全 文 ：第20卷 第6期
Vol.20 No.6
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 11月
Nov. 2012
干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究
刘文婷1,刘永红2,何蔚娟3,段琦梅1∗,权 悠1
(1.西北农林科技大学生命学院,陕西 杨凌 712100;2.西安职业技术学院,陕西 西安 710077;
3.三原县农业科技中心土肥站,陕西 三原 713800)
摘要:为探明干化的体细胞胚作为转基因苜蓿(Medicagosativa)人工种子的可行性,采用农杆菌菌株GV3101感
染苜蓿叶柄的遗传转化方法,获得转化苜蓿植株并诱导转化出苜蓿植株的体细胞胚。将成熟的子叶期体细胞胚先
置于含10mM脱落酸的胚形成培养基BOi2Y中培养14d,然后将胚置于一系列的6种干燥剂中缓慢干燥7d,最
后将胚转到1/2MSO萌发培养基中,直到茎叶萌发和根形成。分析不同转基因株系干化人工种子的萌发率和再生
植株中的GUS表达,并利用Southern杂交分析转基因干化人工种子再生植株的遗传变异。结果表明:干化后的转
基因人工种子萌发率达到74.3%,产生的植株从形态上相似于没有干化处理的体细胞胚再生植株。在随机的3个
转基因株系中,Southern杂交结果表明再生植株仍能稳定表达GUS,每个株系基因整合位点一致。因此,干化体细
胞胚用作转基因植物种质保藏的方法是有效可行的。
关键词:脱落酸;子叶期体细胞胚;干燥;种质保藏;转基因苜蓿
中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)06-1143-07
DesiccationSomaticEmbryosofTransgenicAlfalfa
LIU Wen-ting1,LIUYong-hong2,HEWei-juan3,DUANQi-mei1∗,QUANYou1
(1.DepartmentofLifeScience,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling,ShaanxiProvince712100,China;
2.Xi’anProfessionalTechnologyColege,Xi’an,ShaanxiProvince710077,China;3.InstitutionofSoilandFertilizer
inCenterofAgricultureandScienceinSanyuan,Sanyuan,ShaanxiProvince713800,China)
Abstract:Inordertoexplorethefeasibilityofusingdesiccatedsomaticembryosastheartificialseedsof
transgenicalfalfa,transformedalfalfaplantletswereobtainedbymeansofalfalfagenetictransformation
methodstoinducesomaticembryos.Maturecotyledon-stagesomaticembryoswereculturedonBOi2Yme-
diumcontaining10mMabscisicacidfor14days.Then,somaticembryosweredesiccatedinaseriesofdes-
iccatorsfor7daysofslowdrying.Finaly,thedesiccatedsomaticembryosweretransferredto1/2MSO
mediumforgerminationandtransgenicplantletdevelopment.Germinationratesofartificialseedswerean-
alyzedindifferenttransgenicalfalfalinesandGUSexpressionwasdetectedinregenerationplantletsby
histochemicalanalysis.Hereditaryvariationsinregenerationplantsofartificialseedswereanalyzedby
southernblotting.Resultsshowedthatthegerminationrateofdesiccatedtransgenicsomaticembryoswas
74.3%.Themorphologyofplantsproducedfromdesiccatedsomaticembryoswassimilartothatfromo-
riginals.Southernhybridizationconfirmedthattheregenerationplantsofdesiccatedsomaticembryosin-
ducedfromtransgenicalfalfastilhadstableGUSexpressionandtheintegrationsiteofgenewasconsistent
intestedalfalfatransformationlines.Findingsshowthismethodtobefeasibleforusingdesiccatedsomatic
embryosasgermplasmpreservationoftransgenicplants.
Keywords:Abscisicacid;Cotyledonarystagesomaticembryos;Desiccation;Germplasmpreservation;
Transgenealfalfa
人工种子(artificialseeds)是 Murashige在
1978年国际园艺植物学会上提出的概念[1],又称合
成种子或体细胞种子,是通过组织培养技术,将植物
的体细胞诱导成在形态和生理上均与合子胚相似
收稿日期:2012-06-30;修回日期:2012-11-05
基金项目:中国中科院知识创新工程重要方向项目(KZCX2-YW-443);“十一五”国家科技支撑计划(2008BAD98B08);西北农林科技大学
博士科研启动基金(2010BSJJ043)资助
作者简介:刘文婷(1975-),女,陕西扶风人,讲师,博士研究生,主要从事药用植物组织培养和次生代谢方面的研究和教学,E-mail:lwt1635
@yahoo.com.cn;∗通信作者 Authorforcorrespondence,E-mail:duanqimei1969@163.com
草 地 学 报 第20卷
的体细胞胚,然后将其包埋于一定营养成分和保护
功能的介质中,形成与天然种子相似的颗粒体。由
于人工种子属于无性繁殖,因而既具有发育上的全
能性和遗传上的稳定性,还克服了某些难以形成种
子的不育性植物在繁殖上的困难,更为重要的是人
工种子可以避免植物近亲繁殖造成结实率差的问
题。近30年来,人工种子技术已经被广泛用于果
树、谷类、药用植物、蔬菜、观赏植物、森林树种等许
多植物物种[2-6],成为现代种苗工程发展的新方向。
利用组织培养和细胞培养生产体细胞胚是目前
生产人工种子的主要途径,由于其不受季节条件的
限制,容易在实验室条件下获得大量的体细胞胚,缩
短了育种时间、节省了土地资源,而且,能方便贮藏
和运输,所以到目前为止,研究人员已经对25个科,
36个属的植物体细胞胚人工种子进行了研究[7]。
而对于转基因植物来说,由于转基因的程序复杂,同
时,得到转基因植物的种子也相对困难,因此利用体
细胞胚生产人工种子尤其重要。但是,目前还没有
有关转基因植物人工种子的报道。为此,本研究以
转基因苜蓿(Medicagosativa)体细胞胚为材料,对
转基因苜蓿人工种子的萌发及遗传变异进行研究,
以期建立用干化的体细胞胚作为保存转基因苜蓿种
质的模式,为生产优良或珍贵的转基因苜蓿种苗奠
定基础,也可以为其他植物转基因人工种子的研制
和种质提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 本试验选用加拿大广泛种植的
紫花苜蓿品种N4.4.2。
1.1.2 培养基 SH2K培养基:用于诱导愈伤组织。
主要成分:1mg·L-12,4-D,0.2mg·L-1Kinetin
生长调节剂,4.35g·L-1硫酸钾,288mg·L-1脯氨
酸,53mg·L-1硫代脯氨酸,200mg·L-1肌醇,30
g·L-1蔗糖,2.5g·L-1植物胶 (pH5.8)[8-9]。
BOi2Y培养基:用于诱导体细胞胚形成。主要成
分:0.2%酵母提取物,100mg·L-1肌醇,30g·L-1
蔗糖,2.5g·L-1植物胶(pH5.9)[10]。
MSO培养基:用于诱导体细胞胚的萌发。主要
成分:5.3g·L-1 MS盐,1mg·L-1氨基乙酸,40
g·L-1蔗糖,8g·L-1琼脂(pH5.8)[11]。
1/2MSO培养基:用于诱导植株的形成。主要
成分:2.65g·L-1MS盐,1mg·L-1氨基乙酸,20
g·L-1蔗糖,8g·L-1琼脂(pH5.8)[11]。
1.1.3 农杆菌和质粒 植物表达载体包括2个
35s启动子调控下的gus/nptⅡ融合基因。载体结
构(图1)用pBin19作为骨架,这种结构通过电转化
的方法导入农杆菌 GV3101株系,形成的农杆菌用
于苜蓿的转化。
图1 植物表达载体构建(载体包括在pBin19载体上的2个35s启动子调控下的gus-nptⅡ 融合基因)
Fig.1 Geneconstructforalfalfatransformation(Thegenecassettesaredownstreamofthekanamycinselectable
markergus/nptⅡgenefusionunderthecontrolofdouble35spromoterinpBin19vector)
1.2 试验方法
1.2.1 农杆菌感染苜蓿的转化 农杆菌GV3101
株被用于苜蓿的遗传转化试验。农杆菌株系含2个
35s启动子调控下的 gus/npt Ⅱ 融合基因的
pBIN19双相载体。在28℃,转速为180r·min-1
的摇床上,单克隆细菌在LB液体培养基中过夜生
长,培养基中包含150mg·L-1利福平、150mg·L-1卡
那霉素和100mg·L-1正大霉素,当OD600达到0.5
~1.0h,农杆菌用于侵染苜蓿叶柄外植体。
苜蓿转化程序如下:8mm 的叶柄外植体在
SH2K培养基中预培养2d。然后将外植体浸在农
杆菌悬浮液中4min,之后用无菌滤纸吸干外植体
表面残余的农杆菌菌液,转到含有20μM的乙酰丁
香酮的SH2K培养基中培养2d。预培养和乙酰丁
香酮用于提高转化效率[12]。随后,将外植体培养在
含有75mg·L-1卡那霉素筛选压的SH2K培养基
中,14d继代一次。随后,将抗卡那霉素的愈伤组
织转到含75mg·L-1卡那霉素的BOi2Y培养基
中。21d后体细胞胚形成,转移体细胞胚到具有75
mg·L-1卡那霉素筛选的胚萌发 MSO培养基中,
在 MSO培养基中体细胞胚长出幼芽并生根。最
后,生根萌芽的苜蓿幼苗转到1/2MSO胚成熟培养
基的 Magenta盒子中,60~90d后转化的苜蓿植株
形成。所用培养基都是在卡那霉素筛选下,所有组
4411
第6期 刘文婷等:干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究
织培养都维持在25℃,54~72μmol·m-2·s-1的
24h光照强度下。
1.2.2 体细胞胚的诱导 随机选择7个转基因苜
蓿株系种在光照培养室的 Magenta盒子里。通过
以上苜蓿转化的方法,在无抗生素筛选下诱导体细
胞胚,没有转化的苜蓿植株用于试验对照。45d后
大量的体细胞胚形成,来自不同转化苜蓿株系的子
叶期体细胞胚用于随后的干化处理和培养。
1.2.3 体细胞胚的干化处理 转化苜蓿植株子叶
期的体细胞胚置于含有10mM ABA的BOi2Y培
养基中培养14d,ABA处理后的子叶期体细胞胚经
过6种干燥剂(87%硫酸钾饱和溶液,87%碳酸钠饱
和溶液,75%氯化钠饱和溶液,63%硝酸铵饱和溶
液,50%四水硝酸钙饱和溶液,43%二水碳酸钾饱和
溶液)连续处理7d。通过ABA和一系列的干燥剂
处理后,干化的体细胞胚转到1/2MSO苜蓿萌发培
养基中,对照组(没有干化处理)的体细胞胚培养在
相同的1/2MSO苜蓿萌发培养基中。每个处理使
用90个胚,每30个胚为1个试验组,每组重复3
次,试验重复2次。
1.2.4 植株再生 10d后,干化的和没有干化的
体细胞胚萌发,形成了根和叶,将萌发的植株转到含
有1mg·L-1甘氨酸的1/2MSO培养基中,加入甘
氨酸是为了促进根的形成。选取具有良好根系的植
株,用水冲洗掉培养基,然后将这些植株移栽到含有
商业培养基和珍珠岩3∶1的盆中,覆盖聚乙烯塑料
膜,每7d喷洒一次水,以维持植株周围的相对湿
度。14d后,相对湿度逐渐减小,移栽35d后,将聚
乙烯塑料膜完全去除,苜蓿植株完全适应环境,植株
形成。用卷尺测定株高;用美国产的光电叶面积仪
(CL-203LASERAREAMETER)测定叶面积、叶宽、
叶长、叶周长。方法为:从每盆中选2株,每株选上、
中、下同一方向部位的叶片进行测定。
1.2.5 GUS组织定位 植株形成后,选取源自干
化的和没有干化的体细胞再生的植株叶片,进行
GUS组织定位分析,按照Jefferson 等[13]所述的
GUS基因表达的定性检测方法,如果植物器官是亮
蓝色的,表明植物器官中GUS稳定表达。
1.2.6 PCR和Southern杂交 PCR检测转化植
物按照Lodhi等[14]方法,使用50μL的反应体系,
包括100ngDNA,200μM的dNTP,前后引物分别
为1μM,1UTaqDNA 聚合酶,1.5mM MgCl2,3
μL10×TaqDNA聚合酶缓冲液。用于扩增GUS
基 因 的 引 物 为:gus 前 引 物:5′-CGTCCTG-
TAGAAACCCCAAC-3′;gus反向引物:5′-ATT-
GACCCACATTTGCCGT-3′,目的扩增片段长度是
300bp。PCR反应条件是:94℃变性5min,58℃复
性30s,72℃延伸45s,共35个循环,72℃延伸10
min。反应产物用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测。没
有转化的植株用于对照。
PCR检测转化植株,呈阳性植株的用作South-
ern杂交分析。从转化和没有转化的对照植株中分
别提取10μg的基因组 DNA,用EcoRⅠ酶酶切,
0.8% 琼脂糖凝胶分离,杂交于尼龙膜上,紫外交联
固定,nptⅡ为杂交DIG标记探针,杂交按照《分子
克隆实验指南》操作,并稍加改进。
1.2.7 培养条件 所用的培养基用0.25% 植物胶
固化,pH调至5.8,121℃灭菌0.5h。正常共培养
条件是:培养温度(25±1)℃,每天24h光照条件。
1.3 数据处理
采用Excel2003处理数据,SAS9.0软件One-
wayANOVA进行方差分析,显著水平为0.05。
2 结果与分析
2.1 苜蓿植株的转化和转化植株体细胞胚的诱导
具有gus/nptⅡ融合基因的载体通过电转化的
方法转到农杆菌株系 GV3101,再将 GV3101农杆
菌用于苜蓿叶柄外植体的转化。用PCR方法检测
转化情况 (图2)。从13个转化苜蓿株系中随机选
取7个,用于诱导植株的体细胞胚。将8mm长的
叶柄培养在SH2K 培养基中(SH 基础培养基包含
30g的蔗糖,1mg·L-12,4-D,0.2mg·L-1Ki-
netin),30d后愈伤组织形成。形成的愈伤组织转
到BOi2Y胚形成培养基中,14d后大量的体细胞胚
形成 (图3-A)。所有的诱导胚形成培养基无需抗
生素筛选压。
2.2 体细胞胚的干燥和萌发
体细胞胚中含有大量的水分。在ABA干化过
程中,体细胞胚逐渐缩水,含水量降低。胚的颜色从
绿色变为黄色(图3-B)。ABA和一系列的干燥剂
处理后,胚的相对含水量降低到12%~15% (图3-
C)。干化后的体细胞胚转到1/2MSO萌发培养基
中,干化的体细胞胚很快延伸生长,恢复为干化之前
的状态。在10d之内,干化的体细胞胚变成绿色,
并形成根系。36d后,干化的体细胞胚形成茎叶和
根系,植株恢复正常生长(图4-A)。
5411
草 地 学 报 第20卷
图2 PCR分析检测转化植株中的GUS扩增片段
Fig.2 PCRanalysisoftransformationalfalfausingthegusprimer
注:M:分子量标记;1~13:转化植株;14:没有转化的对照植株
Note:LaneM:MarkerDNA;lane1~13:Totransformedplants;lane14:control,anon-transformedplant
图3 转化植株体细胞胚的大量形成和体细胞胚的干化处理
Fig.3 Massofsomaticembryosdevelopedfromtransformedalfalfaplantletsanddesiccatedsomaticembryos
注:A:转化苜蓿植株大量的体细胞胚形成,B:ABA处理后的体细胞胚,C:ABA和一系列干燥剂处理后干化的体细胞胚
Note:A:massofsomaticembryosdevelopedfromtransformedplantlets,B:somaticembryosdesiccatedbyABA,
C:somaticembryosdesiccatedbyABAandaseriesofdesiccators
图4 ABA和干燥剂处理之后体细胞胚的萌发和再生植株的形成
Fig.4 GerminationandregenerationofsomaticembryosdesiccatedbyABAandaseriesofdesiccators
注:A:ABA和一系列的干燥剂处理后体细胞胚的萌发,B:干燥体细胞胚的再生植株,C:未干燥的体细胞胚的再生植株
Note:A:germinationofsomaticembryosdesiccatedbyABAandaseriesofdesiccators,
B:regenerationplantletsofdesiccatedsomaticembryos,C:regenerationplantletsofsomaticembryoswithoutdesiccation
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第6期 刘文婷等:干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究
在7个转化苜蓿株系中,干化和未干化处理的
胚萌发率不同。未干化处理的体细胞胚的萌发率为
81%,干化处理的胚萌发率为74% (图5),没有显
著差异。但是不用ABA处理而直接干化处理的体
细胞胚在萌发时,几乎所有的胚失去了活力。ABA
干化能保持体细胞胚的转化能力,10mM 的 ABA
处理可有效保持子叶期体细胞胚的活力。
图5 苜蓿转化株系干化和未干化处理的
体细胞胚的萌发率比较
Fig.5 Comparisonsofgerminationratebetweendesiccated
somaticembryosandoriginalsinduced
fromtransformedalfalfalines
2.3 转化植株的环境适应性
40d后,干化处理的体细胞胚再生的植株高度
达到6~8cm。用清水冲洗掉植株表面残留的培养
基,转植株到盆内,盆内含有3∶1的商业培养基和
珍珠岩,置于湿度为70%,温度30℃,16h/8h的光
暗条件下。移栽70~80d,植株生长旺盛。干化和
未干化处理的体细胞胚恢复的植株株高、叶长、叶
宽、叶周长和叶面积生长量没有显著差异(表1)。
2.4 转基因苜蓿的GUS分析
7个转基因株系再生成熟后,再生的植株用于
GUS检测和Southern杂交分析。组织化学定位检
测再生植株叶片中的GUS表达,没有转化的对照
组没有GUS表达(图6)。
2.5 转化植株的分子分析
在干化的和未干化处理的转化苜蓿体细胞胚再
生植株中,随机选取3个株系进行Southern杂交
分析。用标记的nptⅡ基因作为探针,3个株系均
呈现单一条带(图7)。结果表明,这些株系是独立
的,每个独立株系只有单一的一条带。未转化的植
株没有杂交信号。干化的和未干化的体细胞胚再生
植株整合位点一致,这表明转基因能在干化的体细
胞胚中遗传。
表1 干化和未干化处理的体细胞胚恢复植株的生长指标比较
Table1 Growthindicesofplantsregeneratedfromdesiccatedsomaticembryosandoriginals
生长指标
Items
株高/cm
Plantheight
叶长/cm
Leaflength
叶宽/cm
Leafwidth
叶周长/cm
Leafcircumference
叶面积/cm2
Leafarea
干化体细胞胚恢复的植株 19.88±1.01a 4.97±0.45b 3.0±0.24b 5.08±1.32a 0.79±0.44b
未干化体细胞胚恢复的植株 19.01±1.21a 5.10±0.67b 3.0±0.04b 5.10±0.98a 0.80±0.94b
图6 干化和未干化体细胞胚再生植株的GUS表达
Fig.6 GUShistochemicalanalysisinplantletrecoveredfromwithandwithoutdesiccationsomaticembryos
注:A:未干化体细胞胚恢复植株叶片,B:干化体细胞胚恢复植株叶片,C:对照植株叶片
Note:A:aleaffromregenerationplantletofsomaticembryoswithoutdesiccation;B:aleaffromregenerationplantlet
ofdesiccatedsomaticembryos;C:leavesfromnon-transformedplantlets
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草 地 学 报 第20卷
图7 3个独立转化株系的Southern杂交分析
Fig.7 Southernblotanalysisofthreeindependenttransformedlinesandnon-transformedcontrolplants
注:M:DNA分子量标记;1,2:来自株系1的干化和未干化体细胞胚恢复的植株;3,4:来自株系2的干化和未干化体细胞胚恢复的植株;
5,6:来自株系3的干化和未干化体细胞胚恢复的植株;7:未转化植株
Note:M:MarkerDNA;1,2:transformedplantsfromsomaticembryoswithandwithoutdesiccation(line1);
3,4:transformedplantsfromsomaticembryoswithandwithoutdesiccation(line2);
5,6:transformedplantsfromsomaticembryoswithandwithoutdesiccation(line3);
7:non-transformedplants(control)
3 讨论与结论
人工种子技术为种子繁殖系统提供了潜在的优
势。近年来,有关人工种子,人们研究最多的是以体
细胞胚为繁殖体制作的人工种子技术[6]。但是与合
子胚相比,体细胞胚没有种皮,所含的贮藏物较少,
不能休眠,因此体细胞胚的转化率较低,难以干燥
和保存。ABA是一种植物生长调节物质,也是一种
植物逆境激素,可以诱导蛋白质、多胺、脯氨酸和淀
粉等物质的增加,使体细胞胚在干化处理中受到保
护,提高了萌发率和植株转化能力。ABA干化处理
是引导体细胞胚进入静止状态以延长贮藏时间的最
有效方法[15]。
本试验参照Tian等[16]的方法,利用紫花苜蓿
叶柄为外植体进行农杆菌介导的遗传转化,获得了
13个转化株系,而后随机选取7个转化株系诱导体
细胞胚,对成熟阶段的子叶期体细胞胚进行 ABA
和一系列6种干燥剂干化处理,干化的转基因苜蓿
人工种子萌发再生为转基因植株。研究结果表明:
10mMABA处理体细胞胚后,体细胞胚逐渐缩水,
从绿色变为黄色。再经过一系列干燥剂的缓慢干燥
处理,体细胞胚的含水量降到了15%~12%;干化
处理后的体细胞胚萌发率为74%,与没有干化处理
的体细胞胚的萌发率81%,不存在显著差异。转基
因苜蓿体细胞胚能通过外源 ABA诱导抗旱,这和
白菜(Brassicarapapekinensis)、西兰花(Brassica
oleraceavar.botrytis)和油菜(Brassicacampes-
tris)的体细胞胚诱导的抗旱研究结果一致[17]。同
时,本研究发现不用ABA处理时,几乎所有的干化
体细胞胚失去活力,这证明了10mM 外源ABA 能
诱导干化人工种子萌发贮藏物质的产生。其次,植
株恢复后,在株高、叶长、叶宽、叶周长和叶面积上没
有显著差异,表明干化和未干化处理的体细胞胚恢
复的植株在形态上相似(图4-B,4-C)。
为了验证转基因苜蓿人工种子是否保持了母本
的优良性,运用Southern杂交技术对相同来源的苜
蓿人工种子的再生植株进行了遗传变异分析。对于
人工种子再生的植株,温室盆栽后,随机选取3个再
生株系,仍能检测到相同的整合位点。没有发生遗
传变异现象。研究已经发现,基因拷贝数对基因表
达水平有很大影响[18]。在许多物种中有一种趋势,
单拷贝数的基因比多拷贝数的基因表达更稳
定[19-20]。在本试验中,3个转基因株系有单一拷贝
数的基因整合,这也是栽培后能稳定表达的重要原
因之一。结果也表明转基因能在干化的人工种子中
稳定遗传,具有形成正常植株的能力,为干化的体细
胞胚用作种质提供理论依据。
总之,源自干化的体细胞胚再生的转基因植株
在形态相似于未干化的体细胞再生植株,更为重要
的是,转基因能够在干化的体细胞胚中稳定保持,干
化的转基因人工种子再生的植株能正确表达基因。
一般来说,转基因纯合体种子要经过多代繁育才能
获得,相比纯合体种子育种周期,这种方法节省了育
种时间;同时,体细胞胚能够在实验室条件下规模化
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第6期 刘文婷等:干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究
生产,既节省了土地资源,也提供了有效可行的转基
因种质保藏方法,有望用于其他植物种苗基因工程
研究。
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(责任编辑 李美娟)
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