全 文 ：园 艺 学 报 2004 , 31 (5) : 627～632
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 12 - 15 ; 修回日期 : 2004 - 04 - 02
基金项目 : 中国科学院方向性项目 ( Kscx2 - sw - 108) ; 国家自然科学基金项目 (NSFC30130030)3 通讯作者 Author for correspondence (hongdy @ns1ibcas1ac1cn , zqzhoubj @yahoo1com)
基于 Adh 基因家族序列的牡丹组 ( Sect. Mouta n
DC. )种间关系
林启冰1 ,2 周志钦1 ,2 3 赵 宣1 ,2 潘开玉1 洪德元1 3
(1 中国科学院植物研究所系统与进化植物学重点实验室 , 北京 100093 ; 2 西南农业大学园艺系 , 重庆 400716)
摘 要 : 测定了牡丹组 7 个种 10 个野生居群共 10 份样品的全部 A dh1A、A dh1B 和 A dh2 基因序列。
结合前人已报道的牡丹野生种的 A dh 基因序列 , 以芍药组 (Sect . Paeonia) 和北美芍药组 (Sect . Oneapia)
的种作外类群 , 用 PAU P 3 (410 b 4 a) 计算机程序构建了牡丹组全部 8 个种的 A dh1A、A dh1B 和 A dh2
基因树 (最大简约树和邻接树) , 同时进行了 A dh1A、A dh1B 和 A dh2 基因序列的合并分析。结果表明 ,
牡丹组的 8 个种分为两个具有 90 %以上自展值支持的单系分支 , 分别对应 Stern (1946) 根据形态划分的革
质花盘亚组 (Subsect . V aginatae) 和肉质花盘亚组 (Subsect . Delavayanae) 。在革质花盘亚组内 , 本研究结
果支持银屏牡丹 ( Paeonia suf f ruticosa ssp . yinpingm udan) 和凤丹 ( P. ostii) 、紫斑牡丹 ( P. rockii) 和
四川牡丹 ( P. decom posita) 以及矮牡丹 ( P. jishanensis) 和卵叶牡丹 ( P. qiui) 各种之间有更近的亲缘
关系 , 但有关牡丹复合体 ( P. suf f ruticosa complex) 内各种间更进一步的关系还有待进一步研究。根据
A dh 基因树并结合前人的结果对牡丹组的种间关系进行了详细的讨论。
关键词 : 芍药属 ; 牡丹组 ; A dh 基因 ; DNA 序列 ; 种间关系
中图分类号 : S 68 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2004) 0520627206
Interspecif ic Relationships among the Wild Species of Paeonia Sect. Moutan
DC. Based on D NA Sequences of Adh Gene Family
Lin Qibing1 ,2 , Zhou Zhiqin1 ,2 3 , Zhao Xuan1 ,2 , Pan Kaiyu1 , and Hong Deyuan1 3
(1 L aboratory of System atic and Evolutionary Botany , Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100093 ,
China ; 2 Depart ment of Horticulture , Southwest A griculture U niversity , Chongqing 400716 , China)
Abstract : Five out of eight species in the Paeonia Sect . Moutan were suggested to be the wild ancestors
of the cultivated tree peonies in China. Therefore , it is of great importance both in theory and practice to have
a better understanding of the relationships among the species of Paeonia Sect . Moutan DC. . In this study , a
portion (five exons and four int rons) of the alcohol dehydrogenase (ADH) genes including A dh1A , A dh1B ,
and A dh2 of 10 accessions of wild t ree peonies collected f rom ten wild populations representing 7 species of
Paeonia Section Moutan were sequenced and analyzed. Using species in the Section Paeonia and Section
O neapia as outgroups , both maximum parsimony (MP) and neighbor2joining (NJ ) t rees of all 8 wild species
of Paeonia Section Moutan for each gene were constructed with PAU P 3 (version 410 b 4 a) computer pro2
gram based on the sequences obtained in this study and those downloaded from the Genbank. A combined anal2
ysis of A dh1A , A dh1B and A dh2 gene sequences was also carried out . Results obtained in this study indicate
that eight species of Paeonia Section Moutan form two strongly supported (bootst rap > 90 %) monophyletic
clades which respond to Subsect . V aginatae and Subsect . Delavayanae of Sternpis system (1946) . Within the
Subsect . V aginatae , our results support that there are close relationships between P. suf f ruitcosa ssp . yin2
pingm udan and P. ostii , P. decom posita and P. rockii , and P. jishanensis and P. qiui . However , for
the general interspecific relationships among the species in P. suf f ruticosa complex , new pieces of evidence
are still needed. Based on the gene trees obtained in this study and results reported in previous literature , the
interspecific relationship of Paeonia Section Moutan was discussed in details.
Key words : Paeonia ; Section Moutan ; A dh genes ; DNA sequences ; Interspecific relationship
芍药属 ( Paeonia L . ) 牡丹组是芍药属中唯一的木本类群 , 其全部野生种类都产于中国〔1〕。近十
几年来 , 有关野生牡丹的分类学研究取得了重要的进展〔2～11〕。然而 , 在牡丹组种间关系方面却只有
一些不完整的研究报道〔12～14〕。近年来 , Sang 等〔15～17〕, Ferguson 等〔18〕和 Tank 等〔19〕用 DNA 序列对
芍药属的种间关系进行了一系列的研究。最近 , Zhou 等〔20〕利用形态学性状 , 在居群水平上对洪德元
和潘开玉 (1999) 牡丹新分类系统的全部 8 个种进行了系统发育关系分析 , 提出了牡丹组种间系统发
育关系的框架 , 但有关牡丹复合体的几个近缘种间关系仍未得到很好的解决。由于牡丹复合体中的各
个近缘种被认为是栽培牡丹的野生祖先〔1 ,9〕。因此 , 弄清牡丹组的种间亲缘关系具有重要的理论和实
践价值。
Sang 等〔15～17〕和 Ferguson 等〔18〕的研究结果证明 , 利用乙醇脱氢酶基因 ( A dh genes) 比使用 ITS
和叶绿体 m at K基因能建立更好的芍药属种间关系。但他们的研究只涉及牡丹组的 4 个种 : 滇牡丹
( P. delavayi) 、紫斑牡丹 ( P. rockii) 、矮牡丹 ( P. jishanensis) 、四川牡丹 ( P. decom posita) 。因
此 , 本研究拟在前人工作的基础上 , 使用牡丹组全部野生种的 A dh 基因序列来分析牡丹组种间亲缘
关系 , 希望为牡丹组野生种间亲缘关系提供直接的分子证据。
1 材料与方法
本研究所用的材料包括牡丹组的全部 8 个野生种 , 有关材料来源详见表 1。除了本研究新测定的
A dh基因序列外 , 在构建 A dh 基因树时还使用了 GenBank 中如下 A dh 基因序列 : 滇牡丹
(AF009052、AF009058、AF009059、AF009042、AF009051、AF009057 ) , 紫斑牡丹 ( AF009045、
AF009053、AF009062、AF009063 ) , 矮 牡 丹 ( AF009043、AF009054、AF009060 ) , 四 川 牡 丹
(AF009044、AF009061 ) , 川赤芍 ( P. veitchi , AF009048、AF009066 ) , 芍药 ( P. lactif lora ,
AF009049、AF009068) , 加利福尼亚芍药 ( P. calif ornica , AF009041、AF009056) , 北美芍药 ( P.
brow nii , AF009055) 。
表 1 本研究所用的野生牡丹材料
Table 1 The wild tree peonies used in the present study and their origins ( all the vouchers in PE)
材料
Materials
缩写 3
Abbrevi2
ations
来源
Origin
采集人及采集号
Collectors & No.
筛选克隆
数 Clones
screened
测序的克隆
Clones sequenced
A dh1A A dh1B A dh2
大花黄牡丹 P. ludlowii LUD124 西藏林芝 Nyingchi ,Xizang S. L . Zhou H02124 75 1 1 2
圆裂四川牡丹
P. decom posita ssp . rot undiloba
ROT1621
四川茂县
Maoxian ,Sichuan
Hong ,Pan & Zhou H0201621
16
2
1
1
紫斑牡丹原亚种
P. rockii ssp . rockii
ROC121
河南宝天曼
Baotianman ,Henan
Hong , Ye & Feng H97015
16
1
1
1
太白山紫斑牡丹
P. rockii ssp . taibaishanica
TAI122
陕西太白山
Taibaishan ,Shaanxi
Hong , Ye & Feng H97058
12
1
1
1
银屏牡丹巢湖居群
P. suf f ruticosa ssp . yinpingm u2
dan
YPM117
安徽巢湖
Chaohu ,Anhui
Pan & Xie H9701
16
1
2
3
银屏牡丹嵩县居群
P. suf f ruticosa ssp . yinpingm u2
dan
YPM118
河南嵩县
Songxian ,Henan
Hong , Ye & Feng H97010
16
1
1
3
凤丹 P. ostii OST106 河南卢氏 Lushi ,Henan Hong ,Pan & Zhou H02106 16 1 1 2
凤丹 P. ostii OST78 湖北保康 Baokang ,Hubei 3 3 Hong ,Pan & Zhou H02078 18 2 2 4
卵叶牡丹 P. qiui QIU80 湖北保康 Baokang ,Hubei 3 3 Hong ,Pan & Zhou H02080 12 1 1 3
矮牡丹 P. jishanensis J IS119 陕西延安 Yan’an ,Shaanxi Hong ,Pan & Zhou H97066 16 1 1 2
3 缩写中的数字代表试验号。3 3 样品采自甘肃兰州的引种居群。3 The numbers included in abbreviations represent experiment No. 3 3 Samples were collected from the cultivated plants in Lanzhou , Gan2
su province , China.
826 园 艺 学 报 31 卷
基因组 DNA 的提取采用改良的 CTAB 法〔21〕。基因片段的扩增使用引物〔17〕A dhF2 (5pi2CCTCG2
CA TA TTTGGTCACGAA G23pi) 和 A dhR2 (5pi2GGGCACACCAACAA GTACTG23pi) , 在 Tpersonal PCR
仪 (Biometra 公司) 上进行。 Taq DNA 聚合酶为华美公司生产 , 扩增条件为 : 94 ℃4 min ; 94 ℃1
min , 56 ℃45 s , 72 ℃1 min 30 s (1～5 循环) ; 94 ℃20 s , 55 ℃20 s , 72 ℃1 min 30 s (6～36 循环) 。
PCR 产物用 1 %琼脂糖凝胶在 TAE 中电泳检测并回收目标片段。产物回收使用 Amersham Bio2
sciences 公司生产的 PCR 产物回收试剂盒 ( GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit) , 方法按照使用
说明书进行。纯化后的 PCR产物用 p GEM ○R2T Easy Vector System II (Promega 公司) 连接 , 并转化JM109
大肠杆菌感受态细胞。在含氨苄青霉素和 X2gal 的 LB 平板上根据蓝白反应筛选阳性克隆。质粒 DNA 提
取采用碱裂解法。用 EcoRI酶切和 PCR方法对质粒 DNA 进行筛选 , 并将选取的克隆用于测序。测序引
物与扩增引物相同 , 序列测定在 ABI377 全自动测序仪上进行 , 测序试剂盒为DNA Sequencing Kit (PE公
司) 。序列校正用 SeqED 310 程序。
序列的对齐使用 ClustalX程序〔22〕, 对齐后的序列再加以人工检查。基因树的构建用 PAUP 3 410b
4a〔23〕。最大简约树 (Maximum parsimony , MP) 的构建使用启发式搜索 , 树二等分再连接分支交换
( TBR) , 各种核苷酸替代同等加权 , 空位 (gaps) 视为信息缺失 (missing information) 。自展检验 (boot2
strap analysis) 重复 500 次。邻接树 (Neighbor2joining , NJ ) 的构建使用 Kimura 两参数模型 ( Kimura 22
parameter) 。自展检验 (bootstrap analysis) 重复 1000 次。A dh1A、A dh1B、A dh2 基因树的拓扑结构一致
性用 PAUP 3 410b 4a 中的 partition2homogeneity test 来进行评价〔24〕。运算 1000 次 , 用得到的 P 值来决定
是否将数据合并以进行系统发育分析。
2 结果与分析
211 野生牡丹 Adh 基因序列的信息参数
本研究测定的 A dh1A、A dh1B、A dh2 基因
序列包括 4 个内含子和 5 个外显子。从表 2 中可
以看出 , 信息位点占序列的排列长度的百分率是
比较高的 , 比芍药组的 m at K 基因的变异率
(0185 %) 和 ITS 区的变异率 (3111 %) 都要高 ;
和芍药组的 A dh 基因的内含子的变异率相比 , 牡
丹的 A dh1A 信息位点百分率 (4 %) 比芍药组的
A dh1 内含子变异率 (4168 %) 略低 , 但牡丹的
A dh 2 信息位点百分率 ( 7 %) 却比芍药组的
A dh 2 内含子变异率 (4154 %) 高得多〔25〕。
表 2 Adh 基因的信息参数
Table 2 Informative parameters for Adh gene sequences
数据
Data
排列
长度
Aligned
length
变异
位点
Variable
sites
信息位点
Informative
sites
信息位点
百分率
Informative
sites( %)
树长
Tree
length
CI RI GC( %)
A dh1A1156 169 50 4 200 0192 0183 39179
A dh1B1172 130 50 4 153 0190 0186 39144
A dh2 1174 301 87 7 381 0187 0182 40173
212 野生牡丹的 Adh 基因树
21211 A dh1A、A dh1B 和 A dh2 基因树 对 A dh1A、
A dh1B和 A dh2基因的建树分析〔其中 A dh1B基因树
图 1 Adh1A基因的 2 棵最简约树的严格一致树
树长 = 200 ; CI = 019150 ; RI = 018265 ,
分支上的数值代表大于 50 %的自展支持率 ,
“～”以后的数字代表克隆号 , 下同。
Fig. 1 The strict consensus tree of 2 maximum parsimony
( MP) trees of Adh1A gene
Tree length = 200 ; Consistency index = 019150 ;
Retention index = 018265
The figures above branches are bootstrap percentages above 50 %.
the figures after‘～’represents the clone number , the same below.
926 5 期 林启冰等 : 基于 A dh 基因家族序列的牡丹组 (Sect . Moutan DC. ) 种间关系
用大花黄牡丹 ( P. l udlow ii) 和滇牡丹的克隆置
根〕分别得到 2 棵、117 棵和 169 棵最大简约树 ,
其相应的严格一致树分别见图 1、图 2 和图 3。由
于各基因的邻接树 (因篇幅所限未列出) 与其相
应的严格一致树所支持的种间关系一致 , 我们这
里根据各基因的严格一致树来进行种间关系分析 :
在 A dh1A 和 A dh2 基因树上 , 牡丹组全部种类
的克隆构成具有大于 99 %的自展值支持的一支
(图 1 和图 3) 。在牡丹组内 , 在 A dh1A 和 A dh2 基
因树上大花黄牡丹 (LUD124) 和滇牡丹 (LU T)
的克隆聚成一单系分支 (自展值 > 92 %) (图 1 和
图 3) , 但在 A dhlB 基因树 (图 2) 上 , 大花黄牡丹
的克隆 (LUD124～29) 未与滇牡丹 (DEL、LU T)
的克隆聚在一起 , 而是与圆裂四川牡丹的一个克隆
( ROT1621 ～ 3 ) 相 聚 (自 展 值 为 100 %) ; 在
A dh1A 和 A dh1B 基因树上 , 代表其余 6 个种的全
部克隆构成另一个单系分支 (自展值 > 91 %) (图
1 和图 2) , 在 A dh2 基因树上 , 情况稍微复杂一点
(图 3) 。然而 , 在此 6 个种的克隆构成的分支中 ,
银屏牡丹巢湖居群 ( YPM117) 的克隆和凤丹
(OST106、OST78) 的克隆构成的分支得到了 3 个
基因树的支持) (图 1～3) ; 银屏牡丹的河南居群
( YPM118) 的部分克隆和卵叶牡丹 (QIU80) 的克
隆构成的单系分支得到了 A dh1B 和 A dh2 基因树
的支持 (图 2、3) ; A dh2 基因树上四川牡丹
(SZE) 和 紫 斑 牡 丹 ( ROC ～ 1、ROC121 ～ 5、
TAI122～11) 聚为自展值 85 %的一支 (图 3) 。其
余各分支及其自展值详细见图 1～3。
21212 A dh1A、A dh1B 和 A dh2 基因合并分析
的基因树 从每个样的 A dh1A、A dh1B 和 A dh2
基因序列中分别任意选一条序列来代表该样进行
3 个基因合并分析。通过 partition2homogeneity
test〔24〕计算得P = 01001。现有研究对确定数据间
不冲突的 P 值范围有争议〔26〕, 而本研究的 P 值
(P = 01001) 处于其争议的 P 值范围下限 , 鉴于此 ,
我们用合并的数据进行了简约性分析 , 树置根处理
同 A dh1B 基因树。结果得到了唯一一棵 MP 树
(图 4) 。根据图 4 , 所有的分支均得到了大于 85 %
的自展值支持。和 A dh1A、A dh1B、A dh2 基
因树一致 , 合并分析的 MP 树支持银屏牡丹巢湖
居群 ( YPM117) 与凤丹 (OST78、OST106) 聚在一起 ; 与 A dh1A 和 A dh2 基因树一致 , 合并分析
的 MP 树支持大花黄牡丹 (L UD124) 和滇牡丹 (此为黄牡丹 L U T) 聚在一起 ; 与 A dh2 基因树一
036 园 艺 学 报 31 卷
致 , 合并分析的 MP 树支持四川牡丹 (此为圆裂
四川牡丹 RO T1621 ) 和紫斑牡丹 ( ROC121、
TAI122、ROC) 聚在一起 ; 和 A dh1B、A dh2 基
因树一致 , 合并分析的 MP 树支持卵叶牡丹
(Q IU80) 和银屏牡丹嵩县居群 ( YPM118) 聚在
一起。与 3 个单独的基因树不同的是 , 矮牡丹
(J IS119) 和卵叶牡丹 (Q IU80) 及银屏牡丹嵩县
居群 ( YPM118) 聚在一起并得到了很强支持
(自展值为 94 %) 。
3 讨论
311 Adh 基因树的分辨力
从 211 的分析来看 , 牡丹组 A dh 基因家族的 3
个基因的变异率不算低 , 但是得到的基因树分辨力
不高 , 主要表现在 3 个基因的基因树 (图 1～3) 都
发生了同种不同克隆未聚为一支的情况。用 A dh
基因进行系统发育分析时 , Sang 等〔17〕和 Small
等〔27〕也遇到了类似的情况。Sang〔25〕针对这种现象 ,
图 4 合并 Adh1A、Adh1B、Adh2 基因序列后
得到唯一的 MP树
树长 = 352 ; CI = 018778 ; RI = 017226
Fig. 4 The single maximum parsimony ( MP) tree based on
combined Adh1A、Adh1B and Adh2 data sets
Tree length = 352 ; Consistency index = 018778 ;
Retention index = 017226
总结了可能的原因有基因转换 (gene conversion) 、谱系分选 (lineage sorting) 和基因的并系同源
(paralogy) 等。
312 牡丹组的种间亲缘关系
洪德元和潘开玉的牡丹分类系统将牡丹组分为大花黄牡丹 , 滇牡丹 , 四川牡丹 , 紫斑牡丹 , 矮牡
丹 , 凤丹 , 卵叶牡丹 , 和牡丹 ( P. suf f ruticosa) 共 8 种 ; 大花黄牡丹 , 滇牡丹属于肉质花盘亚组 , 其
余 6 个种属于革质花盘亚组〔5〕。
对于这些种间的亲缘关系 , 前人的一系列研究 , 如于玲等的蛋白质证据〔13〕、邹喻苹等的 RAPD
证据〔12〕、Sang 等的 A dh 基因序列〔17〕、Tank 等的 GPA T 基因序列〔19〕、Zhou 等的形态证据〔20〕, 都一
致支持滇牡丹和大花黄牡丹关系最近。本文的研究结果与上述结果完全一致 (图 1、3 和 4) 。
在牡丹复合体 (紫斑牡丹 , 矮牡丹 , 凤丹 , 卵叶牡丹 , 和牡丹) 内 , 各种间在形态学和细胞学方
面都具有非常近的亲缘关系〔28 ,6〕。有关复合体内各种间关系以及这些种与四川牡丹之间的关系 , 在
现有的研究报道中没有一致的结论〔29〕。裴颜龙等认为卵叶牡丹和矮牡丹亲缘关系接近〔11〕。同时 , 洪
涛等认为凤丹、紫斑牡丹、矮牡丹之间亲缘关系也非常近〔10〕。袁涛和王莲英利用形态和孢粉学特征
进行的分析支持上述种类中卵叶牡丹与矮牡丹亲缘关系最近 , 它们与其余种的远近关系依次为杨山牡
丹 (凤丹) 和紫斑牡丹〔14〕。但他们的结论与邹喻苹等〔12〕的 RAPD 证据并不完全一致。根据本文的研
究结果 , 合并分析的基因树 (图 4) 显示卵叶牡丹和矮牡丹之间有近的种间关系 , 这一点与前人的研究
结果一致。从 A dh 基因树上 , 可以明显地看到银屏牡丹巢湖居群和凤丹有更近的种间关系 (图 1～4) ,
同时 , 这两个种中的银屏牡丹嵩县居群和卵叶牡丹有一定的关系 (图 2～4) 。这些结果是前人的研究中
没有报道的。另外 , 在形态学上 , 四川牡丹表现了从大花黄牡丹和滇牡丹向牡丹复合体过渡的中间形
态。袁涛和王莲英〔14〕以及 Zhou 等〔20〕的形态证据和众多的分子证据〔12 ,13 ,17 ,19〕支持四川牡丹与紫斑牡丹
有很近的亲缘关系。本文的研究结果中 , A dh2 和合并分析的基因树也明显支持这种关系 (图 3、4) 。同
时 , 在 A dh1B 基因树上 , 圆裂四川牡丹与大花黄牡丹聚在一起并得到 100 %自展值的的支持 , 这是否暗
示四川牡丹和肉质花盘亚组两个种间的亲缘关系 , 值得进一步研究 (图 2) 。
综合上述讨论 , 可以得出 : 本研究支持滇牡丹和大花黄牡丹、四川牡丹和紫斑牡丹、银屏牡丹
136 5 期 林启冰等 : 基于 A dh 基因家族序列的牡丹组 (Sect . Moutan DC. ) 种间关系
(巢湖) 和凤丹以及矮牡丹和卵叶牡丹关系紧密 ; 另外 , 本文结果是否暗示银屏牡丹 (嵩县) 和卵叶
牡丹两个种间有紧密关系 , 值得进一步探索。
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