全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (4) : 653～657
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 09 - 11; 修回日期 : 2005 - 01 - 17
基金项目 : 北京市基金重点项目 ( 6001001 ) ; 北京市科委项目 ( H020821330130, H012010240240113 ) ; 北京市优秀人才项目
(20041D0200504)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wuzhongyi@yahoo1com)
利用基因枪法向高羊茅导入 P5CS基因的研究
李志亮 1, 3 　黄丛林 1 　张秀海 1 　曹鸣庆 1 　李　征 2 　王　刚 3 　吴忠义 13
(1 北京农业生物技术研究中心 , 北京 100089; 2 北京草业与环境研究发展中心 , 北京 100089; 3 河北师范大学生命科
学学院 , 石家庄 050016)
摘 　要 : 利用基因枪法 , 以豇豆 (V igna acon itifolia) 的Δ1 -吡咯啉 - 5 -羧酸合成酶基因 ( P5CS ) 的
突变型 P5CS 2F129A基因转化高羊茅的下胚轴愈伤组织 , 获得 25株经 PCR检测和 Southern blot分析为阳性
的转基因植株 , 转化频率约为 114%。脯氨酸含量测定表明 , 转基因植株的脯氨酸含量比对照高 31% ～
83%。对植株的抗旱性初步检测表明 , 转基因植株比对照耐旱。
关键词 : 草坪草 ; 高羊茅 ; 转基因 ; 基因枪 ; 耐旱性
中图分类号 : S 68　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420653205
Stud ies on Tran sferr ing P5CS Gene in to Ta ll Fescue ( F estuca a rundinacea
Schreb. ) v ia M icroprojectile Bom bardm en t
L i Zhiliang1, 3 , Huang Conglin1 , Zhang Xiuhai1 , Cao M ingqing1 , L i Zheng2 , W ang Gang3 , and W u Zhongyi13
(1B eijing R esearch Cen ter of A gro2B iotechnology, B eijing 100089, Ch ina; 2B eijing Research and D evelopm ent Cen ter for Grass
and Environm ent, B eijing 100089, Ch ina; 3 College of L ife Science Hebei N orm al U niversity, Shijiazhuang 050016, Ch ina)
Abstract: In this study, a mutated form of V igna acon itifolia Δ1 2pyrroline252carboxylate synthetase
( P5CS 2F129A ) gene was transferred into calli of tall fescue by m icro p rojectile bombardment. Twenty2five
transgenic p lants were obtained through phosphinothricin screening, PCR and Southern blot analysis. The
transformation frequency in calli of tall fescue was about 114%. The content of p roline in transgenic p lantswas
31% - 83% higher than that in untransformed p lants. Furthermore, the transgenic p lants were more tolerant
to drought stress.
Key words: Turfgrass; Tall fescue; Transgenic; M icro p rojectile bombardment; D rought tolerance
高羊茅 ( Festuca arund inacea Schreb. ) 又称苇状羊茅 , 系禾本科 ( Gram ineae) 羊茅属植物 , 作
为草坪草 , 具有耐瘠薄 , 较抗病 , 适应性广等特点 , 但需水量大〔1〕。我国北方水资源比较缺乏 , 急
需培育抗旱节水的高羊茅新品种。
基因枪法应用于单子叶植物的基因转化已有许多成功的报道〔2〕, 例如 , Spangenberg等和 Cho等
用基因枪法将外源基因潮霉素和 GUS (β -葡糖醛酸酶 ) 基因成功导入高羊茅〔3, 4〕。
Δ1
-吡咯啉 - 5 -羧酸合成酶 ( P5CS) 是脯氨酸合成的关键酶 , 在胁迫条件下 , P5CS基因的表
达活性增强 , 在胞质中增加脯氨酸的合成 , 从而增加细胞的保水能力 , 提高植物的抗旱性。而 P5CS
活性又受到脯氨酸的变构调节〔5〕。豇豆 P5CS多肽 129位的苯丙氨酸被丙氨酸替代后 ( P5CS2F129A )
会导致脯氨酸反馈抑制急剧降低〔6〕, 使植物体内脯氨酸的积累量增加。本试验是将豇豆的Δ1 - 吡咯
啉 - 5 -羧酸合成酶基因的突变型 P5CS 2F129A基因导入高羊茅 ‘羚羊 ’品种中 , 并对转基因植株进
行了 PCR检测和 Southern blot分析 , 脯氨酸含量测定及抗旱性的初步检测。
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1　材料与方法
111　供试材料与基因枪轰击方法
供试的高羊茅品种 ‘羚羊 ’由北京草业与环境研究发展中心提供。质粒 pBPC2P5CS由北京农业
生物技术研究中心园林室提供 , 该基因上游为 Ubi (玉米泛醌素 ) 启动子 , 下游为 nos终止子 , 选择
标记基因是 B a r基因 (图 1) , 其中 P5CS 2F129A基因为美国俄亥俄州立大学 Verma DPS教授馈赠。
图 1　pBPC2P5CS质粒部分图谱
F ig. 1　Partia l d iagram of pla sm id pBPC2P5CS
将高羊茅种子常规消毒后接种在 MS +BA 1 mg/L + IAA 011 mg/L培养基上 , 3 d后种子萌发 , 约
20 d后成苗。当苗长到高 2～5 cm时 , 无菌条件下切取幼苗基部 015～1 cm的下胚轴 , 接种在诱导培
养基 (MS + 2042D 10 mg/L) 上 , 在 (26 ±1) ℃暗培养下 , 7 d后长出愈伤 , 然后将愈伤块转至继代
培养基 (MS + 2042D 5 mg/L) 上 , 约 20 d后长成 012～014 cm的小块。
挑选有光泽、突起、致密的下胚轴愈伤组织作为靶细胞 , 用 B io2Rad公司生产的高压放电 PDS2
1000 /He基因枪进行轰击。轰击参数 : 金粉直径 110μm , 轰击压力 1 300 p si, 金粉 500μg /枪 , 质粒
DNA 0183μg /枪 , 质粒 DNA与金粉形成复合体的比例为 1166μg/mg (金粉 ) , 轰击距离 12 cm或 15
cm, 每皿 (约 60～80愈伤块 ) 轰击 1次。
112　恢复培养、筛选及植株再生
轰击后的高羊茅愈伤组织继续在暗处恢复培养 5～7 d, 然后转到含草丁膦 (phosphinothricin) 2
mg/L的诱导和分化培养基 (MS +BA 1 mg/L + IAA 011 mg/L) 上进行筛选 , 待小苗长到约 1 cm时放
入含草丁膦 2 mg/L生根培养基 (MS + IAA 015 mg/L + KT 012 mg/L) 上 , 待幼苗株高 3～5 cm时移
栽到装有营养土的花盆中生长 , 35 d后进行脯氨酸含量测定和抗旱性检测。
113　再生植株的 PCR检测
高羊茅叶片 DNA提取采用 SDS微量提取法〔7〕。 PCR采用 M. J. Research公司生产的 PTC2100
PCR扩增仪。P5CS 2F129A引物序列分别为 : 上游引物 5piGTT AGC GGT TGG AAG ATT 3pi; 下游引物
5piCTT GGC GTA GAA ACA CAT TAG 3pi, 阳性转基因植株可扩增出 1 832 bp的片段。扩增体系为 50
μL。扩增条件为 : 预变性 94℃, 5 m in, 然后进入循环 ; 变性温度 94℃, 1 m in; 退火温度 53℃, 1
m in; 延伸温度 72℃, 2 m in; 循环 30次 , 最后在 72℃下延伸 7 m in。
B ar基因引物序列分别为 : 上游引物 5piATG AGC CCA GAA CGA CGC 3pi; 下游引物 5piCTA AAT
CTC GGT GAC GGG C 3pi, 阳性转基因植株可扩增出 552 bp的片段。扩增体系为 25μL。扩增条件为 :
预变性 94℃, 5 m in, 然后进入循环 ; 变性温度 94℃, 1 m in; 退火温度 53℃, 1 m in; 延伸温度 72℃,
2 m in; 循环 30次 , 最后在 72℃下延伸 7 m in。
114　再生植株的 Southern blot分析
高羊茅叶片 DNA提取采用 CTAB大量提取法。取 30μg高羊茅基因组总 DNA经 B am H I完全消
化后 , 在 018%琼脂糖凝胶电泳上分离 , 电泳完毕后 , 利用毛细管转移法将 DNA转移至带正电荷的
Hybond2N +尼龙膜上。探针为 B am H I和 Kpn I从质粒上双酶切切下来含 P5CS基因的单一片段 , 经过
电泳胶回收后标记的。探针标记和 Southern blot分析均采用 Roche公司的 “ D IG H igh Prime DNA
Labeling and Detection Starter Kit II”试剂盒 , 操作流程按使用说明书进行。
115　脯氨酸含量测定和植株抗旱性能检测
高羊茅叶片脯氨酸含量的测定按张殿忠等〔8〕的方法进行 , 数据为 4次独立试验的平均值。取株
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　4期 李志亮等 : 利用基因枪法向高羊茅导入 P5CS基因的研究 　
高、长势等基本相似的转基因植株和对照植株 , 充分浇水后 , 进行不浇水的干旱处理 , 观察生长情
况。待转基因植株和对照植株都萎蔫后 , 开始浇水 , 观察恢复生长情况。
2　结果与分析
211　不同轰击条件下胚性愈伤组织的筛选、植株再生和转化效率
用 2 mg/L的草丁膦对基因枪法转化过的下胚轴愈伤组织进行筛选。在愈伤组织筛选过程中 , 非
抗性愈伤组织块逐渐褐化变黑而死亡 , 而抗性愈伤组织块上逐渐生出绿色的小芽点 , 发育成幼芽和幼
叶 , 最后在生根培养基上发育成小植株 (图版 , A～C)。以 PCR检测为阳性作为转化成功的判断标
准 , 轰击距离 12 cm的有 3株 , 轰击距离 15 cm的有 22株 , 转化效率分别为 018%和 114% (表 1)。
表 1　不同轰击条件下愈伤组织筛选、植株再生和转化效率
Table 1　Callus screen ing with phosphinothricin, plant regeneration of different bombardment treatments and the transformation eff ic iency
轰击距离
Bombarded
distance ( cm)
数量 Number
轰击愈伤
Bombarded calli
抗性愈伤
Resistant calli
再生植株
Regenerated p lants
转基因植株
Transgenic p lants
转化效率
Transformation
efficiency( % )
12 358 16 7 3 018
15 1 568 76 40 22 114
212　转基因植株的分子检测
21211　PCR　用设计好的引物对具草丁膦抗性的
转基因再生植株进行 P5CS 2F129A 和 B ar基因的
PCR检测 , 共检测出 P5CS 2F129A 和 B ar基因的
PCR均为阳性的转基因植株 25株 , 其扩增带位置
与质粒阳性对照扩增带位置相同 , 而非转基因植
株及 H2 O的阴性对照无对应扩增带 (图 2显示
P5CS 2F129A PCR的部分结果 )。
21212　Southern杂交 　对 PCR检测结果为阳性的
部分转基因株系进行 Southern blot分析 , 结果表
明转基因高羊茅存在 P5CS 2F129A 基因的杂交信
号 , 而非转基因植株则无杂交信号 , 说明 P5CS 2
F129A基因已整合到高羊茅的基因组中 (图 3)。
213　转基因植株的脯氨酸含量
采用磺基水杨酸法对正常浇水的转基因植株
和对照植株的叶片脯氨酸含量进行测定 , 结果表
明转基因植株叶片脯氨酸含量比对照高 31% ～
83% , 暗示目的基因在受体植物中已得到表达 ,
增加了其脯氨酸的合成量 (图 4)。
214　转基因植株的耐旱性
取 5号转基因植株和对照非转基因植株进行
不浇水的干旱处理 , 14 d后 , 对照植株叶片卷
曲 , 出现萎蔫现象 , 而转基因植株生长正常。
18 d后 , 对照植株萎蔫现象加重 , 部分叶片干
枯 , 转基因植株仍生长正常。28 d后 , 转基因植
株和对照植株都已萎蔫 , 这时开始浇水 , 2 d后 ,
图 2　转基因植株的 PCR检测
1. DNA标准分子量 ; 2～7. 不同转基因株系 ; 8. 未转化的对照
植株 ; 9. H2O空白对照 ; 10. 含 P5CS的质粒阳性对照。
F ig. 2 PCR ana lysis of tran sgen ic plan ts
1. DNA marker; 2 - 7. Transgenic p lants; 8. Untransformed p lant;
9. H2O control; 10. P5CS p lasm id.
图 3　转基因植株的 Southern blot分析
1. DNA标准分子量 ; 2～5. 不同转基因株系 ; 6. 对照。
F ig. 3　Southern blot ana lysis of tran sgen ic plan ts
1. DNA marker; 2 - 5. Transgenic p lants; 6. Untransformed p lant.
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转基因植株的部分叶片开始变绿而恢复生长 , 对
照植株的叶片还处于萎蔫状态。14 d后 , 转基因
植株生长基本恢复正常 , 对照植株仍未能恢复
(图版 , D )。可以看出 , 转基因植株的耐旱性明
显好于对照植株。
3　讨论
耐旱植物在干旱条件下能显著地积累一些低
分子量的代谢物 , 如脯氨酸 , 使细胞维持较高的
细胞质渗透压 , 有利于植物在干旱条件下的水分
吸收〔9, 10〕。王玮等的研究表明 , 玉米植株在严重
水分胁迫下 , 随着生育期的进展 , 胁迫时间的延
图 4　高羊茅植株叶片脯氨酸的相对含量
1. 对照非转基因植株 ; 2～5. 不同转基因株系。
F ig. 4　Rela tive con ten t of proline from leaves of ta ll fescue
1. Untransformed p lant; 2 - 5. Transgenic p lants.
长 , 脯氨酸的含量及其对渗透调节的贡献一直在增加 , 脯氨酸的积累对提高植物的抗旱性具有重要意
义〔11〕。试验也证明 , 在转基因植物中超量积累低分子量化合物 , 如甘露醇、脯氨酸、芒柄醇等 , 能
够赋予转基因植物抗水分胁迫 (亦称渗透胁迫 ) 的能力〔12〕。
从谷氨酸生物合成脯氨酸的前两步反应是由Δ1 - 吡咯啉 - 5 - 羧酸合成酶 ( P5CS) 催化的〔6〕。
试验证实 , 转化豇豆 P5CS基因可显著提高多种植物的脯氨酸水平。如 Kishor等发现过量表达豇豆的
P5CS基因烟草中脯氨酸含量比对照约高 10倍〔13〕。Zhu等证实豇豆 P5CS基因过量表达的转基因水稻
植株中脯氨酸含量比对照高 67% ～152% , 与对照植株相比 , 转基因植株的生物量增加〔14〕。Hong等
比较了野生型 P5CS转基因烟草植株和突变型 P5CS 2F129A转基因植株中脯氨酸的水平 , 发现突变型
比野生型的高 2倍〔15〕。
本试验利用基因枪法将 P5CS 2F129A基因导入高羊茅的下胚轴愈伤组织中 , 通过草丁膦的抗性筛
选 , 对分化的再生抗性植株进行分子检测 , 获得 25个转基因株系。在进行 Southern杂交分析时 , 杂
交探针是用 B am H I和 Kpn I从质粒上双酶切切下来 , 经过电泳胶回收后标记的 , 虽然是双酶切 , 但
它是一个含 P5CS基因的片段 , 对转基因植株 DNA是用 B am H I完全酶切的 , 由于质粒图谱中 (图
1) 在 P5CS基因的两端各有一个 B am H I的酶切位点 , 因此转基因植株出现一条单一杂交带是可能
的 , 而对照非转基因植株在相应位置并没有杂交信号 (图 3)。当然理想的是应该优先选用 B am H I以
外的酶进行酶切。为了进一步验证豇豆 P5CS基因在高羊茅中是否表达 , 我们做了 P5CS的免疫印迹
检测 , 初步结果表明转基因植株中有豇豆 P5CS的表达 , 而对照非转基因植株则没有 (结果未附 )。
试验表明 , 由高效特异性启动子 Ubi (玉米泛醌素 ) 驱动的豇豆Δ1 - 吡咯啉 - 5 - 羧酸合成酶的突变
型 P5CS 2F129A基因可整合到高羊茅基因组中并能够在植株中表达 , 提高了脯氨酸含量 , 从而提高了
转基因植株的耐旱性。与对照非转基因植物相比 , 在正常浇水的情况下 , 外源基因的表达并未观察到
影响转基因植株的正常生长。
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图版说明 : A. 高羊茅幼苗下胚轴 ; B. 下胚轴诱导的胚性愈伤组织 ; C. 胚性愈伤组织转化后的筛选与抗性愈伤组织的分化 ; D. 植
株的抗旱性比较。
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