFP95在有毛和无毛个体中均扩增出了 2 258 bp的片段 , RAPD
显示的多态性消失。利用引物对 BFP96 /BFP98成功将 RAPD标记转化成了 SCAR标记 , 并命名为 SCP202
2258。该标记仅在果实有毛的个体中出现 , 与有毛 /无毛性状的连锁距离为 718 cM , 且扩增稳定 , 为桃果
实有毛 /无毛性状育种的分子标记辅助选择奠定了基础。
关键词 : 桃 ; 油桃 ; RAPD; SCAR
中图分类号 : S 66211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0521003205
SCAR M arker L inked to the Peach /Nectar ine in Peach
J iang L ijie1 , Yang Yingjun2 , Zhang Xiaom ing1 , L iW ensheng1 , and Zhang Kaichun13
( 1 Institu te of Forestry and Pom ology, B eijing A cadem y of A gricultural and Forestry Sciences, B eijing 100093, China; 2 College of
A griculture, Henan Science2Technology U niversity, Luoyang 471003, Ch ina)
Abstract: RAPD technique was used in screen molecular marker linked to peach /nectarine character
(G / g) in 69 F1 hybrids resulting from the intraspecific cross between peach cultivar‘J ingyu’and nectarine
cultivar‘Flavortop’. The OPP20 p rimer resulted in a rep roducible bright polymorphic band of 2 258 bp p res2
ent in the individuals of peach character and peach cultivar‘J ingyu’. The polymorphic band was cloned and
sequenced. Four p rimers were designed based on the sequence to transform into SCAR marker. But p rimer
combination BFP94 /BFP95 amp lified the same2sized band in all individuals resulting in a loss of the original
RAPD polymorphism. The RAPD markerwas successfully converted into a SCAR marker with p rimer combina2
tion BFP96 /BFP98, which was designated SCP2022258. The linkage distance is 718 cM between the SCP202
2258 and the peach /nectarine character. The SCAR marker will be useful for marker2assisted selection for
peach /nectarine character in peach breeding p rogram s.
Key words: Peach; Nectarine; RAPD; SCAR
桃 〔P runus persica (L. ) Batsch〕基因组较小 (约 3 ×108 bp) , 自交育性强 , 单基因控制的质量
性状多。在桃果实有毛 /无毛性状的分子标记研究中 , Chaparro等〔1〕用 RAPD技术筛选到了 1个与有
毛 /无毛性状连锁的遗传距离为 2314 cM的标记 ; D irlewanger等〔2, 3〕以毛桃品种 ‘Ferjalou Jalousia’和
油桃品种 ‘Fantasia’杂交的 F2 群体为研究材料 , 构建了包含 249个标记的遗传连锁图 , 有毛 /无毛
性状定位在第 5连锁群上 , AFLP标记 AC2CAA1与其共分离 , 两端的 RFLP标记 FG34、AG46与有毛
/无毛性状的遗传距离分别为 7 cM和 9 cM。B liss等〔4〕则以杏和桃杂交获得的 F2群体为试材 , 构建了
包含 161个标记的连锁图 , 将有毛 /无毛性状定位在第 5连锁群的末端 , 最近的标记 AG1923与其连锁
距离为 514 cM。果树上已有多个转化成功的 SCAR标记 , 而桃果实有毛 /无毛性状的 SCAR标记未见
报道。本研究就在桃果实有毛 /无毛性状的 RAPD标记基础上获得了该对性状的 SCAR标记。
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
1　材料与方法
111　试材
试材为 ‘京玉 ’、‘美味 ’两个品种杂交的 69株 F1 代正反交群体 , 其中正交 54株 , 反交 15株。
‘大久保 ’和 ‘兴津油桃 ’杂交获得 F1 代 (京玉 ) , 京玉自交获得 F2 代群体中的 42株。所有材料均
来自北京市农林科学院林果所桃杂交圃。京玉是有毛桃品种 , 美味是油桃品种。取材部位为幼嫩叶片
或一年生枝条 (休眠季用 ) , 带回实验室放入 - 70℃冰箱内保存备用。
112　方法
11211　DNA提取 　采用 CTAB法〔5〕, 并略做改进。提取缓冲液成分 : Tris2HCl (pH 810) 100 mmol/
L、EDTA 20 mmol/L、NaCl 114 mmol/L、CTAB 2%、β -巯基乙醇 1% ～2% , 现用现加。缓冲液成分
的终浓度均增大 1倍 , 另加入 2% PVP, 以除去酚类物质。
11212　RAPD分析 　RAPD分析采用 10μL反应体系 , 其中包括 Tris2HCl (pH 813) 10 mmol/L、KCl
50 mmol/L、MgCl2 115 mmol/L、明胶 0101 mg/mL、 dNTP (每种 ) 012 mmol/L、5μg牛血清白蛋白
(BSA )、715 ng引物、018 U Taq酶、10 ng模板 DNA。PCR反应在 Idaho2Technology公司生产的 A ir2
Thermo2Cycler 1605型毛细管 PCR仪上进行 , 扩增程序为 93℃ 10 s, 36℃ 35 s, 72℃ 70 s, 两个循
环 ; 93℃ 10 s, 36℃ 35 s, 72℃ 70 s, 45个循环 , 斜率变化为 3 (退火温度和延伸温度之间的变温速
率参数 ) ; 最后 72℃延伸 5 m in。扩增产物在 112%琼脂糖凝胶上电泳 , 溴化乙锭染色 , 放紫外灯下观
察照相。
11213　特异片段的回收、克隆和测序 　将 RAPD扩增产物在 1%的琼脂糖凝胶上电泳 , 然后用手术
刀切下含有特异片段的琼脂糖凝胶块 , 采用玻璃奶法回收、纯化。纯化的片段与载体的连接采用上海
生工生物工程技术服务有限公司的 PUC2Tvector系统。参照文献 〔6〕进行重组质粒的转化和筛选。
利用碱法提取重组质粒 , 采用酶切与 PCR方法进行检测。委托大连宝生物生物工程公司测序。
11214　SCAR标记引物的设计与扩增 　在 OPP2022258片段两端包括 RAPD引物的 10个 bp再延长
8～15 bp, 设计了两对引物 , 并检查所设计引物是否符合引物设计中引物与模板的序列紧密互补 ; 引
物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 ; 引物不能在模板的非目的位点产生聚合反应的一般条件。
利用设计的特异引物进行 SCAR扩增 , 反应体系为 20μL, 其中含 Tris2HCl 10 mmol/L ( pH 910)、
KCl 50 mmol/L、011% TritonX2100、MgCl2 115 mmol/L、 dNTP (每种 ) 0116 mmol/L , 特异引物 (每
种 ) 0125μmol/L , 1 U Taq酶 , 20～30 ng模板 DNA, ddH2O补足 20μL。 PCR反应在 PTC2100型
PCR仪上进行 , 扩增程序为 : 94℃ 2 m in; 94℃ 40 s, 56℃ 1 m in; 72℃ 1 m in, 36个循环 ; 最后 72℃
延伸 5 m in。扩增产物在 112%的琼脂糖凝胶上电泳 , 溴化乙锭染色 , 紫外灯下观察照相。
2　结果与分析
211　桃果实有毛 /无毛性状的 RAPD标记
采用 RAPD指纹分析技术筛选亲本间的 DNA多态性 , 以亲本京玉和美味基因组总 DNA为模板共
筛选 Operon公司的 KitA～KitZ的 102mer随机引物 520个。共筛出 158个在亲本间具多态性的引物。
然后再分别用果皮有毛和果皮无毛的杂交后代各 2、4、8株反复筛选多态性引物 , 发现随机引物
OPP20 (序列为 GACCCTAGTC) 产生的 2 258 bp的多态性片段 , 能稳定地出现在果皮有毛个体中 ,
而在果皮无毛个体中不出现或很少出现 (图 1) , 说明该片段可能与桃果皮有毛性状连锁。为了验证
OPP2022258这一片段在杂交后代中的分离情况和是否确与有毛性状相连锁 , 用引物 OPP20扩增杂交
后代的全部个体 , 发现 OPP2022258这一片段在 38株果皮有毛性状个体中有 36株出现 , 而在 31株果
皮无毛性状个体中有 5株出现 (图 1) , 共 7个重组个体 , 经 Mapmaker 310软件分析表明 , OPP202
2258与果实有毛 /无毛性状的连锁距离为 1113 cM。
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　6期 姜立杰等 : 桃果实有毛 /无毛性状的 SCAR标记 　
图 1　随机引物 O PP20在分离群体中的扩增
M: 分子量标准 ; 1: 大久保 (京玉母本 ) ; 2: 京玉 ; 3: 美味 ; 4～8, 11～16: 有毛个体 ; 9, 10, 17～20: 无毛个体 ;
11, 14, 17: 重组个体。
F ig. 1　Am plif ica tion of pr im er O PP20 in segrega te popula tion
M: Marker; 1: Dajiubao; 2: J ingyu; 3: Flavortop; 4 - 8, 11 - 16: Peach individuals; 9, 10, 17 - 20: Nacterine individuals;
11, 14, 17: Recombinant individuals.
212　RAPD标记 O PP2022258的克隆和测序
将 OPP2022258片段回收、纯化后与 PUC2T vector连接 , 并转化到 E1coli中。对 6个白斑克隆进
行 Pst单酶切、N co + Sa l双酶切和 PCR扩增检测 , 均有目的片段插入 , 表现为阳性。将阳性克隆进行
两端部分测序后的结果表明 , 在序列的两端均有 OPP20引物的结合位点 , 进一步证实了克隆片段的
正确性。OPP2022258片段的两端部分序列如下 (下划线部分为 SCAR标记引物序列 ) :
GACCCTAGTCTGGATACAAAAGCATGATTGCTATCTTGATCAACAAAATTTGGATCAAAGTTAAACCAAAACT
GAAATCAAAGTGTGAGATGAGTGCCAAATTAGCAATACCTAGTCACACGAATTTTTACCAACACTCATACAACT
TAATGTCAACTCGAAGACGAAAATAAACTTCACCCTCAAATGCGTCAGTCTCCAAAGTAGCAACCCCTCTAGT
CATGAAGAAGTCCCCAGTCCCGCCAATGACAGAAACGTCCCTAGTCTTGTTCATCAATGGGTCTGCCCCGGCA
AAGTTGATGCTCCCTCTGTGTTGGGTCGAGTTGAAGACAAAGGAGAAGCCAAGCCATGCAGTGAAGATGTCTT
TCCTGTCATAAATATAGAAGCCTTGGGCACGACCAACTGGGGCAGAGTGCAAATTGTTGTCCAATGTAATTGGG
TCGTCGAACACAACAATGTTACCAAAATGGCTTTGCCCTGCCAAAATGGTTCTGTTGCCCCAGGGCGGTGAAC
CCACAATGGCTGCAGTGGCATTTTTGGAATTCTTGCCGTTGAAGATAATGTCGTGGAAATAAAAGGTTAGGTGT
CTACATGGGTGGTGAGGAGGAGGACGAGGCTTGATATGGGGTTTTGGGGTAGGGGAAGCTATGGTTGCATGGA
GGAGGAAGAAGAGGAAGAGAGCTGAAACTAGACCCTTGTTTGGTTCCATTGAGAAGCAATCAAGTGGTCAGT
TTTGCTTGGAGGAGTGAATTGGGTTGGCATTCTCGAACCTTATTATATAGGAGTTCGGAAATGTTGAATTATTAAT
TAATGATGATATCCAAATAGGTATTGGATAAAGCTTGGCTTAAAAGGCATTCTATAGCCAGGTGATTAACCAGAG
AGAGAACTTTATCCTTTTGGACTATTTAAGTTTTGATAGCTTTGGTTCTACGATTATTATCATGATTGGTGCACAG
CTTGGGTTTTGGGACCAGTGGAAAATGTTGTGGCTACAAAATCACAAAGCAACTTTTTCTTTTATTAGACGACG
TCTGTTGAAAATCCGTCGTCTATATATGCCAAATACGTCTGTTTTTGTTTAAAACCCGTCGTCTCTGTTGTGTATT
ACTTGCTATTAGATCTTTGTATAATCTGTTATAGTGATGGTCATTGCCTGTATTTTCACTTTATTATAGATAATAGGT
TATAGTGTCGGAGATGGATAAGTCATGGATGCACTCGGATAGAAGATCGAAGGCATATGAGTTTGGGGTGGAAG
CATTTTTGAACTTTGCTGTAGAAAATCTTCTAACTACAACACATGTCCGTTGTCCATGTGTTAAATGTGTTAATTT
GAAGTTGTTTGGGGTTGGAATTATAAGGGATCACTTGGCTCCTTACATGTCACATGCGTGCATAAATTTTTCTTC
TTGTAATTTTAAAGAATTACTTTTGTCGTATGTGTCAGCTTGAAATTTATTTCCAAGGCAACTCATCCTTATTTGT
AAAAAGCCAAACATAGTCATTTTTTCTTTAGCCATGAGACCAACATCTGTTGTCTTTTTCCGTTTACAAGCAACA
AATTTGGAGGTTGAAATTACCAACTCCATGCCAAACCAAACCAAACACTAGAATGAGATTAATATCCCACATGA
TGAAATATTCTAGCTTATATCCGAGTCTTTTCGATCGGTTTGTCTCCTCTCTATTTTGATGTCTAACTAACACCAAT
TCTATCTAACCTTTTCCCGAACAATAATAAGTCCACTTGCATGGAATGGAACTAGCCACCAGATCCACCAACCTA
GCGACTTAATTAACCTCGGCCATAAAAACCTCGTAGAGGAAACAAGAACTAATTTGATTGGATGTGTGATGTGT
GACGATACTAACATAACAAAAATGCGAGTAGATAGGTATATACCATCTTAAGCTCCACAGAATTCTTAAAGACA
AAATTTAGAAATATCACGAACTAGACGTTAATTAAGTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAATCTTTAGAAATATCA
CTTGATATGTGTATACAGAGCTTCTTCATACTTTGAAAATTCTCCTTTTCTATTATTTGACGTTTTCTTTGTAAGAT
GTTGGATTATTCTAATTACCTACTTAAGTGGTCTTCTAATCACCATAGGGTTGTCCTGGGCTCAATATTGAACAAG
GACTCAAATACTACTCGGCCTGTAGCCCTTGTATAAGTGTTTAAGTTAAATACATGGGCCAAAGGGATTCCTA AT
TAATATGGACTAGGGTC
213　RAPD标记 O PP2022258的 SCAR转化及验证
将该标记进行 SCAR转化时 , 根据测序的结果 , 在原有的 OPP20随机引物的基础上 , 向内延长
了 8～15个碱基 , 设计了两对特异引物。第 1对引物为 BFP94: 5piGACCCTAGTCTGGATACAAAAGCAT
3pi, 25 bp; BFP95: 5piGACCCTAGTCCATATTAATTAGG 3pi, 23 bp。第 2对引物为 BFP96: 5piGACCCTAG
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TCTGGATACA3pi, 18 bp; BFP98: 5piGACCCTAGTCCATATTAAT3pi, 19 bp。利用 BFP94和 BFP95进行
扩增时 , 有毛和无毛的个体中均扩增出了分子量为 2 258 bp的片段 , RAPD显示的多态性消失。而利
用 BFP96和 BFP98特异引物在 56℃的退火条件下进行扩增 , 则仅在京玉亲本和有毛性状的杂交后代
中扩增出单一的 OPP2022258片段 , 而美味和无毛杂交后代中则无此片段。且经反复试验 , 该标记对
反应条件、反应体系如 Taq酶、Mg2 + 、模板和引物的浓度等不敏感 , 重复性好 , 可以用于分子辅助
育种的鉴定与选择。利用有毛 /无毛性状连锁的 SCAR标记特异引物对京玉、美味和其 69株 F1 杂交
后代进行扩增 , 获得了较好的扩增效果 (图 2) , 该标记在 38株果皮有毛个体中有 36株出现 , 在 31
株果皮无毛个体中只有 3株出现 , 在 69株后代中共有 5个重组个体。这是目前桃果实有毛 /无毛性状
研究中第一个转化成功的 SCAR标记 , 命名为 SCP2022258。经 Mapmaker 310软件分析表明 , SCP202
2258与果实有毛 /无毛性状的连锁距离为 718 cM , 小于 RAPD标记的遗传距离 , 推测导致的原因可能
是 RAPD的不稳定性引起的引物与模板的部分错配。
图 2　SCP2022258在分离群体中的扩增
M: Marker; P1 : 京玉 ; P2 : 美味 ; 1～8、16～22、33～43、50～59、67、68: 有毛个体 ;
9～15、23～32、44～49、60～66、69: 无毛个体 ; 4、7、13、30、64: 重组个体。
F ig. 2　Am plif ica tion of SCP2022258 in segrega te popula tion
M: Marker; P1 : J ingyu; P2 : Flavortop; 1 - 8, 16 - 22, 33 - 43, 50 - 59, 67, 68: Peach individuals; 9 - 15, 23 - 32,
44 - 49, 60 - 66, 69: Nacterine individuals; 4, 7, 13, 30, 64: Recombinant individuals.
图 3　SCP2022258在大久保和兴津油桃杂交的 F2 分离群体中的扩增
M: Marker; 1～12、18～30、35～40: 有毛后代 ; 13～17、31～34、41、42: 无毛后代 ; 6、11、32: 重组个体
F ig. 3　Am plif ica tion of SCP2022258 in F2 segrega te popula tion of‘Da jiubao’and‘X ingjin Y outao’
M: Marker; 1 - 12, 18 - 30, 35 - 40: Peach individuals; 13 - 17, 31 - 34, 41, 42: Nacterine individuals; 6, 11, 32: Recombinant individuals.
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　6期 姜立杰等 : 桃果实有毛 /无毛性状的 SCAR标记 　
此外 , 还用 SCAR标记 SCP2022258在大久保与兴津油桃杂交的 F2 群体的 42个单株中进行了鉴
定 (图 3) , 其中果皮有毛个体 31株 , 果皮无毛个体 11株 , 除 3株重组个体外 , 扩增结果与相应性
状一致。
3　讨论
研究表明 , RAPD扩增多态性可能是引物位点几个核苷酸的序列差异或扩增片段序列内结构重排
的结果〔7〕。引物结合区一个或少数几个核苷酸的错配也可能产生多态性片段。利用设计的特异引物
进行 SCAR扩增时 , 因错配产生的多态性就有可能消失。由引物结合区的序列差异导致的多态性片段
进行转化时 , 在退火温度不够高、体系不够严谨的情况下 , 也可能不表现多态性。对转化 SCAR时多
态性消失的标记 , 可利用以下几种方法解决 : (1) 提高扩增时的退火温度 ; (2) 对于两等位基因间
单碱基的差异 , 可利用变性梯度凝胶电泳、核酸酶裂解等方法鉴别〔8〕; ( 3) 克隆等位基因的序列 ,
寻找序列差异 , 设计引物 , 或寻找酶切位点的差异 , 利用酶切的方法鉴别〔7, 9〕。本试验在进行转化
时 , 利用引物长度分别为 25 bp和 23 bp的 BFP94、BFP95引物对进行扩增 , RAPD显示的多态性消
失。而利用后设计的长度为 18 bp和 19 bp的引物对 BFP96和 BFP98进行扩增时 , 转化成功。据此推
测 , 本试验获得的多态性标记可能主要是引物序列内几个核苷酸碱基的差异。在保证特异扩增的情况
下 , 适当缩短引物的长度 , 也是转化 SCAR标记的一种有效方法。
油桃是普通桃的单基因隐性突变体〔10〕。在前人的研究中 , 均为通过构建桃遗传连锁图的方式 ,
将有毛 /无毛性状定位到连锁图上 , 间接获得有毛 /无毛性状连锁的分子标记。迄今未见 SCAR标记转
化成功的报道。相对于 RAPD标记而言 , SCAR标记所用的特异引物比 RAPD的随机引物加长了十几
个碱基 , 提高了退火温度和反应的严谨性 , 重复性好 , 成本低 , 而且有可能转化为共显性标记〔7, 11〕。
获得的特异 SCAR标记与有毛 /无毛基因的遗传距离在 10 cM之内 , 符合分子辅助育种的要求。经反
复试验 , 该标记对反应条件、反应体系如 Taq酶、Mg2 + 、模板和引物的浓度等不敏感 , 重复性好。
在此基础上 , 本实验室目前正在利用该标记展开与桃有毛 /无毛相关性状育种的苗期鉴定工作 , 及早
淘汰与育种目标不符的单株 , 加速育种进程 , 建立一种高效、快速的分子辅助育种系统。
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