全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2001 , 28 (5) : 392～398
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2000 - 11 - 06 ; 修回日期 : 2001 - 05 - 18
基金项目 : 山东省科委良种产业化工程资助项目 ; 山东省人事厅资助项目 ; 山东省农业科学院资助项目 (98206)
抗菌肽 MB39基因导入‘皇家嘎啦’苹果及其
四倍体植株的培育
刘庆忠1 　赵红军1 　刘　鹏1 　Mong Rengong2 　Freddi A. Hammerschlag3
(1 山东省果树研究所 , 泰安 271000 ;　2USDA/ ARS HCRL , Corvallis , OR 97330 , USA ;　3USDA/ ARS , Fruit
Laboratory , Beltsville , MD 20705 , USA)
摘 　要 : 采用农杆菌介导法 , 将抗菌肽 MB39基因转入‘皇家嘎啦’苹果 , 获得了 7 个转
基因株系。通过秋水仙素诱变染色体组工程育种技术 , 由转化体叶片获得了 20 个四倍体植
株。经 PCR 检测和 Southern Blotting 杂交证明 , 抗菌肽 MB39基因已经整合到皇家嘎啦苹果的染
色体组中。转基因株系 TR21、TR23 提高了对火疫病的抗性。采用流式细胞技术 ( Flow
Cytometry) 确定植株为四倍体。
关键词 : 抗菌肽 MB39 ; 转基因 ; 苹果 ; 四倍体 ; 秋水仙素
中图分类号 : S 661. 1 ; Q 78 　文献标识码 : A 　文章编号 : 05132353X (2001) 0520392207
‘皇家嘎啦’ ( Malus domestica Borth. cv. Royal Gala) 苹果为新西兰育成品种 , 因成熟
期正值晚夏水果淡季而倍受人们的欢迎 , 现已成为世界上最重要的苹果品种之一。但该品
种果实小 , 抗病性较差 , 易感火疫病、白粉病、轮纹病、腐烂病等 , 给生产者造成了很大
损失〔1〕。抗菌肽 B 是在天蚕体内发现的一种有广谱抗细菌和真菌特性的多肽类化合物 ,
MB39系人工合成 , 其结构类似于抗菌肽 B , 在生物体内活性及稳定性更高〔2〕。有报道指出
转 MB39基因的烟草增强了对丁香假单孢菌 ( Pseudomonas syringae) 的抗性〔3〕。抗菌肽
Attacin E导入苹果矮化砧木 M26获得了抗火疫病的植株〔4〕。染色体倍性操作已广泛应用于
果树的育种中 , 秋水仙素处理诱导多倍体现已成为增大果实育种的有效手段〔5 ,6〕。本研究
的目标是采用基因工程手段将抗菌肽 MB39基因导入苹果 , 并通过细胞工程手段将其染色
体组加倍 , 获得既抗病 , 果实又大的皇家嘎啦新品系。
1 　材料与方法
1. 1 　植物材料
将离体生长的皇家嘎啦苹果新梢保存在增殖培养基上〔7〕, 每隔 4 周取 1 cm 新梢作为
外植体转移 1 次。增殖培养基为 MS 无机盐添加肌醇 100 mg/ L、盐酸硫胺素 0. 5 mg/ L、62
苄基嘌呤 1. 0 mg/ L、吲哚丁酸 0. 1 mg/ L、赤霉素 0. 5 mg/ L、蔗糖 30 g/ L 和琼脂 7 g/ L ,
pH值 5. 6。培养室温度 25 ℃, 光照强度 2 000 lx , 光周期为 16 h 光照、8 h 黑暗。新梢在
正常条件下生长 2 周后转入全黑暗条件下生长 2 周 , 进行白化处理 , 获得白化新梢〔8〕。
1. 2 　基因、载体与农杆菌株系
本试验所用的抗菌肽 (cecropin) MB39基因是根据来自天蚕 ( Hyalophora cecropia) 的抗
菌肽 B 序列 , 经人工修饰而成〔3〕, 其对应的氨基酸序列见图 1。构建嵌合基因所用的启动
子 Osmotin 来自烟草 , 属于损伤诱导型。构建时在 Osmotin 和 MB39之间加接大麦α2淀粉酶
信号肽基因 , 使目的基因的表达产物分泌到细胞外 , 整个嵌合基因的构建简图见图 2。将
构建好的基因克隆到 p GV 双元载体内 , 然后转化到根癌农杆菌 (Agrobacterium tumef aciens)
EHA105 中。农杆菌的培养基为 YEB (牛肉胨 5. 0 g/ L , Difco Bacto 牛提取物 5. 0 g/ L , 酵
母提取物 1. 0 g/ L , 蔗糖 5. 0 g/ L , 琼脂 15 g/ L , 卡那霉素 50 mg/ L , pH值 7. 2) 。
图 1 　抗菌肽 MB39与 cecropin B的氨基酸序列比较
方框处表示两者氨基酸序列结构上的差异
Fig. 1 　Amino acid sequence of cecropin B and a synthetic homologue MB39
Frame indicates structural difference
图 2 　抗菌肽 MB39嵌合基因构建图
Fig. 2 　Schematic representation of the T2DNA of the binary vector pGV. containing cecropin MB39
1. 3 　共培养与转基因植株再生
农杆菌在 YEB 液体培养基上生长一昼夜 (200 r/ min , 28 ℃) , 离心提取细菌后在液体
培养基上悬浮。液体悬浮培养基为 N6 大量元素、LS 微量元素 , 附加乙酰丁香酮 20μmol/
L、TDZ 1. 0 mg/ L 和NAA 0. 5 mg/ L , 稀释到光密度为 cfu 2 ×108/ mL。将切割好的外植体于
农杆菌液中浸蘸 , 取出后转移到与悬浮农杆菌相同的液体培养基上共培养 48 h , 然后转移
到 N6 附加 TDZ 1. 0 mg/ L、NAA 0. 5 mg/ L、头孢噻吩 100 mg/ L、羧苄青霉素 100 mg/ L 和卡
那霉素 50 mg/ L 的培养基上 , 连续选择培养 6 周 , 每隔 2 周更换 1 次新鲜培养基。
1. 4 　PCR测试和 Southern Blotting 杂交
采用Dellaporta 等的方法提取DNA , 采用DNA 多聚酶链反应 (PCR) 和 Southern Blotting
杂交确定 MB39基因是否已整合到苹果染色体上。PCR 扩增所用引物为 , α2Amy : 5’2GCTC2
GAGCCATGGGGAAGAAG23’; cec8 : 5’2TCGAATTCTTATCCTAGCGCTTTG23’。
扩增的片段为 207 个核苷酸。反应条件是 94 ℃变性 4 min , 然后 94 ℃ 1 min , 55 ℃
1 min , 72 ℃1 min , 30 个反应循环 , 最后 72 ℃7 min。
染色体组 DNA 用限制性内切酶消化、琼脂糖电泳、DNA 向尼龙膜上转移、制备
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Genius非同位素地高辛 (Digoxiginin) 标记探针以及核酸杂交均根据药品供应厂商
(Boehringer Mannheim) 提供的说明进行。
1. 5 　秋水仙素处理
取离体新梢顶部 1～2 节成熟展开的叶片 , 首先切除叶柄和叶尖 , 然后沿中脉处横切
两刀造成两个伤口 , 随即放入含有秋水仙素 25 mg/ L 的液体再生培养基中培养 , 每处理 30
个外植体。再生培养基的成分是 N6 大量元素、LS 微量元素、肌醇 100 mg/ L、盐酸硫胺素
0. 5 mg/ L、TDZ 2. 0 mg/ L、水解酪蛋白 300 mg/ L、蔗糖 30 g/ L , pH值 5. 4。培养 5 d 后将
叶片外植体取出 , 用无菌水冲洗两遍后转移到不含秋水仙素、其它成分相同的固定再生培
养基上继续进行不定芽诱导 , 6 周后将获得的不定芽芽丛进一步分割 , 转移到新梢增殖培
养基上继代培养。在此期间根据目测将有形态变异的新梢单独取出进行增殖。
1. 6 　倍性鉴定
取 10 mg 离体新梢叶片 , 在 0. 5 mL 的 Partec HR2A 溶液 (分离细胞核的柠檬酸缓冲
液) 中研磨 , 然后通过 30μm Partec CelltricsTM微孔膜过滤到测试管中。在样品中加 0. 5 mL
Partec HR2B 溶液 (DAPI溶液) , 置于 Partec 倍体分析仪 (德国 , Münister) 测定样品单个细
胞核的 DNA 总量 , 结果由仪器直接绘出 DNA 曲线图。
1. 7 　生根及田间移栽鉴定
将经 Southern Blotting 分析证明已转入基因、倍体分析仪测定为四倍体的材料 , 在新梢
增殖培养基上进行扩大繁殖 , 在 1/ 2 MS 附加 IBA 0. 1 mg/ L 的生根培养基上诱导生根。生
根后移栽于土壤 , 先在温室条件下锻炼 4 周 , 然后移栽于大田。再将大田生长的新梢取
下 , 高接到苹果大树上或嫁接到田间的平邑甜茶 ( Malus hupehensis) 实生苗上。
1. 8 　抗火疫病性能鉴定
将获得的转基因植株移栽于生长盘中 , 当植株旺盛生长到 15 cm 时 , 用注射针向新梢
顶部接种 cfu 5 ×107/ mL 火疫病细菌 ( Erwinia amylovora)〔4〕, 试验重复 3 次 , 每重复接种 7
株。接种后每隔 3 d 调查 1 次顶端坏死的长度 , 直到某些植株的幼茎全部坏死时为止。采
用最小差异法 (LSD) 进行显著性检验。
2 　结果分析
2. 1 　获得转基因植株
将 200 个白化茎段外植体 , 在培养基上与含有双元质粒载体 pOsmotinMB39的农杆菌
EHA105 共培养 , 其中有 3 个外植体再生出了转化体 ; 在另一试验中 , 同样采用 200 个白
化茎段外植体 , 获得了 4 个转化体 , 转化效率为 1. 5 %～2. 0 %。将获得的 7 个转化体在含
有卡那霉素 20 mg/ L 的生根培养基上诱导生根 , 其生根率均超过 85 %。而皇家嘎啦对照
(Wild type) 的离体新梢基部变白 , 不能生根 , 但其在不含卡那霉素的培养基上生根率可
达 86 %。同样 , 在含卡那霉素的再生培养基上 , 所有转化体的离体叶片均能再生不定芽 ,
而对照则不能。这说明苹果转化体的抗卡那霉素基因已经嵌合到苹果体内 , 并得以表达。
2. 2 　外源抗菌肽基因的整合
从得到的 7 株转化植株叶片中提取DNA , 分别采用 Sst Ⅰ和 Hind Ⅲ+ Xba Ⅰ进行酶切
(图 2) , 采用 PCR 和 Southern Blotting 分析 (图 3、图 4) , 表明 MB39基因已完全整合到皇家
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　　　　　　　　　嘎啦苹果的基因组内。采用 Hind Ⅲ+ Xba
Ⅰ酶切、电泳、探针杂交表明 , 其中 1 个
株系有 1 个拷贝数 , 3 个株系有 2 个拷贝
数 , 其它 3 个株系分别含有 3、4、7 个拷
贝数 (图 4) 。所转基因在植物体内拷贝数
的多少 , 对转入基因的表达有正面或负面
的影响。采用 Sst Ⅰ酶解能准确地预见所
切出的片段大小 , 但其中 TR21 株系多了一
个未能预见的片段 (图 4) , 这表明外源基
因在整合过程中发生了重组 , 但基因重组
后对植物本身有何影响 , 需进一步研究。
图 3 　转抗菌肽 MB39基因苹果的 PCR分析
M: DNA 分子量标记 ; 1 : 未转化植株 (对照) ;
2～5 : 转化体。
Fig. 3 　PCR analysis of cecropin MB39 gene of
putative transgenic apple
M: Marker : λDNA ( EcoR/ Hind Ⅲ) ; 1 : Wild type ;
2 - 5 : Putative transgenic line.
图 4 　转抗菌肽 MB39基因苹果的 Southern Blotting 分析
所有的 DNA 用限制性内切酶 Sst Ⅰ消化 , 以表示已知大小片段的插入 (左) , 用 Xba Ⅰ和 Hind Ⅲ消化表示
导入基因的拷贝数 (右) 。M: DNA 分子量标记 , 从下到上依次为 1. 0、2. 0、3. 0、5. 0、8. 0 和 10. 0 kb ;
RG: 未转化植株 (对照) ; TR21～TR27 : 转化体。
Fig. 4 　Southern blotting analysis of transgenic‘Royal gala’
All genomic DNA was cut with one restriction enzyme (Sst Ⅰ) digest to show an insert of the predicted size (Left) , and
the other (Xba Ⅰand Hind Ⅲ) digest used to shown copy number (Right) . M: Molecular weight markers at 1. 0 ,
2. 0 , 3. 0 , 5. 0 , 8. 0 , 10. 0 kb from bottom to top . RG: Wild type , TR21 - TR27 : Putative transgenic line.
2. 3 　抗病性鉴定
用 cfu 5 ×107/ mL 浓度的火疫病病菌悬浮液接种每个转基因株系 , 以发病茎长度占整
个茎长度的百分数来表示植株抗病的程度 , 其结果 (图 5) 表明 , 接种后第 12～17 天两个
转基因株系的发病程度明显低于未转基因的对照 (LSD0. 05 = 12. 8 ; 16. 2 ; 18. 8) , 此时两
个转基因株系 TR21、TR23 新梢坏死的比例分别为 31. 37 %～43. 2 %和 42. 4 %～55. 3 % , 而
对照 RG则为 61. 3 %～76. 2 %。在接种 12 d 前和 17 d 后 , 转基因株系与对照之间的发病
程度无明显差异。该项工作表明 , 转抗菌肽 MB39基因的皇家嘎啦苹果增加了对火疫病病
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　　　　　　　　原细菌的抗性。
2. 4 　转基因四倍体植株的获得及鉴定
试验中 , 将来自转基因株系 TR21、
TR23 的各 30 个叶片外植体 , 置于含有秋
水仙素的不定芽再生培养基上 , 分别从 9
和 11 个外植体上获得了四倍体新梢 , 分别
占接种外植体数的 30 %和 36. 7 %。
使用德国 Partec 倍性分析仪对诱变材
料进行倍性鉴定 , 并采用流式细胞技术
(Flow Cytometry) 测定离体新梢叶片单个细
胞核的 DNA 含量。由倍体分析仪自动绘制
的 DNA 含量分布曲线如图 6。图中显示的
两个峰值为对照 (二倍体) 和诱变材料
(四倍体) 细胞核内 DNA 的含量分布 , 可
见诱变材料的 DNA 含量比对照高出一倍之
多 (201. 48∶100. 28) , 从而证明诱变材料
的染色体组比对照高出一倍 , 为四倍体。
图 6 　二倍体与四倍体转基因‘皇家嘎啦’苹果
的 DNA含量分布图
Fig. 6 　The DNA distribution histogram of transgenic
diploid and tertraploid‘Royal Gala’analyzed
图 5 　接种 Erwinia amylovora 细菌后生长在培养盘
( PlantCon) 内的植株火疫病病情发展
TR21、TR23 : MB39转基因株系
RG: 未转基因的‘皇家嘎啦’苹果
Fig. 5 　The development of Fireblight in growth chamber2
grown plants following inoculation with Erwinia amylovora
TR21 and TR23 is a transgenic line. RG is nontransgenic control
‘Royal Gala’, one of fireblight susceptible apple cultivars
图 7 　转基因皇家嘎啦苹果在植物生长盘内
生长 6 周的形态特征
Fig. 7 　Appearance of transgenic‘Royal Gala’grown
in the PalntCon for 6 weeks
2. 5 　转基因四倍体植株的营养生长特性
将生根后的转基因诱变新梢移栽于植物生长盘 (PlantCon) 内 , 在培养室内生长 6 周 ,
测量观察表明 , 所有四倍体株系生长缓慢 , 植株顶端生长点较对照矮 , 茎粗壮 , 叶片变
圆 , 叶片长宽比变小 (图 7 , 表 1) , 叶缘锯齿深 , 叶片浓绿。将其嫁接在平邑甜茶砧木
上 , 也表现出节间短、矮化、叶柄粗、叶片变圆等特点。这表明皇家嘎啦苹果四倍体与二
倍体的形态特征有明显不同。不论是二倍体还是四倍体 , 相同倍性的不同株系之间尚未看
出差别。
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表 1 　二倍体与四倍体转基因‘皇家嘎啦’苹果在植物生长盘内生长 6 周的形态表现
Table 1 　Phenotypic characteristics of transgenic diploid and tetraploid‘Royal Gala’grown in the PlantCon for 6 weeks
株　系
Lines
株 高 Height (cm)
TR21 TR23 茎 粗 Stem diameter (mm)TR21 TR23 叶片长宽比 Leaf length/ breadth ratioTR21 TR23
二倍体 Diploid 4. 82 a 3 5. 33 a 1. 3 b 1. 2 a 1. 94 a 2. 03 a
四倍体 Tetraploid 3. 62 b 3. 26 b 1. 9 b 1. 9 b 1. 60 b 1. 60 b
　　3 所有数据以LSD 法检验 , 字母不同者表示二倍体与四倍体之间差异显著 (P ≤0. 05) 。3 Difference letters indicate significance between diploid and tetraploid at P ≤0. 05 by LSD test .
3 　讨论
苹果的遗传转化研究已在许多品种上获得转基因植株 , 如矮化砧木 M26、元帅、嘎
啦、乔纳金、金帅、艾斯塔等 , 但均采用叶片为外植体 , 所用的基因多为标记基因 GUS
和抗除草剂基因 , 很难直接用于苹果的生产中去。本项研究采用白化茎段〔8〕为外植体 , 将
抗病基因抗菌肽 MB39转入生产上极为重要的苹果品种皇家嘎啦中去 , 获得抗病转基因株
系 , 这对于苹果采用分子育种技术进行改良具有重要意义。
尽管采用叶片外植体已成功地获得了苹果的转基因植株 , 但转化效率低 , 多为 0. 1 %
～0. 5 %〔9〕。在本项研究中 , 以白化茎段为外植体 , 采用农杆菌 EHA105 介导 , 将抗菌肽
MB39基因转入皇家嘎啦苹果 , 取得了 1. 5 %～2. 0 %的较高转化效率。这与我们先前采用
含有 p GVp35SGus 载体的农杆菌 EHA101 所取得的 2. 0 %的转化效率〔7〕相一致。这从侧面进
一步证明 , 外植体白化处理能够促进苹果的基因转化〔8〕, 同时也说明我们已建立起来的采
用白化茎段为外植体的苹果基因转化技术体系〔7〕是可行的。
自 1930 年秋水仙素诱导多倍体技术问世以来 , 许多作物获得了多倍体。就苹果而言 ,
以采用成年树离体叶片不定梢进行诱导更为有效 , 并且可以避开童期的干扰。离体叶片于
再生培养基上与低浓度秋水仙素长时间接触诱导 , 使秋水仙素参与叶片不定梢原基形成的
全过程 , 最大限度地减少或消除了嵌合体形成的可能 , 因为叶片外植体的不定梢多起源于
单细胞〔10〕。本项工作的目标之一是获得比原皇家嘎啦苹果果实更大的株系。Einset 和
Imhofe 已报道了因亲本染色体加倍而出现“大果”或“巨型果”的苹果芽变〔11 ,12〕。瑞士业
已培育出了四倍体的大果型品种‘Alpha 68’〔6〕。本研究中已经获得的四倍体转抗病基因植
株 , 通过大树高接和田间苗木繁育 , 已初步看出节间短 , 株型紧凑 , 叶片圆而厚 , 叶色深
绿等 , 显现出大果型苹果品种的特点 , 其经济性状与二倍体对照的比较有待进一步研究。
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Regeneration of Tetraploid Plants with Cecropin MB39 Gene from
‘Royal Gala’Apple
Liu Qingzhong1 , Zhao Hongjun1 , Liu Peng1 , Mong Rengong2 , and Freddi A. Hammerschlag3
(1 Shandong Institute of pomology , Tai’an , Shandong 271000 ;　2 USDA/ ARS HCRL , Corvallis , OR 97330 , USA ;
　3 USDA/ ARS , Fruit Laboratory , Beltsville , MD 20705 , USA)
Abstract : As part of the program to develop transgenic Malus ×Domestic. cv. ‘Royal Gala’
tetraploid with improved traits , new germplasm of transgenic diploid and tetraploid plants with cecropin
MB39 gene were regenerated. Seven transgenic diploid plants were obtained from etiolated internodal
explants by Agrobacterium tumefaciens2mediated transformation using the plasmid binary vector p GV
containing a chimeric gene cecropin MB39 . The integration of the cecropin gene into apple genome was
confirmed by PCR and Southern blotting analysis. It was proved that lines , TR21 and TR23 , had
increased the resistance to fireblight disease caused by Erwinia amylovora. Twenty tetraploid lines were
produced by cocultivating leaf explants from wild type and transgenic diploid shoots with colchicine in
apple regeneration medium. Flow cytometry was used for ploidy determination. The tetraploid plants
were distinguishable from the diploid on morphological as well as cytogenetic grounds. Both the
transgenic diploid and tetraploid plants are now being evaluated for growth development and disease
resistance.
Key words : Cecropin MB39 ; Transgenic ; Apple ; Tetraploid ; Colchicine
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