全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (4) : 741～747
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 11 - 15; 修回日期 : 2005 - 05 - 10
基金项目 : 国家林业局野生动植物保护司 “石斛兰保育示范”专项项目 ; 华南热带农业大学院校科技基金项目 (Rnd0012)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zqx@ bjfu1edu1cn)
石斛属植物生物技术研究概况
宋希强 1, 2, 4 　罗毅波 1 　钟云芳 3 　张启翔 23
(1 中国科学院植物研究所系统与进化植物学重点实验室 , 北京 100093; 2 北京林业大学园林学院花卉技术研究中心 ,
北京 100083; 3 中国花卉园艺杂志社 , 北京 100026; 4 华南热带农业大学园艺学院 , 儋州 571737)
摘 　要 : 在系统查阅国内外近 20年来有关文献的基础上 , 对石斛生物技术方面的研究进行了简要综
述 ; 着重介绍了石斛属植物在离体繁殖、离体开花、种质资源的离体保存、原生质体分离与融合以及基因
工程等方面的研究情况。文章认为在石斛试管苗移栽、菌根技术以及组培过程中次生代谢产物的变化等方
面均有待深入研究 ; 而生物技术的迅猛发展为基于组织培养的石斛兰育种提供了广阔的应用前景。
关键词 : 石斛 ; 生物技术 ; 离体繁殖 ; 基因工程
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420741207
Advances in the B iotechnology of D endrobium O rch id
Song Xiqiang1, 2, 4 , Luo Yibo1 , Zhong Yunfang3 , and Zhang Q ixiang23
( 1Laboratory of System atic and Evolutionary B otany, Institu te of B otany, Chinese A cadem y of Scieneces, B eijing 100093, China;
2 Floricultural research institu te College of Landscape A rch itecture, B eijing Forestry U niversity, B eijing 100083, Ch ina; 3 Journal
O ffice of China Floriculture, B eijing 100026, Ch ina; 4 College of Horticu ltura l, Southern China U niversity of Eropica l A gricul2
ture, D anzhou 571737, China)
Abstract: Advances in biotechnology of D endrobium orchid including tissue culture, flowering and
germp lasm p reservation in vitro, p rotop last culture and fusion, as well as genetic engineering were reviewed,
based on the literature cited during two decade years. Meanwhile, subjects on the technology of p lantlet trans2
p lantation, mycorrhizal technology, and secondary metabolites in vitro are discussed in this paper to desert fur2
ther research in order to p rovide well background for D endrobium orchid industrialization. Furthermore, the
swift development of biotechnology benefits to p romp t the D endrobium orchid breeding for new varieties.
Key words: D endrobium ; B iotechnology; In vitro p ropagation; Genetic engineering
石斛属 (D endrobium ) 是兰科第 2大属 , 多年生草本 , 全球约 1 400余种〔1〕, 可作盆花和切花 ,
其中金钗石斛 (D. nobile)、密花石斛 (D. densif lorum )、束花石斛 (D. chrysan thum )、美花石斛
(D. lodd igesii)、流苏石斛 (D. fim bria tum ) 等种类兼具药用价值〔2〕。石斛兰在自然状态下繁殖困
难 , 种子萌发率极低。传统分株繁殖周期长 , 效率低 , 不能形成规模生产。此外长期无性繁殖造成感
染病毒植株日益增多 , 使花朵品质下降。因此将生物工程技术用于其品种快繁、复壮和优良品种培育
等 , 在加快育种进程、挽救珍稀濒危种类等方面具有重要作用。
国内外学者试图利用组织培养高频增殖的特点进行石斛的快速繁殖 , 以提高繁殖系数 , 解决种苗
短缺的问题〔3～8〕。最近发展了一种新的组织培养技术 ———薄层切片培养 TCS ( Thin Cross Section) , 此
技术能在增殖期间提供充足的营养和生长促进物质 , 消除了其他组织、器官的相互影响。可高效地获
得再生小植株 , 增殖系数高达 35, 现已在许多兰科植物中应用〔9〕。
进入 90年代后 , 采用基因枪法和农杆菌介导法已成功获得石斛转基因植株。本文就石斛生物技
术研究进行简要综述。
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1　离体繁殖
石斛组培苗再生植株可通过原球茎再生和器官再生途径获得 , 其中原球茎再生途径分原球茎发生
型和拟原球茎发生型两种类型 ; 器官再生途径分无菌短枝型、芽增殖型和不定芽型〔5, 8〕。由于类原球
茎发生型和不定芽发生型获得的再生植株变异大 , 在兰花工业化生产中多不采用。
目前国外主要以观赏用石斛为主 , 组织培养着重于培养条件的优化 , 如外植体、培养基成分和生
长调节剂的选择试验〔10～18〕; 国内的研究则以霍山石斛、曲茎石斛、金衩石斛、铁皮石斛和细叶石斛
等药用石斛为主〔19～26〕。采用无菌种子萌发技术 , 已成功地获得多种石斛的无性克隆个体〔27～29〕。但无
论是在国内还是国外 , 石斛花药培养、原生质体培养等尚未见报道。
2　离体开花
离体培养开花技术操作简单、易于控制 , 重复性强 , 为研究开花机理和生理提供了更精准的研究
手段〔30〕, 不仅缩短繁育周期 , 同时可获得快速进入生殖生长或高经济价值的试管花。国外离体开花
研究结合分子生物学技术 , 对花器官特异性基因进行克隆、测序和功能鉴定并且获得转基因植株。国
内则主要集中在植物激素和生长调节物质、碳水化合物、多胺、矿物质和培养条件等对成花的影
响〔31, 32〕。研究表明 : 低浓度 TDZ诱导花芽多为顶生单花 , 而高浓度 TDZ诱导花芽多为总状花序。降
低氮的含量 (1 /4～1 /10)、增加磷钾比例 (5倍 )、提高糖浓度 (40 g /L )、低温 (15 /5℃, 日温 /夜
温 ) 以及根修剪均能显著提高花芽形成率〔33, 34〕。ABA和 PP333对材料的预处理可以提高花芽数量。观
察还发现植株处于不同生理状态时 , 花芽形成频率是有差异的 , 较成熟的植株生长点较难诱导出花
芽〔35〕。
3　种质资源的离体保存
郭顺星等〔36〕和 Saip rasad等〔37〕先后探讨了以海藻酸钠凝胶包埋系统制作铁皮石斛人工种子的技
术。张铭等〔38〕应用粘土、蛭石粉等固形基质包埋制作人工种子 , 并达到与凝胶包埋系统相近的萌发
率和成苗率。王君晖等〔39〕采用快速和慢速脱水干冻法分别对铁皮石斛种子、类原球茎体进行液氮超
低温保存。陈勇等〔40〕对玻璃化法超低温保存铁皮石斛原生质体和初生原球茎进行了研究 , 其存活率
分别达 48%和 88%。史永忠等〔41〕研究发现铁皮石斛试管苗在 4℃和黑暗条件下连续保存 12个月 , 成
活率可达到 100%。
4　原生质体分离与融合
对兰花原生质体培养及采用融合技术能够获得远缘杂交新品种 , 尤其是利用基因工程技术可得到
转基因兰花。事实上 , 作为单子叶植物的兰花 , 原生质体培养和融合与双子叶植物相比所取得的成功
非常有限。Nan等〔42〕从石斛兰的黄化试管苗茎尖分离出原生质体 , 用改良 MS包埋培养 2～4周后形
成小的克隆。Neuman先后用蝴蝶兰、石斛兰、肾药万代兰为材料 , 得到 3% ～5%的融合原生质
体〔43〕。 Issirep等以 PEG为融合剂成功地将蝴蝶兰和石斛兰的原生质体进行了融合。Price和 Earle以
原球茎、根、叶和花为材料分离出 D endrobium ‘Beach Girl’ ×D endrobium ‘Takam i Kodama’、D en2
drobium ‘Lowis B leriot’等石斛兰品种的原生质体 , 并对 ‘Lowis B leriot’叶片原生质体和 ‘Beach
Girl’ בTakam i Kodarna’花瓣原生质体进行了融合〔43〕。
5　基因工程
基因工程是培育花卉新品种的重要方法 , 也为兰花的品种改良提供了广阔的前景。90年代以来 ,
一些研究者积极探索适合兰花外源基因导入的方法。目前常用的几种外源基因导入法 , 如农杆菌介导
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　4期 宋希强等 : 石斛属植物生物技术研究概况 　
转化法、基因枪转化法、PEG介导转化法、电击穿孔转化法等均可应用于兰花的外源基因导入 , 并
获得有转化证据的转基因植株〔44, 45〕。
Yu等〔46〕通过建立一套稳定的兰花组织培养系统 , 开展兰花开花分子机理的研究 , 主要是探讨花
发育过程中基因表达模式和功能。采用 mRNA差异显示法 , 从石斛兰 (D end robium m adam e Thong2In)
中分离和鉴定 1 种兰花同源性基因 DOH1〔47〕和 3 种兰花同源性基因 DOMADS1, DOMADS2 和
DOMADS3〔48〕。DOH1可能是唯一的 C lass 1 knox基因 , 它对植物的形态建成起关键性作用 , DOMADS1
仅仅在花序分生组织和花原基表达。Yu等〔49〕对转录起始位点上游的 DOMADS1启动子片断进行了分
离和测序。Yang等〔50, 51〕从杂种石斛 (D end robium son ia ) 中分离出 1种新的细胞分裂素氧化酶基因
DSCKX1, 并对其启动子进行测序和功能分析。
511　基因枪法
基因枪法获得石斛转基因植物也已实现。Kuchnle等〔52〕采用微粒轰击法将 N os N PT基因和番木瓜
病毒膜蛋白基因 ( PRVCP) 导入杂种石斛的原球茎。转化与否在附加 2%葡萄糖和 50～100mg/L硫酸
卡那霉素的 1 /2MS培养基上检验。PCR分析表明 , 由 2次杂交得到了 13株卡那霉素耐受性植株带有
N os N PT基因 , 其中只有 1株带有 PRVCP基因。这些结论表明用粒子轰击的方法可以实现单子叶植
物石斛的转基因。Chia等〔53〕已成功将荧光素酶基因 (L uc) 通过钨粒子微弹射击导入石斛类原球茎 ,
从转化的石斛兰组织中获得植株再生。由于兰科植株生长缓慢 , 转化体的筛选便成为限制兰花转化的
主要因素之一。Yu等〔54〕发展了一个高频再生、高效而稳定表达的转化体系。以潮霉素磷酸转移酶基
因 HPT代替卡那霉素 , 50 mg/L浓度下就能完全抑制非转化的杂种石斛原球茎生长。研究表明 : 以原
球茎为转化子 , 获得的转基因植株遗传特性可以稳定表达 , 这为转基因技术应用于兰花育种提供了可
能。
512　根癌农杆菌介导法
兰花基因工程进展较缓慢 , 主要是因为兰科植物对根癌农杆菌或发根农杆菌不敏感 , 缺乏合适的
载体。利用根癌农杆菌介导法获得转基因植物的关键是毒性基因的诱导表达 , 而在单子叶植物中常常
缺少这种诱导物质。Nan等〔42〕在石斛组织培养中发现类原球茎发育早期有大量的松柏醇产生。它是
存在于石斛中的一种细菌侵入性基因的诱导物 , 可诱导毒性基因的表达。将暗处培养的类原球茎转入
光照条件下培养 , 其含量增加了 6倍。类原球茎松柏醇的产量是叶的 11倍 , 这使通过农杆菌介导法
可获得转基因植物成为可能。
获得石斛兰转基因植株成功的关键在于与根癌农杆菌 (A grobacterium tum efaciens) 共培养。新加
坡和我国学者先后成功获得农杆菌介导的石斛兰转基因植株 , 但转化体与农杆菌共培养处理上略有差
异。Yu等〔55〕首先将经薄层切片处理的类原球茎与农杆菌在无抗生素的培养基上共培养 3 d, 光照 16
h / d。此后在添加 50 mg/L羧苄青霉素的培养基上继续培养 3～4周。适当延长共培养时间有助于提高
转化效率 , 试验结果表明第 2阶段最佳培养时间为 4周 , 超过则会因农杆菌污染而导致外植体坏死。
200 mg/L卡拉霉素适用于石斛兰转化子的筛选 , 选择培养 6～8周后得到转基因植株。
Men等〔56〕则以 HPT为选择基因 , GUS为报告基因 , 构建了二元载体 p CAMB IA1301。根癌农杆
菌在含 100μmol/L乙酰丁香酮 (Acetosyringone) 培养基上预培养 2～3 d后 , 与金钗石斛类原球茎共
培养 ; 当观察到根癌农杆菌时 , 转入含有 30 mg/L潮霉素和 250 mg/L头孢氨甲苯唑 (Cefotaxime) 的
培养基中进行筛选 ; 增殖的类原球茎需进行多次潮霉素抗性筛选。 Southern杂交和组织化学分析表
明 , 外原基因已整合并获得表达 , 其转化率达 18%。
6　问题与展望
611　重视菌根技术 , 开展试管苗移栽研究
植物不同发育阶段可能需要与不同的真菌共生。潘超美等〔57〕从野生建兰和墨兰根中分离、纯化
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培养收获 4种菌株 , 发现其真菌诱导子对铁皮石斛组织培养物 (愈伤组织、拟原球茎以及不定芽 )
的生长均有不同程度地促进作用。郭顺星等〔58〕从野生铁皮石斛和金钗石斛根中分离获得内生真菌 25
种 , 其中 5种真菌可促进铁皮石斛种子萌发 ; 7种真菌可与铁皮石斛和金钗石斛幼苗形成共生关系。
因此 , 分离和筛选促进石斛生长发育的适宜菌根真菌 , 可能是提高试管苗移栽成活率、解决石斛生产
的关键所在。
Markovina等〔59〕对万代兰族 Sarcoch ilus属的人工杂交种类进行了对比试验。结果表明有菌播种可
以明显提高种子萌发后的生长速度 , 在种子萌发后 13周就可以得到幼苗 , 而用无菌播种得到同样的
结果需要 50周 , 并且有菌播种可以缩短幼苗从培养基中移栽到盆中所需的生长时间。因此他们认为
有菌播种方法不仅可以节约生产成本 , 更为重要的是带菌的幼苗可以为兰科植物保育提供重要的保
障。
612　发展新的技术和方法 , 推动兰花工业生产
组织培养技术已在兰花生产中广泛使用 , 并不断有改进的技术和新方法推出。与薄层切片培养
TCS相同 , 薄层细胞培养 ( Thin Cell Layer, TCL) 为另一种高频、快速增殖再生植株的技术 , 该方法
同样适用于兰科植物的许多属种 , 但尚未在石斛上应用〔60〕。
613　加强组织培养次生代谢产物研究 , 有效解决药用石斛资源短缺
直接以组织培养物替代使用原药材或者生产活性成分也是解决石斛资源短缺的方法之一 , 但目前
涉及到该方面的研究还很少〔61～64〕。深入了解次生代谢产物的产生及积累动态 , 通过调控培养条件、
添加前体化合物、真菌诱导子等方法提高活性成分的产量 , 以探讨组织培养物代替药材使用的可能
性 ; 建立有效的生物反应器 , 直接生产活性成分。
614　结合生物技术手段 , 开展石斛遗传育种研究
兰花种子无菌萌发育苗技术使得兰花品种间、种间及属间的杂交育种成为可能。离体培养中高浓
度的激素可诱导愈伤组织发生变异。试管开花技术如能诱导转化组织再生的转基因植株开花结实或提
供活力较高的花粉 , 这将极大的缩短育种进程 , 为培育新品种提供了高效、安全的育种途径。
615　展望
石斛为世界四大热带兰之一 , 不同种或品种之间 , 其观赏价值可能有很大区别。离体扩繁技术为
石斛种质资源有效的保存和永续利用提供了可能 ; 而通过遗传转化 , 导入花色、花期、株型等目的基
因 , 一方面可以提高和改善石斛兰的观赏价值 , 另一方面可以创造新品种 , 为石斛兰提供了丰富的育
种资源。
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