全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2001 , 28 (4) : 301～306
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2000 - 12 - 12 ; 修回日期 : 2001 - 02 - 21
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (39830260)3 通讯联系人。
玻璃化法超低温保存柑桔茎尖及植株再生
王子成　邓秀新 3
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 武汉 430070)
摘　要 : 采用玻璃化法对柑桔茎尖的离体超低温保存进行了研究。约 10 mm 长的柑桔茎
尖于含 5 %二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基上预培养 3 d , 切取 2～2. 5 mm 长的茎尖 , 室温下
60 %玻璃化溶液 2 (PVS2) 装载 20～30 min , 然后用 PVS2 于 0 ℃处理 50～60 min , 换入新鲜的
PVS2 , 迅速投入液氮中 , 24 h 后在 40 ℃水浴中迅速化冻 , 再用 1. 2 mol/ L 蔗糖培养基洗涤 2
次 , 接种于含 BA 1. 0 mg/ L 的 MT培养基上 , 26 ℃暗培养 1 周后转于正常光下培养。枳壳茎尖
超低温保存后用氯化三苯基四氮唑 (TTC) 法检测 , 成活率为 100 % , 培养再生率达到 90 % ,
再生后的苗能正常生根 , 与对照没有形态上的变异 , 移栽可成活。
关键词 : 柑桔 ; 茎尖 ; 超低温 ; 玻璃化法
中图分类号 : S 666 ; Q 813 　 文献标识码 : A 　 文章编号 : 05132353X (2001) 0420301206
液氮超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存的最好方法。在液氮条件下 , 活细
胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止 , 植物材料处于相对稳定的生物学状态〔1〕。为了
在液氮条件下保存种质资源 , 人们已试验了很多种方法 , 已有达百种以上的植物材料进行
了超低温保存 , 取得了很多进展。迄今 , 尽管成功地保存了多种植物材料的许多细胞类
型 , 但其实际操作仅在较少情况下能够简易进行 , 对体积较大的由已分化的多种细胞类型
组成的组织和器官 , 如茎尖的保存则常常难以奏效。而近几年发展较快的玻璃化法以其设
备要求简单、材料处理步骤简便、效果和重演性好等优点〔2 ,3〕, 倍受人们推崇 , 成为较理
想的植物种质资源保存方法。利用玻璃化法已成功地保存了十几种植物的茎尖〔4〕。柑桔胚
性愈伤组织的玻璃化超低温保存前人已做了很多研究 , 试验体系已基本完善〔5〕。本试验用
玻璃化法进行柑桔茎尖的超低温保存 , 以期建立起柑桔茎尖的超低温保存体系 , 为长期稳
定保存柑桔种质资源提供技术支持。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
品种或类型 : 枳壳 ( Poncirus trifoliata) , 439 〔瓯柑 Citrus suavissima Hort . et Tanaka ×改
良橙 C. sinensis (L. ) Osbesk cv. Gailiangcheng〕, 红肉脐橙 〔C. sinensis (L. ) Osbesk cv.
Cara cara〕和　柑 ( C. reticulata Blan co cv. Ponkan) 。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　再生无菌苗 　从成熟果实中取未受精胚珠 , 经表面消毒后〔6〕, 接种于 MT + SAD
40 mg/ L + GA3 1 mg/ L + ME 500 mg/ L 的培养基 (胚状体诱导培养基) 上 , 于 26 ℃暗培养箱
中进行培养 , 获得胚状体 , 并再生成株。切取茎段 , 每 40 d 继代 1 次。培养基为 MT基本
培养基附加 BA 0. 5 mg/ L , NAA 0. 1 mg/ L , GA3 0. 3 mg/ L 和蔗糖 30 g/ L (生芽培养基) ,
培养温度 26 ℃, 光照 12 h/ d , 光照强度 2 000 lx。
1. 2. 2 　保存方法 　继代 20～30 d 的柑桔茎尖 , 长度为 10 mm 左右 , 于 5 %二甲基亚砜
(DMSO) + 5 %蔗糖 + MT基本培养基上 , 在上述培养条件下预培养不同天数 , 然后再切取
茎尖 , 长度分别为 1～1. 5 mm、2～2. 5 mm、3～3. 5 mm , 转移于 1. 8 mL 冷冻管中 , 每管
10 个茎尖。室温下 60 %玻璃化溶液 2 (PVS2) (0. 15 mol/ L 蔗糖液体培养基与 PVS2 溶液体
积比为 40∶60)〔5〕溶液处理不同时间 , 再用 PVS2 (30 %甘油 , 15 %乙二醇 , 15 % DMSO ,
0. 4 mol/ L 的蔗糖) 于不同温度下处理不同时间 , 移去原液 , 装入新鲜的保护液 , 将冷冻
管装入自制的纱布袋中 , 每袋 2～3 管 , 然后迅速将冷冻管投入液氮中。每一处理 20 个茎
尖 , 3 次重复。
1. 2. 3 　化冻、成活检测与再培养 　保存 24 h 后 , 从液氮中取出冷冻管 , 在 40 ℃下迅速化
冻 , 分别用无菌水、蔗糖 1. 2 mol/ L + MT基本培养基洗涤 2 次 , 每次 10 min。氯化三苯基
四氮唑 (TTC) 法检测成活率〔7〕, 或转入继代培养基进行培养 , 以检测再生率。将培养成
活的材料接种于生根培养基 (1/ 2 MT + NAA 0. 5 mg/ L + 蔗糖 25 g/ L) 进行生根培养 , 生根
以后移栽至温室。
2 　结果与分析
2. 1 　未受精胚珠培养
未受精胚珠在胚状体诱导培养基上培
养 2 个月内均可获得再生胚状体 , 除 439
外 , 其它 3 个品种或类型胚状体发生率均
超过 50 % , 其中红肉脐橙胚状体发生率最
高 , 达 80 %。如表 1 所示 , 红肉脐橙和　
柑在胚状体诱导培养基上经过连续培养 ,
还获得了胚性愈伤组织。将获得的胚状体
接种于生芽培养基上 , 能够再生出苗。将
这些小苗在生芽培养基上进行扩繁 , 获得
大量材料 , 供超低温保存研究。
表 1 　不同基因型未受精胚珠胚状体发生率及出愈率
Table 1 　The percentage of embryogensis and embryogenic
calli derived from unfertilized ovules of different genotype
品种或类型
Cultivars
or types
接种数
No. of
inoculation
产生胚状
体数
No. of
induced
embryoid
胚状体发
生率
Percent of
embryoids
( %)
出愈率
Percent
of callus
( %)
枳壳 Poncirus 60 30 50 0
红肉脐橙 60 48 80 25
Cara cara
柑 Ponkan 60 33 55 25
439 60 15 25 0
2. 2 　预培养对超低温保存后成活率的影响
前人研究表明 , 预培养对提高植物材料超低温保存的成活率具有很大的影响〔8〕。通过
试验发现 , 所试品种茎尖用低温预培养和山梨醇预培养 , 均未能提高超低温保存后材料的
成活率 , 而用 5 % DMSO 进行预培养 , 则可大幅度提高 , 而且预培养时间对成活率具有决
定性的影响。随着预培养时间的延长 , 超低温保存后成活率有升高的趋势。从表 2 中看
出 , 预培养 3 d 后 , 枳壳和红肉脐橙的超低温保存后成活率均达到 100 % , 分别预培养 4 d
和 6 d 后 , 柑和 439 亦有 100 %的成活率。但预培养时间超过 3 d , 材料的下部有黄化脱
203　　　　　　　　　　　　　　　园 　　艺 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　28 卷
叶现象发生 , 4 d 后则有部分材料开始死亡 , 原因是 DMSO 对材料生长有毒害作用。随预
培养时间增加 , 一方面可能使细胞的生理状态发生利于超低温保存的变化 , 使胞内保护性
物质增多 , 另一方面也可能起到一种筛选作用 , 使较弱的材料受不了 DMSO 的毒害而死
亡 , 而能经受起 DMSO 毒害的材料较强壮 , 因此超低温保存后成活率较高。总的情况是随
预培养时间的延长 , 预培养成活率降低 , 但超低温保存后成活率升高。综合考虑 , 预培养
时间以 3～6 d 为好 , 最多不能超过 1 周。
表 2 　柑桔经 5 %二甲基亚砜不同预培养时间对超低温保存后成活率的影响
Table 2 　Effect of different time of preculture in 5 %DMSO medium on the survival rate after cryopreservation
品种或类型
Cultivars or types
预培养时间
Preculture time (d)
成 活 率
Survival rate ( %)
枳 壳 Poncirus 0 50. 00
1 80. 00
2 95. 00
3 100. 00
4 100. 00
5 100. 00
6 100. 00
10 100. 00
红肉脐橙 Cara cara 0 13. 33
1 66. 67
2 95. 00
3 100. 00
4 100. 00
5 100. 00
6 100. 00
7 100. 00
品种或类型
Cultivars or types
预培养时间
Preculture time (d)
成 活 率
Survival rate ( %)
柑 Ponkan 0 33. 33
1 80. 00
2 86. 67
3 90. 00
4 100. 00
5 100. 00
6 100. 00
10 100. 00
439 0 10. 00
1 18. 33
2 26. 67
3 33. 33
4 50. 00
5 70. 00
6 100. 00
10 100. 00
　　注 : 表中所列为 TTC法检测结果。
Note : The result in the table were obtained from TTC examination.
2. 3 　预处理时间对超低温保存后成活率的影响
据研究 , 有些植物茎尖在用玻璃化溶液 ( PVS) 快速脱水之前 , 有一个所谓装载
(loading) 的过程 , 即用一个较高浓度的冷冻保护剂混合液于室温下预处理一定时间 , 以
进一步降低组织含水量 , 避免由于渗透压变化剧烈对材料所造成的伤害。本试验用 60 %
PVS2 进行装载 , 成活率与对照 (预处理 0 min) 相比有较大提高 (表 3) 。所试 4 个品种或
类型均在 30 min 的预处理中获得最大的成活率 , TTC检测成活率达到 100 % ; 低于 20 min ,
由于装载时间过短而未能完全达到缓冲的作用 , 材料不易成活 ; 超过 40 min , 则由于溶液
对材料的毒害而使成活率又有所下降。一般来讲 , 室温较高时 20 min 较为适宜 , 室温低
时 (冬季) 可适当延长为 30 min。
2. 4 　PVS2 处理时间对超低温保存后成活率的影响
PVS2 处理的目的是脱去材料中过多的水分 , 使材料能够完全达到玻璃化 , 并使冷冻
保护液渗入细胞 , 减轻在超低温保存过程中细胞所受到的伤害。试验发现 , 由于 PVS 的
毒害作用较大 , 在室温下用 PVS2 处理 , 材料容易死去 , 故在 0 ℃用 PVS2 处理。枳壳和
439 在 50 和 60 min 两个处理时间内都达到 100 %的成活率 , 而红肉脐橙和　柑也在 60 min
3034 期 　　　　　　　　　王子成等 : 玻璃化法超低温保存柑桔茎尖及植株再生 　　　　　　　　　
　　　　　　　　　的处理时间下达到最高的成活率。如表 4
所示 , 处理时间少于 50 min , 则材料脱水
不够 , 在降温过程中不能迅速达到玻璃化
状态 , 因而不易成活 ; 处理时间超过
60 min , 材料由于受 PVS 的毒害 , 成活率
反而又有所降低。不同材料对 PVS 的忍受
力不同 , 其中枳壳较能忍受 , 时间延长至
80 min 仍有 88. 67 %的成活率。
表 3 　柑桔经 60 %玻璃化溶液 2 不同装载时间
对超低温保存后成活率的影响
Table 3 　Effect of time of loading with 60 % PVS2
on the survival rate after cryopreservation
品种或类型
Cultivars or types
装载时间
Loading time
(min)
成 活 率
Survival rate
( %)
枳 壳 Poncirus 0 38. 33
10 50. 00
20 86. 67
30 100. 00
40 90. 00
红肉脐橙 Cara cara 0 18. 33
10 48. 33
20 83. 33
30 100. 00
40 83. 33
柑 Ponkan 0 36. 67
10 45. 00
20 90. 00
30 100. 00
40 71. 67
439 0 33. 33
10 43. 33
20 91. 67
30 100. 00
40 76. 67
　　注 : 同表 2。Note : Same with Table 2.
表 4 　柑桔经玻璃化溶液 2 处理不同时间
对超低温保存后成活率的影响
Table 4 　Effect of time of treatment with PVS2
on the survival rate after cryopreservation
品种或类型
Cultivars or types
处理时间
Treatment time
(min)
成 活 率
Survival rate
( %)
枳 壳 Poncirus 10 18. 33
20 81. 67
30 86. 67
40 95. 00
50 100. 00
60 100. 00
70 93. 33
80 88. 67
红肉脐橙 Cara cara 10 13. 33
20 23. 33
30 58. 33
40 85. 00
50 96. 67
60 100. 00
70 91. 67
80 76. 67
柑 Ponkan 10 23. 33
20 28. 86
30 73. 33
40 85. 00
50 93. 33
60 96. 67
70 90. 00
80 76. 67
439 10 20. 00
20 71. 67
30 81. 67
40 86. 67
50 100. 00
60 100. 00
70 88. 33
80 73. 33
　　注 : 同表 2。Note : Same with Table 2.
2. 5 　材料大小对超低温保存后成活率的影响
材料大小对脱水的难易影响很大。材料体积大 , 不利于脱水 , 但容易再生 ; 体积小 ,
易于脱水 , 但不易再生 , 而且冷冻保护剂对材料的毒害较大 , 从而影响成活率。本研究所
试 4 个品种或类型茎尖长度在 2～2. 5 mm 范围内均得到较高的成活率 , 平均达 96. 25 %
(表 5) ; 而茎尖长度在 1～1. 5 mm 时 , 成活率平均为 41. 89 % , 3～3. 5 mm 时平均成活率
为 51. 25 %。因此 , 在进行保存时 , 一定要注意材料的大小。
2. 6 　材料培养再生及其形态发生
材料成活和再生率因品种不同差异很大。一般来说 , 同一品种比较健壮的材料较易成
403　　　　　　　　　　　　　　　园 　　艺 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　28 卷
　　　　　　　　活和再生。进行再生培养时 , 如果保存后
未用蔗糖 1. 2 mol/ L 洗涤 , 则材料全部死
亡 , 如用无菌水洗涤 , 则再生率较用蔗糖
洗涤的低。如果培养基中不加细胞分裂素 ,
则再生率很低。保存后暗培养一段时间 ,
有利于材料的恢复生长。对培养成活的植
株形态发生进行观察 , 调查了 50 个再生植
株 , 发现 50 %是从茎尖萌发成株 , 10 %侧
芽再生 , 40 %的顶芽和侧芽均萌发 , 大部
分材料除芽成活外 , 其它部分在培养过程
中褐化死亡 , 这与在用 TTC 检测时发现有
的茎尖只是顶芽或侧芽的部位变红 , 而其
它部分仍保持绿色相一致。再生是通过器
官发生途径 , 未经过愈伤阶段 , 因此发生
变异的机率较小。按优化的方法 , 即预培
养 3 d , 取 2. 5 mm长的茎尖 , 用 60 % PVS2
装载 30 min , PVS2 处理 60 min , 换上新鲜
的 PVS2 , 然后投入液氮中 , 24 h 后化冻 ,
表 5 　柑桔茎尖大小对超低温保存后成活率的影响
Table 5 　Effect of size of the shoot2tips on
the survival rate after cryopreservation
品种或类型
Cultivars or types
茎 尖 大 小
Size of shoot2tips
(mm)
成 活 率
Survival rate
( %)
枳 壳 Poncirus 1～1. 5 43. 33
2～2. 5 100. 00
3～3. 5 53. 33
红肉脐橙 Cara cara 1～1. 5 41. 67
2～2. 5 91. 67
3～3. 5 58. 33
柑 Ponkan 1～1. 5 33. 33
2～2. 5 93. 33
3～3. 5 51. 67
439 1～1. 5 48. 33
2～2. 5 100. 00
3～3. 5 41. 67
平均 Average 1～1. 5 41. 89
2～2. 5 96. 25
3～3. 5 51. 25
　　注 : 同表 2。Note : Same with Table 2.
用蔗糖 1. 2 mol/ L 培养基洗涤 , 进行再生培养 , 实际培养再生率 , 枳壳 90 % , 红肉脐橙
30 % , 柑 25 % , 439 为 20 %。再生苗移入生根培养基后能正常生根 , 尚未观察到形态变
异的发生 , 再生苗移栽于温室后能够成活。
3 　讨论
许多柑桔品种的种子不能进行长期保存 , 并且很多品种的种子败育 , 成年态柑桔芽的
离体培养存在再生难的问题。这就要求在进行离体保存时找到一种合适的途径获得离体培
养材料 , 既要易于获得 , 又要保持品种的遗传特性。大多数柑桔品种的成熟果实中都有未
受精胚珠存在 , 通过培养这些未受精胚珠获得离体材料 , 利于种质的采集和交流〔6〕, 而且
未受精的胚珠是通过体细胞胚胎发生途径再生植株 , 能够保持原来品种的特性。前人研究
和本试验结果表明 , 通过未受精胚珠离体培养 , 大多数柑桔品种能够通过胚状体途径获得
再生材料 , 且不携带病毒。所以 , 用成熟果实未受精胚珠培养获得胚状体并再培养成株 ,
是进行柑桔离体保存时获得离体材料理想途径。
柑桔离体材料的超低温保存研究多集中在胚性愈伤组织的保存上。多数研究表明 , 愈
伤组织中存在着很多变异 , 不是种质保存最理想的材料〔9〕, 而通过茎尖培养再生成株 , 不
经愈伤组织阶段 , 减少了发生变异的机率 , 因此茎尖可作为种质保存的理想材料。
Gonzalez2Arnao 用包埋干燥法进行了枳壳茎尖的超低温保存 , 成活率最高可达 50 % , 而且
需要程序控温仪〔10〕。本研究用玻璃化法对柑桔茎尖进行超低温保存 , 枳壳茎尖保存后再
生率达到 90 % , 而且不需程序控温仪 , 方法简便 , 易于操作。本研究结果表明 , 不同品
种再生情况差异较大 , 除枳壳外 , 所试验的其它 3 个品种 , 虽然 TTC 染色检测成活率达
5034 期 　　　　　　　　　王子成等 : 玻璃化法超低温保存柑桔茎尖及植株再生 　　　　　　　　　
100 % , 但再生率却很低。一方面 , 可能是 TTC 检测只是以过氧化脱氢酶的活力为标准 ,
而材料的损伤程度不能仅以此为准 ; 另一方面 , 也可能是在进行超低温保存后培养时 , 材
料未达到超低温保存后恢复生长的要求。另外 , 超低温保存后再生能力也可能与品种抗寒
性有关 , 所试 4 个品种中 , 枳壳是柑桔类植物中最抗寒的类型 , 而其它 3 个品种抗寒性均
不强。因此 , 还需要进行深入研究优化条件 , 最终达到实用化。另外 , 液氮超低温保存时
间长短可能不是影响超低温保存效果的因素 , 在液氮条件下保存 2 个月 , 解冻后再生率与
保存 24 h 没有显著差异 , 这和前人的研究结果相同。这是因为在液氮条件下 , 生命活动
几乎完全停止 , 处于相对稳定状态 , 这也是超低温保存得以应用的主要依据。
参考文献 :
1 　肖洁凝 , 黄学林. 茎尖和芽的超低温保存. 生物工程进展 , 1999 , 19 (5) : 46～51
2 　Takagi H , Thinh N T , Kyesmu P M. Cryopreservation of vegetatively propagated tropical crops by vitrification. Acta Hort . ,
1998 , 461 : 485～490
3 　王君晖 , 黄纯农. 玻璃化法———园艺作物茎尖和分生组织超低温保存的新途径———文献综述. 园艺学报 , 1994 ,
21 (3) : 277～282
4 　张玉进 , 张兴国 , 刘佩瑛 , 等. 植物茎尖的玻璃化冻存研究. 武汉植物学研究 , 1999 , 17 (增刊) : 78～82
5 　Sakai A , Kobayashi S , Oiyama I. Cryopreservation of nucellar cells of navel orange ( Citrus sinensis sb. var. brasiliensis Tana2
ka) by vitrification. Plant Cell Reports , 1990 , 9 : 30～33
6 　霍合强 , 郝玉金 , 邓秀新. 宽皮柑橘品种的胚性愈伤组织诱导. 实验生物学报 , 1999 , 32 (3) : 289～295
7 　李广武 , 郑从义 , 唐　兵. 低温生物学. 湖南 : 湖南科学技术出版社 , 1997. 300～304
8 　Tskagi H , Tinh N , Islam O M , et al . Cryopreservation of in vitro2grown shoot tips of vitrification procedure. Plant Cell Reports ,
1997 , 16 : 594～599
9 　Peschke V M , Phillips R L. Genetic implication of somaclonal variation in plants. Adv. Genet . , 1992 , 30 : 41～75
10 　Gonzalez2Arnao M T , Engelmann F , Urra C , et al . Cryopreservation of citrus apices using the encapsulation2dehydration
technique. Proc. Barcelona : Cryo 97·34th Annual meeting of society for cryobiology , 1997. 8～12
Cryopreservation of Citrus Shoot2tips by Vitrif ication and Regenera2
tion
Wang Zicheng and Deng Xiuxin
( National Key Laboratory of Crops Genetic Improvement , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070)
Abstract : A procedure had been studied on cryopreservation of citrus shoot2tips in vitro by vitri2
fication. Shoot2tips of citrus about 10 mm were precultured for 3 days in MT medium supplemented
with 5 % DMSO. The excised shoot2tips , 2 - 2. 5 mm in length , were loaded with 60 % PVS2 for 20
- 30 min at room temperature , and were exposed to PVS2 at 0 ℃ for 50 - 60 min. Followed by
changing the solution with fresh PVS2 , the shoot2tips were immersed into LN directly , and kept for 24
h. After rapid thawing in a water bath at 40 ℃, the shoot2tips were washed with 1. 2 mol/ L sucrose
solution for twice and transferred onto MT medium supplemented with BA 1. 0 mg/ L. The cultures
were kept in dark for one week prior to exposure to the light . Survival rate of shoot2tips of Poncirus tri2
foliata was 100 % by TTC examination , and regeneration rate reached to 90 %. The plantlets rooted
normally and survived after transplantion. No morphological difference between the regenerated
plantlets and the control was observed.
Key words : Citrus ; Shoot2tips ; Cryopreservation ; Vitrification
603　　　　　　　　　　　　　　　园 　　艺 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　28 卷