全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2002 , 29 (6) : 551～555
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 10 - 22 ; 修回日期 : 2002 - 03 - 153 通讯作者。3 Corresponding author.
月季种质鉴定和多样性分析
郭立海1 ,2 　金德敏1 　王　斌1 　刘　敏1 　巢　阳3 　勇　玮3 　陈毓荃2 　翁曼丽1 3
(1 中国科学院遗传研究所 , 北京 100101 ;　2 西北农林科技大学 , 杨凌 712100 ;　3 北京市园林研究所 , 北京 100102)
摘 　要 : 利用 RAPD 技术对 28 个月季品种和 2 个蔷薇品种进行了遗传多样性分析 , 从 145 个引物中筛
选出 12 个引物 , 可以扩增出清晰、稳定和多态性高的产物。其中 3 个引物从 30 个材料中扩增出 3 个品种特
异的 RAPD 分子标记 , 并将其中的一个成功地转换成了 SCAR 标记。利用筛选出的 12 个引物扩增出的 65 条
多态性片段作了聚类分析 , 对这些月季品种的亲缘关系和进化作了初步探讨。
关键词 : 月季 ; 种质鉴定 ; RAPD 标记 ; SCAR 标记 ; 聚类分析
中图分类号 : S 68 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0620551205
月季 ( Rosa chinensis Jacq) 是蔷薇科蔷薇属的一个重要类群 , 种类繁多 , 来源广泛 , 加上频繁的
种内杂交 , 其种质资源复杂多样 , 使分类和鉴定工作难度加大。以往的形态学和生理生化指标鉴定分
类受环境因素和发育阶段的影响 , 很难满足月季分类鉴定、产权保护和选育工作的需要。国外有人证
明 RAPD 技术可以应用于月季种质鉴定和多样性分析〔1～3〕, 在我国此类工作刚刚开展。本研究的目的
是通过 RAPD 分析来寻找北京市主要月季品种的特异分子标记 , 进而将其转换成稳定的 SCAR 标记 ,
并对部分月季品种进行遗传多样性和亲缘关系的初步探讨 , 以期用于月季的分类鉴定和选育工作。
1 　材料与方法
考虑到现代月季有一些是通过和蔷薇杂交得到的 , 故本试验材料中除了月季外还用了两种蔷薇。
供试材料共 30 个 , 包括了月季的 7 个类群和 1 种所属类群不明确的月季材料 (表 1) 。
模板 DNA 的制备和 RAPD 扩增反应 : 春季从北京市园林研究所取健康正常幼叶放于冰壶带回实
验室 , 液氮研磨 , 进行 DNA 的提取 , 纯化 , 并在 1. 0 %的琼脂糖凝胶电泳中进行模板 DNA 定量〔4〕。
RAPD反应在 MJ PTC2100 型扩增仪上完成 , 所用引物为美国 Operon 公司产品。扩增反应体系为 :
10 mmol/ L Tris2HCl (pH 9. 0) , 50 mmol/ L KCl , 每种 dNTPs 0. 1 mmol/ L , 2. 1 mmol/ L MgCl2 , 15 ng 引
物 , 20 ng 模板 , 1U Taq DNA 聚合酶 , 反应体积为 25μL。扩增反应程序为 94 ℃预变性 4 min , 然后按
程序 : 94 ℃45 s , 37 ℃ 1 min , 72 ℃1. 5 min 扩增 42 个循环 , 最后在 72 ℃延伸 5 min , 扩增产物在
1. 0 % 琼脂糖凝胶中电泳 , 经 EB 染色后在紫外灯下观察照相。
聚类分析 : 首先将扩增的 RAPD 片段的多态性信息转化成计算机语言 , 即在某一分子大小处出现
电泳带记为 1 , 不出现记为 0 , 利用平均连锁聚类方式 (UPGMA) 软件进行聚类作图〔5〕。
RAPD特异扩增产物的回收 , 克隆和测序 : 在紫外灯下从琼脂糖凝胶上将目标带切下 , 用
glassmilk 法分离纯化 , 按照生产厂家提供的程序克隆到 PGEMÒ2T easy Vector 系统 (Promega Corporation ,
Cat . No. A1360) , 然后转入 E. coli XL12blue 菌株中 , 提取质粒 , 酶切确认为正确克隆 , 然后送博亚
公司 (上海) 测序。
SCAR 引物的设计及 SCAR - PCR 反应 : 参考 RAPD 特异产物两个 5’端的碱基序列 , 按 Paran 的方
法〔6〕设计一对 20～22 bp 的 SCAR - PCR 引物 , 每对引物都包含对应的 RAPD 引物的 10 个碱基序列 ,
引物的合成由博亚公司完成。在 Perkin2Elmer Cetus 480 型 DNA 扩增仪上先按常规反应条件进行扩增 ,
并按照 Stratagene PCR 优化试剂盒的实验指导对反应条件和程序进行筛选比较 , 直至获得理想的条
件〔7〕。扩增产物在 1. 0 %的琼脂糖凝胶中电泳 , 经 EB 染色后在紫外灯下观察照相。
表 1 　供试材料编号、类群和主要性状
Table 1 　List of samples used for RAPD analysis
序号
No.
名称
Name
类群
Section
主要性状
Major characters
1 金　门 HT 金黄色 , 重瓣
Golden Gate Golden yellow , multiplicate
2 红双喜 HT 红边黄心 , 重瓣
Double Delight Red margin multiplicate flower
with yellow in middle
3 火和平 HT 正红背金 , 重瓣
Kronenbourg Red multiplicate flower with
antitropic gold
4 漂多斯 HT 淡黄色 , 重瓣
Peaudouce Light yellow , multiplicate
5 绿　云 HT 白微带绿色 , 重瓣
Lüyun White with little green ,multiplicate
6 梅郎随想曲 HT 正红背白 , 半重瓣
Caprice de Meilland Red semidouble flower with
antitropic white
7 金玛利 Golden Marie F 黄色 , 半重瓣 Yellow , semidouble
8 金色赫尔斯坦 F 黄色 , 半重瓣
Golden Holstern Yellow , semidouble
9 仙　境 F 浅粉色 , 重瓣
Paradise Light pink , multiplicate
10 曼海姆 F 红色 , 半重瓣
Sohloss Man Hieim Red , semidouble
11 金秀娃 CL 黄色 , 半重瓣
Golden Showers Yellow , semidouble
12 至高无上 Altissimo CL 红色 , 单瓣 Red , haplopetalous
13 怜　悯 CL 粉色黄心 , 半重瓣
Compassion Pink semidouble flower with
yellow in middle
14 橘红色火焰 CL 橘红色 , 半重瓣
Darthuizer Orange Fire Tangerine , semidouble
序号
No.
名称
Name
类群
Section
主要性状
Major characters
15 藤墨红 CL 深红色 , 重瓣
Lillair rrleell Deep red , multiplicate
16 新　月 CL 浅粉色 , 半重瓣
New Dawn Light pink , semidouble
17 坎特公主 G 金黄色
Princess Michael of Kent Golden yellow
18 粉后 Queen Elizabeth G 粉红色 Pink
19 白佳人 Bajazzo G 白色 , 重瓣 White , multiplicate
20 肯特 Kent Gr 白色 , 半重瓣 White , semidouble
21 哈德富郡 Hertfordshine Gr 粉色 , 单瓣 Pink , haplopetalous
22 巴西诺 Gr 红色黄心 , 单瓣
Bassino Red haplopetalous flower with
yellow in middle
23 胡佛总统 HT 红色 , 半重瓣
Present Herber Hoover Red , semidouble
24 为何不 Min 先黄再红后粉 , 重瓣
Why not Yellow then red and then pink
multiplicate flower
25 小女孩 Min 深红色 , 半重瓣
Little Girl Deep red , semidouble
26 尖刺蔷薇 蔷薇 白色 ,单瓣
Sptinter rose Rosa L. White , haplopetalous
27 疏花蔷薇 蔷薇 白色 , 单瓣
Sparse flower rose Rosa L. White , haplopetalous
28 白花十姐妹 Pol 白色 , 重瓣
White ten sisters White , multiplicate
29 粉花十姐妹 Pol 粉色 , 重瓣
Pink ten sisters Pink , multiplicate
30 香 紫 绒 不详 粉红色 , 重瓣
Fragrant purple flamel Unknown Pink , multiplicate
　　注 : F : 丰花月季 ; G: 大花月季 ; Min : 微型月季 ; HT: 杂种茶香月季 ; CL : 藤本月季 ; Gr : 地被月季 ; Pol : 小花矮灌月季。
Note : F : Floribunds roses ; G: Grandiflora roses ; Min : Miniature roses ; HT: Hybrid tea roses ; CL : Climbing roses ; Gr : Ground roses ;
Pol : Polyantha roses.
2 　结果与分析
2. 1 　月季特异 RAPD 标记和多态性片段的获得
从 30 个供试材料中先随机选出 12 个材料进行引物筛选 , 从 145 个引物中初筛出 40 个能产生较清
晰多态性片段的引物 , 然后利用这 40 个引物来扩增供试的 30 个材料 , 每个引物重复扩增 3 次。从中
选出 12 个引物 , 能在 30 个材料中扩增出清晰的重复性好的多态性片段。从 RAPD 扩增情况来看 , 每
个引物扩增出的 RAPD 谱带一般有 2～11 条 , 每条带的分子量在 0. 3～4. 0 kb。经过重复试验 , 获得
了 3 个月季品种 (9 号仙境、10 号曼海姆和 21 号哈德富郡) 的特异分子标记 , 它们的特异标记分别
为 OPR216877、OPQ217520和 OPT2091600 , 其 RAPD 扩增图谱如图 1 所示。从图 1 可以看出每个特异扩增
产物只在一个材料中出现 , 具有品种特异性。月季品种间的多态性很高 , 12 个引物共扩增出 65 条
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带 , 只有 2 条带是 30 个材料共有的 , 其它 63 个条带在材料间或多或少都有差异。
图 1 　月季 RAPD 特异分子标记的获得
A、B、C分别示特异 RAPD 标记 OPR216877、OPQ217520和 OPT2091600 , 图中 1～30 泳道对应于表 1 中相同编号的材料 ,
M为 DNA 分子量标准 DL2000 (TaKaRa Biotech. Co. Ltd) , 箭头示特异条带。
Fig. 1 　Specific RAPD markers of rose
A , B and C represent specific RAPD markers OPR216877 , OPQ217520 and OPT2091600 respectively.
M represents DNA marker DL2000 (TaKaRa Biotech. Co. ltd) ; arrows indicate the specific fragment ; Numbers of materials are inferred to table 1.
2. 2 　RAPD 产物的测序及 SCAR引物设计
共获得 3 个 RAPD 特异片段 , 仅对其中两个单拷贝片段 (OPR216877和OPT2091600) 进行了测序。根
据其序列 , 设计了 SCAR2PCR 引物的序列如下 :
2. 3 　SCAR标记的转换
利用前述的 RAPD 反应体系 , 设置不同的反应条件摸索理想的 SCAR2PCR 反应程序 , 其中 OPR2
16877 RAPD 标记已被成功地转换成了 SCAR 标记 (见图 2) 。其 SCAR2PCR 反应体系为 : 10 mmol/ L Tris2
HCl (pH 9. 0) , 50 mmol/ L KCl , 2. 1 mmol/ L MgCl2 , 每种 dNTPs 各为 0. 1 mmol/ L , 15 ng 引物 , 20 ng
模板 DNA , 1U Taq DNA 聚合酶 , 反应体积为 25μL ; 反应程序为 : 94 ℃预变性 4 min , 然后按程序 :
94 ℃1 min , 60 ℃1 min , 72 ℃1. 5 min 扩增 30 个循环 , 最后在 72 ℃延伸 5 min。而 OPT2091600没能转换
成 SCAR 标记 , 在设置的各种反应条件和反应程序下 , 除了 21 号哈德富郡正常扩增出 1 600 bp 片段
外 , 其它一些材料也能扩增出此片段。
我们将 OPR216877的序列在 GenBank 上做 Blast 分析 , 进行同源性比较 , 未发现与 GenBank 中已有
序列有较高同源性。
3556 期 　　　　　　　　　　　　　　郭立海等 : 月季种质鉴定和多样性分析 　　　　　　　　　　　　　　　
图 2 　‘仙境’SCAR标记的获得
A、B 分别为特异标记 OPR216877的 RAPD 扩增图谱和相应 SCAR 扩增图谱。图中 1～30 泳道对应于表 1 中相同编号的材料 ,
M为 DNA 分子量标准 DL2000 (TaKaRa Biotech. Co. Ltd) .
Fig. 2 　SCAR marker of rose‘Paradise’
A and B show the specific RAPD marker OPR216877 and specific SCAR marker respectively. M represents DNA marker DL2000
(TaKaRa Biotech. Co. Ltd) . Numbers of materials are inferred to table 1.
2. 4 　聚类分析
根据筛选出的 12 个引物扩增出的 65 条谱
带 , 利用平均连锁聚类方式 (UPGMA) 软件进
行聚类分析 , 生成 30 个供试材料的亲缘关系树
状图 (图 3) 。当聚合线取在相似系数为 0. 7 时 ,
30 个供试材料被分为 6 大类 , 绝大多数材料的
分类结果与传统分类结果一致 , 但有几个例外
(见讨论) 。
3 　讨论
月季品种繁多 , 彼此杂交频繁 , 命名没有规
则 , 很多月季品种的谱系遗传背景不清楚 , 所以
根据亲缘关系农艺性状进行分类存在一定困难。
本研究根据 RAPD 分析结果对供试的 30 份材料
进行了聚类 , 在相似系数为 0. 7 时这 30 份材料
被聚类为 6 个类群。从图 3 中可以看出 , 尖刺蔷
薇和疏花蔷薇聚在一起而与其它材料区别开 , 表
明这两个蔷薇与月季的亲缘关系比较远 , 可能是
比较原始的蔷薇品种。而其余 28 个材料分成了
　　　　　　
图 3 　根据 RAPD 分析绘制的 30 个供试材料的聚类图
样品编号见表 1。
Fig. 3 　Cluster analysis of 30 individuals based on RAPD data
Numbers of materials are inferred to table 1.
两大组 , 第一组包括了供试的所有的杂种茶香月季 , 丰花月季 , 藤本月季和大花月季品种 , 这些月季
品种没有完全归到各自所属的类群中 , 这一方面说明 , 这四个类群之间发生过相互杂交 , 导致一个品
种可能包含了几个类群的遗传因子 , 类群之间的界限已经变得不清晰 , 发生了基因的渗透和交换 ; 另
一方面也证实了藤本月季的大部分是从杂种茶香和丰花等灌木月季芽变而来〔8〕, 它们的基因组很大部
分是相同的。但聚类结果仍能基本反映出各类群所含品种遗传背景的一致性 , 一个类群内的大部分品
种还是聚在了一起 , 如 1 号金门、23 号胡佛总统、3 号火和平、4 号漂多斯和 5 号绿云 5 个杂种茶香
月季 , 17 号坎特公主和 19 号白佳人 2 个大花月季 , 11 号金秀娃、12 号至高无上、16 号新月、13 号
怜悯和 15 号藤墨红 5 个藤本月季 , 都分别聚在了一起 , 还有 7 号金玛利、8 号金色赫尔斯坦和 9 号仙
境、10 号曼海姆 4 个丰花月季也分别聚在了一起 , 表明各类群的品种亲缘关系近 , 起源基本相同。
第二组包括了供试的所有地被月季品种和微型月季品种 , 地被的 3 个品种 20 号肯特、21 号哈德富郡、
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22 号巴西诺和微型的 24 号为何不、25 号小女孩聚在了一起 , 这可能是由于它们的性状 (如花小 , 株
型小) 不显眼而没有引起育种家的重视 , 避免了种内杂交从而保持了其遗传背景的一致性 , 进化比较
保守。28 号和 29 号 , 它们是十姐妹型月季 , 属于古代月季中的小花矮灌月季〔8〕, 所以聚在了一起 ,
30 号香紫绒和两个十姐妹型月季聚在了一起 , 说明它们的亲缘关系较近 , 从聚类图可以看出这 3 个
月季与地被和微型月季的亲缘关系相对较近 , 而与杂种茶香、大花、丰花和藤本月季的亲缘关系相对
较远。本实验的结果表明依据分子标记的聚类结果与传统方法的聚类结果基本一致 , 在实际应用时 ,
用分子标记聚类得出的结果应与传统分类的结果结合起来分析 , 相互印征。对一些表现型相近而难以
区分的材料而言 , 分子标记分析得出的结果会更有价值。
参考文献 :
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8 　余树勋. 月季. 北京 : 金盾出版社 , 1992. 106 页
Variety Identif ication and Genetic Diversity Analysis of Rose with RAPD
Molecular Markers
Guo Lihai1 ,2 , Jin Demin1 , Wang Bin1 , Liu Min1 , Chao Yang3 , Yong Wei3 , Chen Yuquan2 , and Weng Manli1
(1 Institute of Genetics , CAS , Beijing 100101 , China ;　2 Northwest Sci2Tech University of Agriculture and Forestry , Yangling 712100 ,
China ;　3 Beijing Landscape Gardening Research Institute , Beijing 100102 , China)
Abstract : Variety identification and genetic diversity analysis of rose were studied using RAPD technique. A
total of 30 individuals were analyzed , 3 specific RAPD markers were found from 65 RAPD bands amplified with 12
primers. One of them was converted to SCAR marker. Phylogenetic relationships of the 30 individuals was
developed based on phylogenetic tree conducted with UPGMA method.
Key words : Rose ; Germplasm identification ; RAPD markers ; SCAR markers ; Cluster analysis
海峡两岸园艺发展学术研讨会在厦门召开
由福建省科协、中国园艺学会、中国农学会庭院经济分会、台湾大学园艺学系、福建省园艺学会、福建省农学会
庭院经济分会共同主办 , 厦门市园艺学会协办的“海峡两岸园艺发展学术研讨会”于 2002 年 10 月 22～28 日在厦门市
隆重召开。参加本次会议的园艺、园林和庭院经济学界的两岸学者共 80 余人 , 其中来自中国大陆的有中国工程院院
士、中国园艺学会副理事长方智远研究员 , 中国工程院院士、山东农业大学园艺学院束怀瑞教授以及 8 所高等院校和
科研单位 50 多位专家学者 , 来自中国台湾的有台湾大学园艺学系名誉教授康有德先生和凌德陵先生以及 5 所大学和
科研单位的专家教授 26 人。会议共收到学术论文 72 篇。这次学术讨论会以园艺业发展为主题 , 多层面探讨了园艺业
发展的热点问题 (包括两岸园艺发展势态、两岸农业资源优势互补、加入 WTO 的应对措施等) , 促进了两岸学者的了
解与合作。
中国园艺学会办公室
2002 年 10 月 30 日
5556 期 　　　　　　　　　　　　　　郭立海等 : 月季种质鉴定和多样性分析