全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (6) : 1030～1033
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 03 - 04; 修回日期 : 2005 - 04 - 22
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (AA211050)3 通讯作者 Author for correspondence
人乳铁蛋白基因在番茄中的优化表达
曹慧颖　郭三堆 3
(中国农业科学院生物技术研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 采用农杆菌介导法 , 将表达载体 pB I121LF中的人乳铁蛋白 (LF) 基因 (根据植物偏好密码
子人工合成 ) 导入番茄 , 经卡那霉素筛选 , 获得了再生植株。经 PCR和 Southern鉴定 , 证明部分番茄基因
组中已经整合了 lf基因。W estern检测表明 , 基因在果实中得到了表达。
关键词 : 乳铁蛋白 ; 转基因 ; 番茄 ; 生物反应器
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0621030204
Expression of Human Lactoferr in Gene in Tran sgen ic Toma to Plan ts
Cao Huiying and Guo Sandui3
(B iotechnology Research Institu te, the Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: The p lant exp ression vector pB I121LF contained artificial synthesized human lactoferrin gene
was constructed and introduced into tomato by A grobacterium 2mediated. Twenty2three regenerated p lants were
obtained through kanamycin2resistant selection. Itwas demonstrated that lf gene had been integrated into toma2
to genome by PCR and Southern blot analysis. W estern blot analysis showed that human lactoferrin had
exp ressed in transgenic tomato fruits. It made the basic research for transgenic tomato as healthy food.
Key words: Lactoferrin; Transgenic; Tomato; B ioreactor
近年来 , 植物基因工程发展迅速 , 人们已经开发出抗乙型肝炎病毒的马铃薯〔1〕、可以治疗肿瘤
的水稻和小麦〔2〕等多种转基因植物。通过有些植物生产的疫苗已经成功地用于临床试验〔3, 4〕, 这说明
植物表达系统具有广阔的研究与应用前景。乳铁蛋白 (Lactoferrin, LF) 是一种具有多种生物学功能
的单体糖蛋白〔5〕, 具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、免疫调节、转录调控、维持铁平衡等多种作
用〔6～10〕。目前乳铁蛋白已应用于食品添加剂、防腐剂、抗氧化剂、饲料添加剂、保健品、医药等领
域 , 但是天然乳铁蛋白主要从乳清中分离得到 , 成本高 , 来源有限。为满足需要 , 降低成本 , 人们尝
试着采用基因工程的方法生产乳铁蛋白。Conneely等用曲霉〔11〕、W ard等用酵母〔12〕、 Stowell等用
BHK细胞系〔13〕、Salmon等用草地夜蛾细胞〔14〕、Krimpenfort等用奶牛乳腺〔15〕先后表达出人乳铁蛋白。
作者通过基因工程的方法 , 将人乳铁蛋白基因转入番茄 , 为培育出可直接食用的具有保健特性的番茄
新品种奠定研究基础。
1　材料与方法
111　材料
番茄 ‘中蔬 6号 ’种子购于中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ; 质粒 pUC19LF (含有根据植物偏
好密码子人工合成的 lf基因 )、质粒 pG4AB、植物表达载体 pB I121、大肠杆菌 DH5α、根癌农杆菌
LBA4404由本实验室保存 ; 标准人乳铁蛋白购于 Sigma公司 ; LF抗血清由中国科学院遗传与发育研
究所实验动物中心制备 ; PCR D IG Labelling M ix为 Roche公司产品 ; 碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG购
自华美公司 ; PCR引物由三博公司合成。
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　6期 曹慧颖等 : 人乳铁蛋白基因在番茄中的优化表达 　
112　载体构建
用 PstⅠ和 X hoⅠ将质粒 pUC19LF中的 lf基因克隆到质粒 pG4AB中表达调控序列Ω因子和多聚
腺苷 (polyA ) 之间 , 构建中间表达载体 pG4ALF。再将含调控序列的 lf基因用 B am HⅠ和 SacⅠ克隆
到 pB I121中 CaMV35S启动子和 nos终止子之间 , 构建植物双元表达载体 pB I121LF。pB I121LF含有植
物选择标记 nptⅡ基因。其物理图谱见图 1。质粒 DNA的提取及载体构建按文献 〔16〕进行。最后 ,
采用 Hofgen等的冻融法〔17〕将表达载体导入农杆菌 LBA4404。
图 1　表达载体 pB I121L F的结构示意图
F ig. 1　A schema tic represen ta tion of expression vector pB I121L F
113　番茄转化与植株再生
取生长 7～10 d的番茄无菌苗子叶 , 用农杆菌侵染 3 m in后转到共培养基上 : MS + 011 mg/L Zt
(玉米素 )。暗培养两天后转入诱导愈伤培养基 : MS + 1 mg/L Zt + 50 mg/L Kan (卡那霉素 ) + 500
mg/L Cb (羧苄青霉素 )。待愈伤组织分化后转入出芽培养基 : MS + 011 mg/L Zt + 100 mg/L Kan +
500 mg/L Cb。芽长 1～2 cm时移到生根培养基 : MS + 100 mg/L Kan + 500 mg/L Cb。待根系发达后将
小苗移到灭菌土中。
114　再生植株的 PCR和 Southern检测
提取总 DNA〔18〕。PCR上游引物 : 5piCTTCC TCGTC CTGCT GTTCC3pi, 下游引物 : 5piGAGTG TCCGA
AGGTC CTCCC3pi。反应条件 : 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 1 m in, 53℃退火 1 m in, 72℃延伸 1 m in,
30个循环 ; 最后 72℃延伸 10 m in。
Southern杂交〔16〕: 20μg DNA、1μg质粒 pB I121LF (作阳性对照 ) , 用 H ind Ⅲ在 37℃分别消化
12 h和 2 h, 018%的琼脂糖凝胶电泳 , 电转移至尼龙膜进行杂交。杂交探针按照 PCR D IG Labelling
M ix使用说明制备。
115　再生植株的 W estern检测
取新鲜果实 015 g, 在液氮中充分研磨后加 015 mL PBS (每升含 NaCl 8 g, KCl 012 g, Na2 HPO4
1144 g, KH2 PO4 0124 g, pH 714) , 4℃静置 1 h, 12 000 r/m in 4℃离心 20 m in, 取上清液作为待测样品。
W estern检测〔19〕: 样品经 SDS2PAGE (4%的浓缩胶 , 15%的分离胶 ) , 电转移至 PVDF膜上进行
杂交 , 二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG, NBT/BC IP显色。
2　结果与分析
211　植物表达载体的构建
构建的表达载体 pB I121LF用限制性内切酶
H indⅢ + SacⅠ消化 , 得到了 1013 kb和 314 kb两
个片段 (图 2) , 与理论大小 1317 kb相符。经过
Takara公司测序 , 证明载体构建正确 (测序图
略 )。
212　再生植株的获得及 PCR和 Southern检测
番茄子叶与农杆菌共培养后转到选择性培养
基 , 20 d左右产生抗性愈伤组织。愈伤组织大约
图 2　表达载体 pB I121L F的酶切电泳图谱
1: DNA分子质量标准 ; 2: pB I121LF /H indⅢ + SacⅠ。
Fig. 2　Detection of express vector pBI121LF by enzymatic d igestion
1: DNA Ladder; 2: pB I121LF /H indⅢ + SacⅠ.
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
30 d分化出抗性芽。抗性芽生长 30 d左右转入生
根培养基 , 一周后观察到有根生成。根系发达的
再生植株移栽入土的成活率为 100% , 最终得到
再生植株 23株。
图 3为部分再生植株的 PCR检测结果。未转
基因植株的总 DNA没有扩出条带 , 质粒 pUC19LF
扩出 211 kb的条带 , 由此可以初步判断扩增出
211 kb条带的植株 (2～6、8) 为转基因植株。
图 4为再生植株的 Southern检测结果 , 其中
4、5、6对应植株与阳性对照 pUC19LF一样出现
了杂交信号 , 而作为阴性对照的未转化植株没有
出现杂交信号 , 这说明 lf基因已经整合于番茄基
因组中。因为在植物表达载体 pB I121LF上 , 左右
图 3　再生植株 PCR检测结果
1: DNA分子质量标准 ; 2～8: 再生植株 ; 9: 阴性对照 ;
10: pUC19LF阳性对照。
F ig. 3　PCR ana lysis of lf gene in tran sform ed toma to leaves
1: DNA ladder; 2 - 8: DNA of transformed tomato; 9: DNA of non2
transformed tomato; 10: pUC19LF p lasm id as positive control.
边界序列之间只有一个 H indⅢ酶切位点 , 所以转基因番茄总 DNA在完全酶切时 , Southern杂交得到
的阳性条带数应与外源基因的整合拷贝数相对应 , 那么 4、5、6号对应植株分别出现 2、3、2条杂交
条带 , 说明外源基因的整合拷贝数可能为 2、3、2。
图 4　转基因植株的 Southern检测结果
1: 质粒 pB I121LF; 2: 未转基因对照 ; 3～6: 再生植株。
F ig. 4　Southern hybr id iza tion of tota l D NA isola ted from
tran sgen ic toma to leaves
1: pB I121LF; 2: DNA of non2transformed tomato leaves;
3 - 6: DNA of transformed tomato leaves.
图 5　转基因植株 W estern印迹分析
1: 标准乳铁蛋白 ; 2～4: 转基因植株果实 ; 5: 未转基因植株果实。
F ig. 5　W estern blot ana lysis of tran sgen ic toma to fru its
1: LF standard p rotein; 2 - 4: Transgenic tomato fruits; 5: Non2
transgenic tomato fruits.
213　乳铁蛋白的表达检测
对 Southern检测呈阳性的植株果实提取总蛋白进行 W estern检测 , 结果如图 5。未转基因植株果
实没有出现特异条带 , 2、3、4对应转基因植株与标准乳铁蛋白出现大小相同的特异条带 , 说明 lf基
因已经在转基因番茄果实中表达。
3　讨论
因为动物和植物密码子使用偏好不同 , 有些动物源基因在植物中不能表达或表达量很低。根
据植物密码子使用偏好对人乳铁蛋白基因进行优化 , 可以使之在番茄中顺利表达。在构建植物表
达载体时 , 于 lf基因 5pi端增加了烟草花叶病毒 ( TMV ) 的 126 kD蛋白基因的Ω因子 , 为核糖体
提供了新的结合位点 , 可以增强 mRNA的起始翻译效率〔20〕。植物细胞中 mRNA的稳定性与 3pi端加
入多聚腺苷 polyA的速度及长度有关。基因转录成 mRNA后 , 如果不能及时加入 polyA尾巴 , 将会
很快被核酸外切酶所降解。mRNA 在细胞内存在的半衰期越长 , 经翻译产生出的蛋白质量就越
多〔21〕。因此 , 为提高 lf基因 mRNA的稳定性 , 在设计其表达载体时 , 在转录终止子之前加入了
polyA序列。
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　6期 曹慧颖等 : 人乳铁蛋白基因在番茄中的优化表达 　
用番茄生产乳铁蛋白与细菌发酵、细胞培养及动物相比有自身的优越性。与细菌等低等生物相
比 , 植物属高等生物 , 表达产物能够正确折叠、糖基化等 , 与天然产物非常相近 , 具有天然产物的理
化特性和生物学功能。动物基因在原核表达系统中有时不能表达或产量很低 , 表达产物常不能正确折
叠、糖基化等 , 没有生物活性。番茄生物反应器生产的乳铁蛋白贮存于果实 , 可以直接食用 , 从而减
少了抽提过程中的损失和破坏 , 也简化了工艺 , 降低了成本。
与动物相比 , 植物转基因效率高。目前 , 动物转基因常用胚胎显微注射 , 其转化率低 , 规模有
限 , 成本高 , 周期长 , 且许多动物疾病可以传染人类 , 使得动物产品存在安全性问题。而植物转基因
常用农杆菌介导法 , 操作简便 , 转化效率高 , 可大批量处理 , 周期也比动物的短 , 成本低。所以。番
茄生物反应器生产的乳铁蛋白具有更高的安全性。
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