全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(4)：537～539
Acta Honicuhurae Sinica
农杆菌介导的蝴蝶兰基因转化系统的建立
柴明良 金斗焕
( 浙江大学园艺系，杭州 310029； 韩国建国大学园艺系，汉城 143—701)
摘 要：针刺后的蝴蝶兰 ‘White Hikaru’的类原球茎 (PLB)，与含绿色荧光蛋白基因 ( )和潮霉
素磷酸转移酶基因 (^p￡)的pCAMBIA 1300一SmGFP的根瘤农杆菌LBA4404 共培养，培育出了转基因的蝴
蝶兰。经绿色荧光蛋白检测和Southern印迹，证实了再生植株中含cop基因和hpt基因。
关键词：蝴蝶兰；类原球茎；农杆菌介导的转化；绿色荧光蛋白基因；潮霉素磷酸转移酶基因
中图分类号：S 682 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)04-0537-03
Establishment of Agrobacterium-mediated Transformation in Phalaenopsis
Chai Mingliang and Kim Doohwan
( Department of Horticulture，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China； Department of Horticultural Science，Konkuk
University，Seoul 143—701，Korea)
Abstract：Transgenic orchid(Phalaenopsis CV．White Hikaru)plants were regenerated by inoculating a
needle wounded protocorm．1ike body (PLB)with Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 harboring
pCAMBIA 1300-SmGFP that caries green fluorescent protein gene( )and hygromycin phosphotransferase
gene( f)．The expression and presence of the transgenes， and f were assessed by detection of green
fluorescent protein under microscope and Southern analysis，respectively．
Key words：Phalaenopsis；Protocorm—like body(PLB)；Agrobacterium．mediated transformation；Green
fluorescent protein gene( )；Hygromycin phosphotransferase gene( f)
1 目的、材料与方法
蝴蝶兰 (Phalaenopsis)的离体繁殖已有了大量报道，但转基因的报道较少，且多采用微粒子轰
炸法。笔者曾通过农杆菌法，以gus为报告基因，获得了稳定转化的蝴蝶兰⋯。本文报道的是采用
为报告基因的蝴蝶兰转化系统的建立。
试材为蝴蝶兰品种White Hikaru，用花梗芽诱导类原球茎 (PLB)，方法同前⋯。选生长旺盛、
大小均匀的PLB用于试验。供试菌为根瘤农杆菌 LBA4404，含二元质粒载体 pCAMBIA 1300．SmGFP
(图1)。其含在植物中选择的 f基因和报告基因 。供试菌的制备同前⋯，并稀释至 OD60o为0．2
(注明的除外)供试。用注射器针尖针刺 PLB，每个 PLB约针刺lO处 (注明的除外)。针刺后在农杆
菌液中浸泡30 min(注明的除外)后，转到含 100 p,mol／L乙酰丁香酮的增殖培养基 (同前)中，于
25~C下暗周期共培养2 d。共培养后的PLB转接到含200 mg／L头孢菌素的增殖培养基 (同前)中。6
周后，从原始的PLB上切下新生的PLB，并横切为二，接种在含3．0 mg／L潮霉素但其它成分同前的
增殖培养基上。此步骤重复 3次。最后将新生的PLB接种在含3．0 mg／L潮霉素、200 mg／L头孢菌
素、3 g／L Hyponex、2 g／L蛋白胨、20 g／L蔗糖、3 g／L Phytagel，pH 5．8的生根培养基上。
8周后，将生根及叶片的植株视为转化苗 (表 1～表3)，从样株取部分叶片和根尖，徒手切成薄
片，根为纵切，在带有紫外光滤片的Axoplan 2显微镜下观察荧光，并在聚焦显微镜 (corfoca1)发射
光波长488 nm下再确认。荧光反应阳性株长大后进行Southern分析。
收稿 日期：2003—10—14；修回日期：2003—12—17
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538 园 艺 学 报 31卷
CaMV 35S CaMV 35S
PolyA 矗Pt promoter
CaMV 35S
nos gfp promoter
LB Xh0 I Xho I EeoR I EcoR I RB
图1 质粒 pCAMBIA 1300-SmGFP的 T·DNA
Fig．1 T-DNA of pCAM BIA 1300-SmGFP showing hpt and g genes
Southern分析：每个样品10 pLg DNA在Xho I中酶切，电泳后转移到Hybond—N 膜上。pCAMBIA
1300．SmGFP编码 hpt基因的Xho I酶切片段 (1．1 kb)为探针。用仅北P—dATP标记。
2 结果与讨论
2．1 选择用抗生素的种类与浓度
尽管在石斛兰 (Dendrobium)上以200 m L的卡那霉素为选择剂 ，但在蝴蝶兰上当卡那霉素
400 m L时PLB仍然正常生长和生根，所以卡那霉素不宜作为选择剂 ¨；而PLB对除草剂 P 十分
敏感，在0．4 mg／L时即黄化，不长根，故也不适宜；在潮霉素为3．0 mg／L上选择8周，PLB的生根
完全受抑制，即使用1．5 m L继续选择上述材料，依然无新根 (数据未列出)。所以选用潮霉素为
选择剂。
2．2 农杆菌的浓度和感染的时间
菌液低浓度优于高浓度 (表 1)。原因是共培
养基富含营养，起始农杆菌浓度高导致农杆菌过
度生长，引起感染的类原球茎外层组织 (可能已
经转化的组织)损伤和腐烂，转化率下降。故此
后的试验均用OD枷 0．2的菌液。
农杆菌感染的时间一般在10～30 min间，但也
有报道将愈伤组织在菌液中悬浮10 h的甚至数天的。
本试验处理间差异不显著，以30 min略好 (表2)。
2．3 外植体的损伤处理对遗传转化的影响
试验发现，剥去外层对PLB的损伤过大，共
培养后组织死亡严重。Begum等发现建兰新 PLB
起源于表皮的内层细胞和亚表皮细胞 J。针刺提
高了农杆菌感染内层细胞的机会，而损伤程度又
较小，所以效果较好 (表3)。
2．4 GFP检测
在Axoplan 2显微镜下，可从转化植株的叶片
和根系中检测到绿色荧光 (图版，A和B)。由于
蝴蝶兰的叶片和根系均含叶绿素，背景荧光有时
会产生干扰。而在聚焦显微镜下，则能更严格地
加以区分 (图版，C)。
2．5 Southern印迹反应
GFP检测为阳性并在潮霉素中可长期健康生
长的植株 (图版，E)，在Southern印迹中均可检
测到预期大小的 f基因 (图2)。
2．6 选择策略对稳定遗传转化的影响
表 1 感染用的农杆菌浓度对遗传转化的影响
Table 1 Efect of the concentration of the Agrobactedum
suspension cultures on the transformation of Phalaenopsis
表2 农杆菌的感染时间长短对遗传转化的影响
Table 2 Efect of infecting time of the Agrobacterium
suspension cultures on the transform ation eficiency
表3 类原球茎损伤处理对遗传转化的影响
Table 3 Efect of explant treatment methods on
thetransform ation eficiency
损伤处理法 接种的PLB数 生根植株数 转化率
Explant treatment No．of inoculated No．of rooted Transformation
methods PLB plantlets eficiency(％ )
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4 蜡州f 等·农扦卣介苛的蝴 圆转化系统的霆立
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