全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 1) : 59~ 61
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2000- 02- 17; 修回日期: 2000- 07- 20
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (3976007)
沙田柚自交花柱中识别蛋白的免疫金定位
薛妙男 李义平 张杏辉 杨继华
(广西师范大学生物系, 桂林 541004)
摘 要: 应用免疫金标记抗体技术检测了沙田柚自花授粉后 1~ 3 d 花柱 1/ 2 处通道细胞
中识别蛋白定位分布, 表明金颗粒依次定位于内质网, 高尔基体、纤维壁, 证实沙田柚花柱
1/ 2处通道细胞中金颗粒分布的变化与花粉管在花柱中生长受阻位点和时间一致。1/ 2 花柱通
道细胞纤维壁上的糖蛋白是沙田柚不亲和反应的识别位点。
关键词: 柑桔类; 沙田柚; 自交不亲和; 花柱; 识别蛋白; 免疫金标记
中图分类号: S 666. 3 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 01005903
1 目的、材料与方法
荧光细胞化学揭示, 沙田柚 ( Citrus grandis var. Shatinyu Hort . ) 花粉管停止生长于授
粉后第3天的花柱1/ 2处, 属配子体型自交不亲和1 。开花授粉 2~ 3 d的花柱蛋白提取液
能选择性地抑制自交花粉管的生长2 , 表明沙田柚识别蛋白高效表达是在授粉后 2~ 3 d。
在此基础上, 我们采用免疫电镜法研究自花授粉后 1~ 3 d花柱 1/ 2处通道细胞识别蛋白
分布动态变化与花粉管受阻的关系, 探讨配子体不亲和花粉管与花柱之间的识别位点, 从
细胞化学水平上研究沙田柚配子体自交不亲和识别机理。
材料取自广西柑桔研究所。 ! 电镜制样: 取自花授粉 1~ 3 d的沙田柚 1/ 2花柱段按
程时等3 的方法进行 K4M冷冻包埋和超薄切片。∀ 花柱识别蛋白抗体 (一抗) 制备及纯
化: 取人工自花授粉 3 d的沙田柚 1/ 2花柱段, 加蛋白提取液, 冰浴研磨提取, 12 000 r/
min冰冻离心 10 min, 取上清液用 35%饱和液 ( NH4) 2SO4 盐析, 透析后进行 3 mm 平板
SDSPAGE, 考马斯亮兰 ( R250) 染色, 切下各蛋白带, 洗脱, 分别进行离体花粉萌发试
验, 确定能抑制自花花粉管生长的蛋白带, 得所需的电泳纯识别蛋白。按常规3 进行抗体
制备及纯化。# 胶体金和羊抗兔复合物 (二抗) 的制备: 胶体金 ( 10 nm) 购自军事医学
科学院。复合物制备按文献 3 的方法进行。∃免疫染色程序: 将切片浮于 2. 5% BSA
(0. 01 mol/ L PBS配制 pH 7. 2) 中, 阻断 5 min, 去除非特异性结合, 不冲洗立即于一抗
(1%200) 25 & 中孵育 1 h。PBS 冲洗、吸干、金标羊抗兔 ( 1%50) 中孵育 40 min。在
0. 05 mol/ L TBS (含 1% BSA pH 8. 2) 清洗, 最后用重蒸水清洗、干燥。醋酸铀和醋酸铅
染色, 透射电镜观察拍片。对照用正常抗血清代替一抗和取自交 2 d的酸柚 1/ 2花柱段,
按上述步骤! ~ ∃进行。
2 结果与分析
对沙田柚花柱通道细胞的亚细胞结构特征的观察发现, 自花授粉后 2~ 3 d, 通道细胞
处于衰退状态, 表现在内质网、高尔基体逐渐解体并液泡化; 质膜溶解, 微纤丝松散形成
电子密度较透明的壁层 (L)。角质层下腔 ( SEL) 已贮存有由通道细胞分泌的无定形溢泌
物。但还保持细胞的轮廓 (图版, 1)
自花授粉后 1~ 3 d花柱通道细胞中免疫金颗粒分布观察发现, 金颗粒仅分布于通道
细胞分泌端的特定部位。授粉后 1~ 2 d, 在逐渐解体的内质网和高尔基体区有金颗粒分
布, 并逐步向分泌面细胞壁转移, 故细胞纤维壁上有较多金颗粒分布 (图版, 2)。授粉后
2~ 3 d, 识别蛋白通过渗透扩散至通道细胞纤维壁, 金颗粒最终定位于纤维壁处 (图版,
3)。两组对照均呈阴性, 其内质网, 纤维壁未见金颗粒分布 (图版, 4)。
花粉体外萌发抑制生长试验2 已表明, 沙田柚识别蛋白高效表达是在授粉后 2~ 3 d,
从免疫金标记试验结果可以看到授粉后 1~ 3 d花柱S- 蛋白的动态变化过程, 即 S蛋白由
内质网合成, 穿过质膜, 经外排作用最后定位于纤维壁, 和我们用酶标 ConA 细胞化学方
法对不同发育时期沙田柚花柱通道细胞中糖蛋白定位4 分布一致。用荧光显微镜观察自花
授粉沙田柚花粉管是在授粉后 2~ 3 d于花柱 1/ 2处受阻1 , 免疫金标记揭示授粉后 1~
3 d金颗粒分布动态变化与沙田柚花粉管受阻的时空关系一致, 证实花柱 S- 蛋白的基因
表达位点及时间与花粉管受阻位点和时间是同时出现的。这与 Cornih等5 的研究一致。证
实1/ 2花柱通道细胞分泌面纤维壁是沙田柚自交不亲和花柱与花粉管识别位点, 说明定位
于纤维壁上的 S- 蛋白参与了花柱与花粉管之间的识别。
参考文献:
1 薛妙男, 陈腾土, 杨继华. 沙田柚自交不亲和性观察. 园艺学报, 1995, 22 ( 2) : 127~ 132
2 陈腾土, 杨小华, 薛妙男. 沙田柚花柱蛋白对花粉生长的影响. 广西植物, 1998, 18 ( 2) : 160~ 164
3 程 时, 彭学敏. 生物医学和电子显微镜技术. 北京医科大学, 北京: 中国协和医科大学联合出版社, 1997. 315
~ 328
4 薛妙男, 李 楠, 杨继华. 沙田柚花柱蛋白产生时空关系研究. 广西植物, 2000, 20 ( 2) : 164~ 168
5 Cornish E C, Pottit J M, Boning I, et al. Developmaentally controlled expression of a gene associated w ith self incompat ibil igy in
Nicotiana alata . Nature, 1987, 329: 99~ 102
Immunogold Localization of Recognition Prorein in the SelfPollination Style of
Shatinyu
Xue Miaonan, Li Yiping, Zhang Xinhui, and Yang Jihua
( Department of Biology , Guangxi Normal University , Guilin 541004)
Abstract: By immunogold, the recognition protein in the stylar passage cell of shatinyu ( Citrus grandis var.
Shatinyu Hort. ) 1- 3 days after selfpollination was examined. The goldgrains were located on the endoplasm reticu
lum, golgiosome and cellulose wall successively. The change of the goldgrains distribution in the 1/ 2 stylar passage cell
of shatinyu was identical to that of pollen tube stopping glycoprotein on the cellulose wall of 1/ 2 stylar passage cell which
was the recognition site of selfincompatibility of shatinyu.
Key words: Citrus; Shatinyu ( Citrus grandis var. Shatinyu Hort. ) ; Selfincompatibility; Style; Recognition
protem; Immunogold
60 园 艺 学 报 28卷
图版说明 1. 自花授粉后 2~ 3 d, 花柱通道细胞趋于衰老死亡, 细胞器液泡化, ∋ 10 000; 2. 自花授粉后 1~ 2 d,
花柱通道细胞的内质网、高尔基体和纤维壁上有金颗粒标记 (箭头所示) , ∋ 30 000; 3. 自花授粉后 2~ 3 d, 金颗
粒定位于通道细胞纤维壁 (箭头所示) , ∋ 30 000; 4. 对照花柱通道细胞内质网和纤维壁无金颗粒标记, ∋ 25 000。
ER: 内质网; L: 纤维壁; SEL: 角质层下腔。
Explanation of Plates 1. the stylar passage cell in the 2/ 3 day after selfpollination. The style passage cell senile to die. The cell
organs were vacuolation, ∋ 10 000; 2. In the 1- 2 day after selfpollination, the goldgrains on the endoplasmic ret iculum, golgi
body and cellulose wall in the style passage cell were showed. ( see arrow ) , ∋ 30 000; 3. In the 2- 3 day after selfpollination,
the goldgrains were located on the cellulose wal l of stylar passage cell ( see arrow) , ∋ 30 000; 4. comparing. There were endo
plasmic reticulum on the stylar passage cell and the stylar passage cell and there weren( t goldgrains on the cellulose wall, ∋ 25 000.
ER: Endoplasmic ret iculum; L: Cellulose wall ; SEL: Lowcavity of horny layer.
611 期 薛妙男等: 沙田柚自交花柱中识别蛋白的免疫金定位